全 文 ：中国生态农业学报 2011年 3月 第 19卷 第 2期
Chinese Journal of Eco-Agriculture, March 2011, 19(2): 388393


* 国家科技支撑计划项目(2007BAD07B06-3)资助
** 通讯作者: 郑国华(1965~), 男, 教授, 博士, 研究方向为果树生理及分子生物学。E-mail: fafuzgh@126.com
牛先前(1981~), 男, 硕士, 研究方向为果树生理及分子生物学。E-mail: nxq828@126.com
收稿日期: 2010-04-11 接受日期: 2010-08-27
DOI: 10.3724/SP.J.1011.2011.00388
冰核细菌对低温胁迫下枇杷幼果中果肉超微结构的影响*
牛先前 1 郑国华 2** 林秀香 1 王美盛 1 方树民 3
(1. 福建省热带作物科学研究所 漳州 363001; 2. 福建农林大学园艺学院 福州 350002;
3. 福建农林大学植物保护学院 福州 350002)
摘 要 以“早钟 6 号”枇杷幼果为试材, 采用人工降温的方法, 观察接种冰核细菌后, 果肉细胞超微结构在
冻害胁迫下的变化过程。结果显示: 冰核细菌不同程度地加重了冻害胁迫对枇杷果肉细胞壁、叶绿体和线粒
体的破坏程度; 冰核细菌对叶绿体的破坏最明显, 其次是细胞壁、线粒体; 冰核细菌使叶绿体在1 ℃发生胞
内结冰导致细胞冻害, 而未感染冰核细菌的叶绿体则发生胞间结冰, 冻害类型不同; 与1 ℃低温相比, 3 ℃
低温条件下冰核细菌的破坏作用更强。表明冰核细菌的存在加重了低温对细胞的伤害。
关键词 冰核细菌 枇杷幼果 果肉细胞 超微结构 冻害
中图分类号: S667.3 文献标识码: A 文章编号: 1671-3990(2011)02-0388-06
Effect of INA bacteria on pulp cell ultrastructure of young loquat fruit
NIU Xian-Qian1, ZHENG Guo-Hua2, LIN Xiu-Xiang1, WANG Mei-Sheng1, FANG Shu-Min3
(1. Fujian Institute of Tropical Crops, Zhangzhou 363001, China; 2. College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry Univer-
sity, Fuzhou 350002, China; 3. College of Plant Protection, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)
Abstract The effects of INA bacteria inoculation on “Zaozhong No. 6” pulp cell ultrastructure under freeze stress in young loquat
fruits were studied with simulated low temperature. Results showed that INA bacteria aggravated damage to young fruit pulp cell
wall, chloroplast and mitochondrial of loquat. INA bacteria inoculation damaged chloroplasts the most, followed by cell walls, mito-
chondria. INA bacteria inoculation caused chloroplast cell damage via intracellular freezing at 1 ℃. Different degrees of intercellu-
lar freezing also occurred in fruits without INA bacteria inoculation. INA bacteria inoculation damage was stronger at 3 ℃ than at
1 ℃. It therefore indicated that INA bacteria inoculation increased frost damage under low temperature conditions.
Key words INA bacteria, Young loquat fruit, Pulp cell, Ultrastructure, Freeze stress
(Received April 11, 2010; accepted Aug. 27, 2010)
霜冻是一种严重的自然危害, 在短短几个小时
内就可毁坏大面积农作物, 给农业生产造成严重损
失。在福建省, 枇杷(Eriobotrya japonica L.)开花座
果期一般在 11 月至翌年 1 月, 花果易受冻害, 给果
农带来巨大经济损失[1]。枇杷冻害问题已成为影响
和限制枇杷生产和发展的重要因素。自冰核细菌(Ice
nucleation active bacteria, 简称 INA 细菌)发现以来
人们对霜冻的实质有了新的认识, 即植物遭遇霜冻
危害的轻重程度是由低温强度大小、植物抗霜能力
强弱和植物体上 INA细菌数量多少这3个因素决定[2]。
这一理论为解决冻害问题提供了一条新途径。
细胞是生物体最基本的结构和功能单位。在探
索生命现象本质的过程中, 研究细胞及其超微结构
和功能是一个重要内容[3]。目前, 低温胁迫下枇杷叶
片和果实超微结构的冻害机理已有报道[4]。而有关
INA 细菌在电镜方面的研究报道较少[5], 尤其在低
温胁迫下 INA细菌对枇杷幼果超微结构的影响尚少
见报道。电镜技术的快速发展为研究细胞超微结构
变化、直观形象地揭示 INA细菌诱发枇杷幼果冻害
机制提供了现实可操作性。
为进一步了解 INA细菌加重枇杷幼果冻害的作
用机理, 本研究采用透射电镜技术, 观察冻害过程
第 2期 牛先前等: 冰核细菌对低温胁迫下枇杷幼果中果肉超微结构的影响 389


中细胞超微结构的变化, 探明 INA 细菌诱导冻害过
程中枇杷幼果各细胞器的破坏特征, 旨在从细胞水
平上分析 INA 细菌与枇杷冻害的关系, 为采取预防
措施抵制或杀死 INA细菌以减轻或控制枇杷冻害提
供理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
INA 细菌分离自福建省莆田市兴泰果场枇杷花
瓣 , 经鉴定为凤梨欧文氏菌(Erwinia.ananas), 冰核
活性强度中等[6], 采用 KB固体培养基培养。供试枇
杷品种为“早钟 6 号”, 选取生长健壮、长势一致
的 4 年生矮化嫁接苗。在试验过程中只保持必要的
浇水。
1.2 研究方法
1.2.1 INA细菌接种 于 2007年 12月枇杷盛花后
10 d 的上午进行, 设置接种和对照两个处理。接种
处理(INA): 雾状喷施浓度为 108 cfu·mL1 的 INA
菌液, 至植株滴水; 对照(CK): 先用 0.5 g·L1的链
霉素液连续喷杀 3 次, 杀死自然存在的 INA 细菌,
再喷无菌水, 至植株滴水。每周处理 1 次(遇降雨向
后延迟), 连续处理 3次。之后, 用 Lindow小液滴冻
结法[7]测定枇杷叶片 INA 细菌密度和活性, 结果显
示: 枇杷叶片 INA细菌密度高于 106 cfu·g1(FW), 活
性达 80%, CK的 INA细菌密度低于 102 cfu·g1(FW),
活性为 10%。
1.2.2 低温处理 参考王慧等 [6]和谢钟琛等 [8]的试
验设计, 设置1 ℃和3 ℃两个处理温度。2008年 3
月将接种 INA细菌和未接种 INA细菌的枇杷植株放
入已改装的可控温冰柜中[9], 分别在1 ℃处理 0 h、
3 h、6 h、9 h、12 h, 在3 ℃处理 0 h、2 h、4 h。选
取着生部位一致、胸径 1.2±0.2 cm 的枇杷幼果, 根
据超薄切片制作要求做好前期处理, 备用, 并剖开
果实观察种子褐变程度进行统计分析。
1.2.3 超薄切片的制备 参照郑国华等 [4]的方法 ,
从果腰部切取距离果皮 1.0 mm、大小为 0.5 mm×
1 mm的果肉组织块, 立即投入用 0.1 mol·L1磷酸
钠盐缓冲液(PB, pH7.2)配制的 3%戊二醛中并抽气
使组织块完全下沉 , 于常温固定 2 h, 4 ℃下固定
3 h。之后用 0.1 mol·L1 PB充分洗涤 60 min(中间
换液 4 次 ), 以洗去多余固定液。再加入适量用
0.1 mol·L1 PB配制的 1%锇酸于 4 ℃下固定 3 h。
用 PB漂洗 30 min(中间换液 1次), 再用重蒸水漂洗
30 min(中间换液 1次)。常规系列乙醇脱水, 丙酮过
渡, 环氧树脂 Epon 812渗透并包埋。于 37 ℃、45 ℃
和 60 ℃下分别聚合 12 h、12 h和 24 h。然后在 LKB
8800型超薄切片机上制备 50 nm超薄切片(制备过程
委托福建医科大学附属第一医院电镜实验室进行)。
在 JEM 1010型透射电镜下观察并拍照。
2 结果与分析
2.1 低温胁迫下 INA细菌对幼果冻害情况的统计
根据果实种子褐变程度(以种子褐变达到 2 级[6]
视为幼果发生冻害)统计幼果冻害情况(表 1)。1 ℃
和3 ℃低温下, INA 细菌的存在不同程度促进了幼
果冻害的发生, 且在1 ℃下处理 15 h 和在3 ℃下
处理 9 h 以上枇杷幼果种胚出现完全褐变, 表明此
时幼果受冻严重。
2.2 低温胁迫下 INA细菌对果肉细胞壁的影响
由图 1 可知, 常温下, 感染 INA 细菌的果肉细
胞壁与未接种对照相比无明显差异。细胞壁表面平
滑, 内部纤维结构紧密, 胞间层、初生壁以及次生壁
无明显分界(图 A1、B1)。
1 ℃低温下, 感染 INA细菌的果肉细胞壁比对
照破坏严重(图 C1~D4)。处理 3 h时, 细胞壁纤维结
构平滑度降低, 开始松散, 细胞壁内侧边缘出现褶
皱(图D1); 处理6 h时, 细胞壁内侧边缘模糊程度明显
高于对照且纤维结构松散加重(图 D2、C2); 处理 9 h
时, 细胞壁内缘破损且纤维结构膨胀松散出现空隙(图
D3), 而对照未出现空隙(图 C3); 处理 12 h时, 细胞壁
絮状化且出现空洞(图 D4), 而对照没有空洞(图 C4)。
3 ℃低温下, 感染 INA 细菌的果肉细胞壁明
显比对照破坏严重(图 A1~B3)。处理 2 h时, 细胞壁两
侧边缘模糊, 纤维结构松散紊乱膨胀增大且出现较大
空隙(图 B2), 而对照细胞壁两侧褶皱明显但依然清晰
(图A2); 处理4 h时, 细胞壁内部几乎完全絮状(图B3),
而对照细胞壁内部结构絮状程度较轻(图 A3)。
从1 ℃和3 ℃两组电镜图片可以看到枇杷细胞
壁发生冻害的整个变化过程。首先, 内侧细胞壁发
生褶皱(图 C1、D1); 然后, 细胞壁边缘纤维结构受

表 1 低温胁迫下接种 INA细菌枇杷幼果的冻害情况
Tab. 1 Frost injury index of young loquat fruits treated with INA bacteria under low temperature
种胚褐变率 Embryo browning ratio of loquat fruit (%)
1 ℃ 3 ℃ 处理
Treatment
0 h 3 h 6 h 9 h 12 h 15 h 18 h 0 h 2 h 4 h 6 h 8 h 10 h 12 h
CK 0 0.13 5.67 20.63 85.36 100.00 100.00 0 43.56 80.65 100.00 100.00 100.00 100.00
INA 0 0.24 16.35 53.68 97.28 100.00 100.00 0 64.23 95.16 100.00 100.00 100.00 100.00
390 中国生态农业学报 2011 第 19卷




图 1 冻害过程中枇杷幼果果肉细胞壁超微结构的变化(×25 000)
Fig. 1 Ultrastructural changes of pulp cell wall of young loquat fruit during freeze injury (×25 000)
A1~A3: 3 ℃低温胁迫下 CK处理 0 h、2 h、4 h果肉细胞壁的超微结构; B1~B3: 3 ℃低温胁迫下 INA处理 0 h、2 h、4 h果肉细胞壁的
超微结构; C1~C4: 1 ℃低温胁迫下 CK处理 3 h、6 h、9 h、12 h果肉细胞壁的超微结构; D1~D4: 1 ℃低温胁迫下 INA处理 3 h、6 h、9 h、
12 h果肉细胞壁的超微结构。CW: 细胞壁; IS: 胞间隙。箭头指变化明显部位, 下同。A1~A3: Ultrastructure of pulp cell wall of young loquat fruit
of CK at 0 h, 2 h and 4 h respectively after 3 ℃ freeze stress; B1~B3: Ultrastructure of pulp cell wall of young loquat fruit inoculated INA bacteria
at 0 h, 2 h and 4 h respectively after 3 ℃ freeze stress; C1~C4: Ultrastructure of pulp cell wall of young loquat fruit of CK at 3 h, 6 h, 9 h and 12 h
respectively after 1 ℃ freeze stress; D1~D4: Ultrastructure of pulp cell wall of young loquat fruit inoculated INA bacteria at 3 h, 6 h, 9 h and 12 h
respectively after 1 ℃ freeze stress. CW: Cell wall; IS: Intercellular space. Arrowhead shows the visible changes, the same below.

损出现模糊(图 C2、D2); 之后, 整个细胞壁纤维结
构膨胀(图 C3), 并出现空隙(图 A2、B2、D3); 细胞
壁纤维结构絮状化(图 A3、C4); 最终, 细胞壁纤维
结构出现断裂(图 D4), 细胞壁解体(图 B3)。
2.3 低温胁迫下 INA细菌对果肉叶绿体的影响
由图 2 可知, 常温下, 感染 INA 细菌的果肉叶
绿体与对照无明显差别。叶绿体呈长椭圆形, 外膜
完整清晰, 基粒片层和基质片层叠垛整齐, 基质片
层与基粒片层紧密相连, 整个叶绿体内部呈现完整
的膜系统内部结构(图 E1、F1)。
1 ℃低温下, 感染 INA细菌的果肉叶绿体比对
照破坏严重。处理 3 h时, 叶绿体体积膨大变圆, 膜
表面凹凸, 双层膜消失, 基粒膨大松散(图 H1), 对
照体积变大但膜完好(图 G1); 处理 6 h时, 外膜破裂,
基粒降解, 内部紊乱呈畸形(图 H2), 而对照外膜轻
度破损且内部出现大囊泡(图G2); 处理 9 h时, 叶绿
第 2期 牛先前等: 冰核细菌对低温胁迫下枇杷幼果中果肉超微结构的影响 391




图 2 冻害过程中枇杷幼果果肉细胞叶绿体超微结构的变化(×30 000)
Fig. 2 Ultrastructural changes of pulp cell chloroplast of young loquat fruit during freeze injury (×30 000)
E1~E3: 3 ℃低温胁迫下 CK处理 0 h, 2 h, 4 h果肉叶绿体的超微结构; F1~F3: 3 ℃低温胁迫下 INA处理 0 h、2 h、4 h果肉叶绿体的超
微结构; G1~G4: 1 ℃低温胁迫下 CK处理 3 h、6 h、9 h、12 h果肉叶绿体的超微结构; H1~H4: 1 ℃低温胁迫下 INA处理 3 h、6 h、9 h、12 h
果肉叶绿体的超微结构。Ch: 叶绿体; G: 基粒。E1~E3: Ultrastructure of pulp cell chloroplast of young loquat fruit of CK at 0 h, 2 h and 4 h
respectively after 3 ℃ freeze stress; F1~F3: Ultrastructure of pulp cell chloroplast of young loquat fruit inoculated INA bacteria at 0 h, 2 h and 4 h
respectively after 3 ℃ freeze stress; G1~G4: Ultrastructure of pulp cell chloroplast of young loquat fruit of CK at 3 h, 6 h, 9 h and 12 h respectively
after 1 ℃ freeze stress; H1~H4: Ultrastructure of pulp cell chloroplast of young loquat fruit inoculated INA bacteria at 3 h, 6 h, 9 h and 12 h respec-
tively after 1 ℃ freeze stress. Ch: Chloroplast; G: Granum.

体的外膜完全破裂, 基粒外泻(图 H3), 对照叶绿体
继续膨胀似要爆开(图 G3); 处理 12 h时, 叶绿体完
全解体(图 H4), 对照开始降解(图 G4)。
3 ℃低温下, 感染 INA 细菌的果肉叶绿体明
显比对照破坏严重。处理 2 h 时, 叶绿体形状肿大,
外膜破裂双层膜消失, 内部结构紊乱基粒出现降解
(图 F2), 对照体积变大但外膜完整, 基粒片层清晰
(图 E2); 处理 4 h时, 叶绿体完全解体(图 F3), 而对
照叶绿体膜出现多个囊泡, 内部结构紊乱, 基粒片
层降解严重难以识别(图 E3)。
2.4 低温胁迫下 INA细菌对线粒体的影响
由图 3 可知, 常温下, 感染 INA 细菌的果肉
线粒体与对照相比无明显差异。线粒体呈椭圆形,
双层膜清晰内部结构完整, 内脊清楚(图 I1、J1)。
1 ℃低温下, 感染 INA 细菌的果肉线粒体比
对照破坏严重。处理 3 h时, 线粒体内脊数目较对照
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图 3 冻害过程中枇杷幼果果肉细胞线粒体超微结构的变化(×50 000)
Fig. 3 Ultrastructural changes of pulp cell mitochondria of young loquat fruit during freeze injury (×50 000)
I1~I3: 3 ℃低温胁迫下 CK处理 0 h、2 h、4 h果肉细胞线粒体的超微结构; J1~J3: 3 ℃低温胁迫下 INA处理 0 h、2 h、4 h果肉细胞线
粒体的超微结构; K1~K4: 1 ℃低温胁迫下 CK处理 3 h、6 h、9 h、12 h果肉细胞线粒体的超微结构; L1~L4: 1 ℃低温胁迫下 INA处理 3 h、
6 h、9 h、12 h 果肉细胞线粒体的超微结构。M: 线粒体。I1~I3: Ultrastructure of pulp cell mitochondria of young loquat fruit of CK at 0 h, 2 h and
4 h respectively after 3 ℃ freeze stress; J1~J3: Ultrastructure of pulp cell mitochondria of young loquat fruit inoculated INA bacteria at 0 h, 2 h and
4 h respectively after 3 ℃ freeze stress; K1~K4: Ultrastructure of pulp cell mitochondria of young loquat fruit of CK at 3 h, 6 h, 9 h and 12 h re-
spectively after 1 ℃ freeze stress; L1~L4: Ultrastructure of pulp cell mitochondria of young loquat fruit inoculated INA bacteria at 3 h, 6 h, 9 h and
12 h respectively after 1 ℃ freeze stress. M: Mitochondria.

增多(图 L1、K1); 处理 6 h时, 线粒体内脊数目较对
照减少(图 L2、K2); 处理 9 h时, 果肉线粒体双层膜
消失, 内脊数目减少且出现降解(图 L3), 对照线粒
体双层膜内部结构依然存在, 内基模糊(图 K3); 处
理 12 h 时, 线粒体膜内部出现空洞, 解体严重较难
识别(图 L4), 对照双层膜完整但内脊腔扩大并出现
空泡化(图 K4)。
3 ℃低温下, 感染 INA细菌的果肉线粒体明
显比对照破坏严重。处理 2 h时, 线粒体畸形, 双
层膜部分降解, 内脊少但结构清晰(图 J2), 对照
双层膜较清晰(图 I2); 处理 4 h时, 线粒体膜几乎
消失, 内部降解严重(图 J3), 对照线粒体膜破损
但轮廓还可分辨(图 I3)。
3 讨论
在3 ℃和1 ℃低温胁迫下, 感染 INA 细菌的
枇杷幼果果肉细胞壁、叶绿体和线粒体的受害程度
均明显高于未感染处理, 并且低温对叶绿体的破坏
第 2期 牛先前等: 冰核细菌对低温胁迫下枇杷幼果中果肉超微结构的影响 393


程度明显强于细胞壁和线粒体。枇杷幼果在3 ℃即
可能受害[10], 原因是此温度胁迫导致枇杷幼果果肉
细胞内结冰, 而胞内结冰对细胞的伤害是致命的。
未感染 INA 细菌的枇杷幼果果肉细胞可以忍受 2 h
的3 ℃胁迫 , 此时线粒体内部结构完整功能尚存 ;
4 h 后, 枇杷果肉线粒体膜被破坏, 细胞死亡。感染
INA 细菌的枇杷幼果线粒体膜破坏更加严重, 说明
冰核细菌加重了低温对细胞的破坏程度。
在1 ℃处理时, 未感染 INA 细菌的果肉叶绿体
在冻害过程中出现大囊泡, 而感染 INA细菌和3 ℃
处理的叶绿体未出现大囊泡。可见, 1 ℃低温下感
染 INA 细菌和3 ℃低温处理叶绿体产生的冻害与
1 ℃低温下未感染 INA 细菌的叶绿体所产生的冻
害是两种不同的冻害类型, 即1 ℃下感染 INA细菌
处理和3 ℃下的叶绿体发生的是胞内结冰 , 而
1 ℃低温下未感染 INA 细菌的叶绿体发生的是胞
间结冰。其原因是, 通常发生冻害是因为细胞外的
溶液(即细胞间隙以及原生质体和细胞壁之间的液
体)比细胞内液体的冰点温度高, 因此冰核首先在细
胞外形成[11]。胞间形成的冰晶大大降低了细胞外溶
液的水势, 并形成较低的蒸汽压, 致使细胞内的水
不断流到细胞外。其结果为: 细胞间因吸水, 导致体
积膨胀; 细胞内因缺水造成收缩。这也是细胞壁外
侧表现光滑, 而内侧出现褶皱的原因。细胞内脱水
引起原生质收缩而产生内拉外张的应力, 而叶绿体
内水势低于细胞溶液水势造成吸水, 在双重力的作
用下 , 叶绿体吸水膨大 , 但随细胞间冰晶的增多 ,
这种外拉作用力逐渐增强, 最终导致叶绿体破裂。
而3 ℃低温导致叶绿体内的水直接结冰, 冰晶对类
囊体造成直接破坏, 叶绿体不出现大囊泡。感染 INA
细菌的枇杷叶绿体在1 ℃处理时未出现大囊泡 ,
可见发生的冻害类型应该是胞内结冰。但在整个冻
害过程中线粒体没有出现类似叶绿体的大囊泡, 原
因可能与线粒体对低温不敏感或者线粒体与叶绿体
结构上的差异有关。
在冻害发生过程中 , 可以清晰地观察到叶绿体
双层膜的破坏是外膜先消失, 内膜再涨破, 但是线
粒体双层膜破坏, 是外膜首先遭受破坏还是内膜先
破坏, 还是双层膜同时受害, 本试验尚缺乏有力证
据来说明。
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