全 文 ：中国生态农业学报 2009年 11月 第 17卷 第 6期
Chinese Journal of Eco-Agriculture, Nov. 2009, 17(6): 1162−1167


* 福建省生态学重点学科项目(0608537)资助
** 通讯作者: 林文雄(1957~), 男, 教授, 博士生导师, 主要研究方向为植物生理与分子生态学。E-mail: wenxiong181@163.com
黄锦文(1967~), 女, 副教授, 博士, 主要从事作物生理生态及分子生态学研究。E-mail:huangjw1126@sohu.com
收稿日期: 2009-03-27 接受日期: 2009-05-08
DOI: 10. 3724/SP.J.1011.2009.01162
低温胁迫下高羊茅抑制消减文库的构建与分析*
黄锦文 骆 娟 陈冬梅 郑红艳 林文雄**
(福建农林大学农业生态研究所 福州 350002)
摘 要 采用抑制消减杂交(SSH)技术构建了高羊茅“猎狗 5 号”低温下的正向差减 cDNA 文库, 并从基因表
达水平研究了低温诱导对高羊茅抗寒性的影响。通过 Reverse northern 杂交法筛选, 挑选出 36 个低温处理下差
异表达基因, 并对这些基因进行测序。将测序结果在基因组数据库(NCBI)中进行检索比对, 最后获得 34 个差
异表达的基因, 其中 33 个基因功能已知, 主要与植物信号转导、光合作用、糖代谢、物质运输以及抗逆性相关。
关键词 高羊茅 低温处理 抑制消减杂交 基因表达 抗寒性
中图分类号: S688.4 文献标识码: A 文章编号: 1671-3990(2009)06-1162-06
Construction and analysis of suppression subtractive library of
Festuca arundinacea to low temperature stress
HUANG Jin-Wen, LUO Juan, CHEN Dong-Mei, ZHENG Hong-Yan, LIN Wen-Xiong
(Institute of Agroecology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)
Abstract A forward subtractive cDNA library was constructed from tall fescue “Houndog 5” cultivar exposed to low temperature
stress via suppression subtractive hybridization (SSH). Then cold-resistance of tall fescue (induced by low temperaturing) was de-
termined through genes expression analysis. A total of 36 ESTs from SSH-cDNA library were selected and sequenced after reverse
northern hybridization screening. The sequencing results were analyzed by means of retrieval and alignment in unigene GeneBank
database. Based on the analysis, 34 genes exhibited different expressions, of which the functions of 33 genes were known and identi-
fied. These functionally known genes were detected in signal transduction, photosynthesis, sugar metabolism, material transportation
and stress resistance.
Key words Festuca arundinacea, Low temperature treatment, Suppression subtractive hybridization (SSH), Gene expression,
Cold resistance
(Received March 27, 2009; accepted May 8, 2009)
高羊茅(Festuca arundinacea)是重要的冷季型草
坪草, 具有耐低温的特征, 其耐寒性品种的选育备
受人们关注。因此, 开展高羊茅耐寒性机制的研究
具有重要意义。目前, 对高羊茅低温胁迫的生理响
应、特定抗寒基因的分离与鉴定以及耐寒突变体的
诱发与鉴定等方面研究取得了一定进展 [1−3], 但其
更深层次的分子机制还未曾涉及。20 世纪 90 年代
以来, 植物的耐低温研究已进入分子水平, 至今已
建立了低温诱导的大麦、小麦、水稻、苜蓿和拟南
芥等几十种植物的 cDNA 文库, 并从中分离出上百
种低温诱导基因[4−7]。本试验以抗寒性较强的高羊茅品
种“猎狗 5号”为材料, 利用抑制消减杂交(Suppression
subtractive hybridization, SSH)技术研究高羊茅在低
温胁迫下转录水平上的基因表达差异 ,揭示高羊茅
叶片中低温诱导上调表达的基因对植物体生命活动
的分子调节机制, 为研制抗寒 cDNA 表达谱芯片、
克隆抗寒候选基因提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料与处理
2007年 9月 15日在福建农林大学试验基地播
种高羊茅“猎狗 5 号”。11 月 20 日从试验田草坪
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场选取一株生长健壮、已经分蘖成丛的高羊茅植株
(选取低温环境下表现优良的植株)并挖起, 分成 4株
移栽到土壤基质完全相同的 4 个花盆中, 将其放在
20~25 ℃室温下恢复生长 1 个月后, 其中 3 盆进行
5 ℃低温和 16 h/8 h(光/暗)处理, 分别处理 6 h、
12 h、24 h后取样用做 SSH研究, 另一盆 20 ℃室温
下生长的植株作为对照。
1.2 试验方法
1.2.1 总 RNA提取
利用 Trizol 试剂分别提取“猎狗 5 号”对照植
株及低温胁迫 6 h、12 h、24 h后植株叶片的总 RNA,
用 DNaseⅠ降解基因组 DNA, 以去除 DNA 的干扰,
并用紫外可见光分度计检测所得 RNA 样品的浓度
和纯度, 再用 1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测各样品的
完整性。等量混合低温条件下生长 6 h、12 h、24 h
的高羊茅叶片总 RNA 作为处理组(Tester), 室温下
生长的植株叶片的总 RNA作为对照组(Driver)。
1.2.2 抑制消减杂交
各取处理组总 RNA、对照组总 RNA约 1 μg, 加
入引物(Primer)1 和引物 2[引物 1: 5′-AAGCAGTGG
TATCAACGCAGAGTAC(T)30NM-3′, (M=A, C, G, or
T; N=A, G, or C); 引物 2: 5′-AAGCAGTGGTATCAA
CGCAGAGTACGCGGG-3′]合成 cDNA 第一链, 接
着完成双链 cDNA 的合成, 之后进行 PCR 扩增、
纯化, PCR 具体参数为: 90 ℃ 1 min, 95 ℃ 15 s,
65 ℃ 30 s, 68 ℃ 6 min, 23个循环。
1.2.3 抑制消减文库的构建
将第 2 次 PCR 产物纯化后的目的片段连接到
Pmd18-T Vector(TaKaRa 公司)上, 连接好的产物转
化到大肠杆菌 DH5α 感受态细胞中, 涂在 150 mm
LB(含氨苄、IPTG和 X-Gal)琼脂培养板上, 37 ℃培
养过夜, 挑取明显的白色菌落进行扩增培养, −70
℃保存备用。
1.2.4 消减文库插入片段的酶切检测
以嵌套引物 1 和嵌套引物 2R 为引物(嵌套引物
1: 5′-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3′; 嵌套引
物 2R: 5′-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3′), 对消
减文库的克隆进行菌液 PCR扩增, 1%琼脂糖凝胶电
泳检测插入片段的大小。用灭过菌的枪头部分挑取
白色菌落于 5 mL含有氨苄青霉素 LB液体培养基中,
37 ℃振荡培养过夜。采用 SDS碱裂解法提取质粒。
取提取后的质粒 5 μL与 12 μL的 dd H2O、2 μL的
10×Buffer H 以及 0.5 μL的 EcoR I和 0.5 μL的 Pst I
混匀后, 37 ℃反应 4 h, 于 1%的琼脂糖凝胶电泳检
测酶切结果。
1.2.5 筛选阳性克隆
为进一步筛选阳性克隆, 挑取经菌液 PCR 鉴定
的片段大小在 300 bp 以上的克隆, 用反向 Northern
狭缝杂交的方法筛选阳性克隆。经菌液 PCR, 分别
以对照组 cDNA和处理组 cDNA为探针进行杂交。
1.2.6 克隆子的测序
选取与正向探针杂交有信号, 而与反向探针杂
交无信号, 或者正向信号强于反向信号的克隆子测
序。序列由上海生工生物工程技术服务有限公司测定。
1.3 比对方法
基因差异表达 EST 生物信息学分析进入 NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), 选择 blastn
或 blastx, 提交去除载体序列和两端接头序列的EST
序列并选择适当的参数, 进行在线DNA序列同源性
比较。
2 结果与分析
2.1 RNA的含量和质量
利用 Trizol试剂分别提取对照及低温胁迫 6 h、
12 h、24 h叶片的总 RNA, 样品经紫外分光光度计
检测, 结果表明: 各样品的OD260/OD280均在 1.9~2.0
范围内, 纯度较高。总 RNA用电泳检测, 结果表明:
28S rRNA和 18S rRNA条带清晰可见, 且 28S rRNA
含量大于 18S rRNA(图 1), 说明处理组和对照组的
RNA均保持完整性, 可满足试验要求。
2.2 双链 cDNA的合成
利用 SMART cDNA PCR方法合成双链 cDNA,
首先对 PCR 循环参数进行优化, 从图 2 可以看出,
处理组和对照组在 24个循环达到反应平台期, 而 21
个循环的量均具有较好的扩增潜力, 因此选择 21个


图 1 总 RNA电泳检测结果
Fig. 1 Total RNA of tester and driver
泳道 1: 处理组; 泳道 2: 对照组。
Lane 1: Tester; Lane 2: Driver.
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图 2 PCR循环参数的优化
Fig. 2 Analysis for optimizing PCR parameters
M: DNA分子量标准; T: 处理组; D: 对照组。
M: marker; T: tester; D: driver.

循环的 PCR产物进行消减杂交。
2.3 双链 cDNA的 RsaⅠ酶切分析
本试验中合成的 dscDNA电泳结果为 0.5~10 kb
范围的彗尾状条带, 选用试剂盒自带的、能识别 4
个碱基(5′GTAC3′)并产生平末端的内切酶 RsaⅠ对
杂交前的 cDNA分子进行酶切。酶切后的 cDNA在
琼脂糖凝胶上迁移速率比酶切前的 cDNA 大, 酶切
后的 dscDNA分布在 0.1~2 kb, 说明酶切比较充分。
2.4 接头连接效率检测
接头的连接效率是决定抑制消减杂交成败的关
键步骤之一。分别以处理组 1-1(与接头 1连接)和处
理组 1-2(与接头 2R 连接)cDNA 为模板, 以引物 1
和管家基因 G3PDH 的两端为引物(G3PDH3′引物和
G3PDH5′引物)进行 PCR扩增, 琼脂糖凝胶电泳显示
有特异条带(图 3), 表明 ds cDNA已经连上接头, 可
以进行消减杂交。
2.5 消减产物 2次 PCR的结果
经过 2 次杂交和 2 次 PCR, 一些差异表达的基
因得到了富集, 经过 2 次 PCR 的扩增, 差减库中的
片段大约在 100~800 bp之间且主要集中在 400 bp左
右, 同时也可以看出消减之后的片段较未消减片段
淡且范围变小, 说明消减产物 2 次选择性 PCR扩增
运行正常, 也反映了接头连接效率高。
2.6 差异表达基因的 T载体克隆
经过两次选择性 PCR富集的消减产物纯化后与
T载体连接后转化, 经蓝白斑筛选, 共获得 1 078个
上调表达的克隆, 采用菌液 PCR 方法对每个克隆进
行鉴定, 确认是否有片段插入, 并观察插入片段的
大 小 。 同 时 对 部 分 克 隆 的 质 粒 DNA 进 行
EcoR /BamHⅠ Ⅰ双酶切 , 结果与菌液 PCR 基本一
致。结果表明: 文库的插入片段大小介于 100~800 bp
之间, 为有效重组。
2.7 对差异表达基因的进一步筛选
通过狭缝杂交, 对所构建的差减文库的部分克
隆分别与处理组 cDNA和对照组 cDNA分别进行正
向筛选和反向筛选, 挑选正向杂交信号强于反向杂
交信号的克隆(图 4), 即为差异表达的克隆。


图 3 接头连接效率检测
Fig. 3 The results of the ligation efficiency analysis
M: DNA 分子量标准; 1、2: 以 tester1-1 作模板 PCR 的产物;
3、4: 以 Tester1-2作模板 PCR的产物; 1、3: 以 G3PDH3′为上游引
物和 primer1为下游引物 PCR的产物; 2、4: 以 G3PDH3′为上游引物
和 G3PDH5′为下游引物 PCR 的产物。M: DNA marker; 1, 2: PCR
products using tester1-1 as the template; 3, 4: PCR products using
tester1-2 as the template; 1, 3: PCR products using G3PDH3′ as forward
primer and primer 1 as reverse primer; 2, 4: PCR products using
G3PDH3′ as forward primer and G3PDH5′ as reverse primers; 2, 4:
PCR products using G3PDH3′ as forward primer and G3PDH5′ as
reverse primers.


A B
图 4 反向 Northern杂交筛选文库部分克隆
Fig. 4 Screening of positive clones by reverse northern blot
A: 正向杂交; B: 反向杂交; 箭头指示阳性克隆。A: Forward
hybridization; B: Reverse hybridization; Arrows show positive clones.

2.8 分离得到的部分差异基因的测序与序列分析
挑取 36 个克隆测序获得的 34 条原始序列去除
由 SSH 引入的接头引物序列后与基因组数据库
(NCBI)进行比对。序列分析及同源序列的查询结果
见表 1。
统计 blast的分析结果, 34条 EST序列中, 片段
最短的为 150 bp, 最长的为 777 bp, 平均每个 EST
长度为 411 bp, 共获得 34个差异表达的基因, 其中
1个基因功能未知。对这些基因进行分析, 按其功能
进行分类, 结果表明, 这些已知功能的基因参与植
物信号转导、光合作用、糖类代谢、物质运输以及
抗逆性反应等。
第 6期 黄锦文等: 低温胁迫下高羊茅抑制消减文库的构建与分析 1165


表 1 cDNA差异片段与基因组数据库中序列的同源性比对
Tab. 1 Comparison of sequence similarity display for cDNA differential fragments with the sequences from genomic library
克隆编号
No. of
clone
长度
Length
(bp)
同源基因
Homologous genes
E值
E value
同源性
Sequence
identity (%)
信号转导相关 Signal transduction related
116 320 Two-component sensor histidine kinase (Streptococcus suis) 6.0 85
692 777 Transcription factor bZIP60 mRNA (Glycine max) 2e-08 93
712 256 RNA polymerase Rpb1 (Oryza sativa Japonica Group) 5e-05 87
682 238 RNA polymerase Rpb1 (Oryza sativa) 0.002 99
767 307 HNH nuclease (Medicago truncatula) 2.0 99
光合作用相关 Photosynthesis related
581 639 Triticum aestivum chloroplast DNA (Triticum aestivum) 3e-175 85
679 634 Complete chloroplast genome (Lolium perenne) 0 98
681 427 Festuca arundinacea maturase K (matK) gene, complete cds; chloroplast (Festuca arundinacea) 0 99
588 709 Lolium perenne complete chloroplast genome (Lolium perenne) 0 99
560 302 Festuca arundinacea maturase K (matK) gene, complete cds (Festuca arundinacea) 2e-154 99
619 217 Chloroplast rpl16 gene for ribosomal protein L16 exon 1 (Zea mays) 3e-41 85
666 279 Penn A-4 chloroplast, complete genome (Agrostis stolonifera) 5e-115 97
629 306 Hordeum vulgare mRNA for PSII 10kD protein (Hordeum vulgare) 4e-81 86
313 518 Yucca schidigera NADH- plastoquinone oxidoreductase subunit 6 (ndhG) gene (Yucca schidigera) 2e-91 82
620 258 Chloroplast genes for ATPase subunits B and E (Hordeum vulgare) 2e-23 93
670 150 Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/ oxygenase large subunit (rbcL) gene (Lolium perenne) 4e-73 99
514 648 Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase /oxygenase large subunit (rbcL) mRNA (Elymus sibiricus) 0 98
糖代谢相关 Sugar metabolism related
263 220 Wheat chloroplast ATP synthase proton-translocating subunit gene (Triticum aestivum) 6e-73 95
250 708 Thinopyrum elongatum ATP synthase F0 subunit III (atpH) gene (Lophopyrum elongatum) 0 94
531 639 Wheat chloroplast ATP synthase proton-translocating subunit gene (Triticum aestivum) 2e-72 95
159 631 Thinopyrum elongatum ATP synthase F0 subunit III (atpH) gene, chloroplast (Lophopyrum elongatum) 1e-39 96
278 267 Acid phosphatase (PAP1) mRNA (Lolium multiflorum) 3e-62 93
689 214 Acid phosphatase (PAP1) mRNA (Lolium multiflorum) 5e-34 90
636 206 Acid phosphatase (PAP1) mRNA (Lolium multiflorum) 8e-37 92
616 381 Phosphoglycerate kinase (Clostridium botulinum F str.) 4.6 90
63 363 EZY11 mRNA for UDP-glucose protein: protein trans glycosylase (Chlamydomonas reinhardtii) 0.001 100
342 573 Fucose-1-phosphate guanylyltransferase (Homo sapiens) 3e-05 100
物质运输相关 Material transportation related
59 331 mRNA for asparagine synthetase (Glycine max) 2e-04 100
抗逆性相关 Stress resistance related
33 184 Numida meleagris hspa8 mRNA for heat shock protein (Numida meleagris) 3e-05 100
754 400 Locusta migratoria heat shock protein 90 mRNA (Locusta migratoria) 8e-05 100
756 513 SrGLU5 mRNA for beta-1,3-glucanase (Sesbania rostrata) 0.001 100
62 422 Isolate pop98 tRNA-Lys (trnK) gene (Deschampsia antarctica) 2e-115 89
326 540 Isolate pop98 tRNA-Lys (trnK) gene (Deschampsia antarctica) 0 95
功能未知 Function unknown
700 395 No significant similarity found

3 结论与讨论
3.1 信号转导响应
信号识别是植物体整个抗逆性反应的原初事件,
处于基因调控网络的开端。本试验中检测到与信号
转导相关的组氨酸激酶(Histidine kinase)基因, 组氨
酸激酶能够接收外部信号进而改变组氨酸激酶的活
性。1993年在酵母和拟南芥中发现类似组氨酸激酶
后, 已经鉴定出双组分信号系统也存在于植物中[8],
并在植物生长发育中起重要作用。试验中检测到的
bZIP60转录因子 mRNA(Transcription factor bZIP60
mRNA)也是重要信号转导因子。在植物中, bZIP 蛋
白与种子贮藏基因表达、光形态发生及器官建成的
控制相关[9]。据报道, 干旱、高盐或外源脱落酸能诱
导内源脱落酸的合成, bZIP 类型的转录因子也随之
被激活, 并结合在 ABRE(ABA responsive element)
上 , 它们的相互作用使下游许多抗性基因得以表
1166 中国生态农业学报 2009 第 17卷


达[10]。此外, 本研究检测到的与信号转导有关的基
因还包括参与转录调节的 RNA 聚合酶 Rpb1(RNA
polymerase Rpb1)及催化水解核苷酸之间磷酸二酯
键的核酸酶(HNH nuclease)基因。
3.2 对光合作用的影响
本研究中鉴定出多个光合作用关键酶的基因。
其中 , NADH-质体醌氧化还原酶亚单位 6 基因
[(NADH-plastoquinone oxidoreductase subunit 6
(ndhG) gene]属于质体醌氧化还原酶基因, 质体醌是
PSⅡ反应中心的末端电子受体, 也是介于 PSⅡ复合
体与 Cytb6/f复合体间的电子传递体, 在光合膜上转
运电子与质子, 对类囊体膜内外建立质子梯度起着
重要作用; 叶绿体 ATP酶 B、E亚基基因(Chloroplast
genes for ATPase subunits B and E)参与了植物光合
作用过程; 核酮糖 1,5-二磷酸羧化酶/氧化酶大亚基
mRNA (Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxy-
genase large subunit mRNA)在所获得的 EST中出现
2次。Goulas等[11]研究也发现, 拟南芥在冷诱导条件
下, 核酮糖 1,5-二磷酸羧化酶大亚基表达量上升。水
稻在低温胁迫下, 叶片中有 19个蛋白点被鉴定为核
酮糖 1,5-二磷酸羧化酶大亚基的降解片段[12]。核酮
糖 1,5-二磷酸羧化酶是一个双功能酶, 它既可催化
羧化反应, 又可催化加氧反应, 是调节植物光合过
程中的 CO2 同化和光呼吸, 决定净光合作用的一个
关键酶。
此外, 在所获得的 34条 EST序列中, Chloroplast
DNA、Complete chloroplast genome等 7条参与了叶
绿体合成, 占所得 EST 序列的 20.6%。Gupta 等[13]
将超表达叶绿体 Cu/Zn-SOD基因的烟草成熟植株用
强光和低温处理 6 h 后再放回正常环境中, 发现这种
转基因植株的光合能力可恢复 90%以上, 而对照植
株的光合能力完全丧失。经过低温驯化的植物更不
容易遭受低温伤害, 由此推测低温驯化有可能诱导
叶绿体的某些基因表达从而进行自我修复, 减轻低
温的伤害程度。处于低温环境中的植物所吸收的光
能常超出其光合作用所能利用的范围而过剩, 光常
引起光抑制的发生[14,15]。本研究中鉴定出光合系统
Ⅱ 10 kd 蛋白的 mRNA(mRNA for PSⅡ10kD pro-
tein), 光合系统Ⅱ10 kd 蛋白参与 PSII的构成。植物
通过依赖于叶黄素循环的热耗散光系统Ⅱ
(PhotosystemⅡ, PSⅡ)的可逆失活光呼吸和 Mehler
反应等保护机制耗散过多的光能可保护光合机构反
应中心免受破坏[15,16]。
由此可见, 低温胁迫下, 高羊茅不仅加强了光
合作用关键酶基因的表达, 同时还通过叶绿体基因
的表达进行自我修复以及 PSⅡ10 kd蛋白 mRNA的
表达减轻光抑制作用, 以适应逆境胁迫。
3.3 糖类代谢响应
34 条 EST 序列中 4 条 ATP 合酶基因。ATP 合
成酶广泛存在于叶绿体、线粒体中, 是生物能量转
换的核心酶 , 参与氧化磷酸化和光合磷酸化过程 ,
在跨膜质子动力势的推动下, 催化合成 ATP, 并可
利用 ATP的能量实现 H+的跨膜运输[17]。酸性磷酸酶
[Acid phosphatase (PAP1) mRNA]是一种膜结合的亲
水脂内在蛋白质, 参与碳水化合物等多种生物大分
子的降解, 它因冰冻等条件增大自膜的解离, 这种
解离与植物的冻害反应是一致的[18]。磷酸甘油酸激
酶[Phosphoglycerate kinase (PGK)]属于代谢酶 , 是
糖酵解的关键酶, 也是每种生物得以生存的必须酶,
其主要功能是在糖酵解过程催化 1, 3-二磷酸甘油酸
转变成 3-磷酸甘油酸[19−21], 使生物体获得生命活动
所需要的部分能量。该酶的缺乏可引起生物体代谢
等功能的紊乱。EZY11 mRNA for UDP-glucose属于
转葡萄糖基酶系, 是细胞壁代谢物的相关酶, 是合
成淀粉不可缺少的酶, 此酶系在植物中分布广, 与糖
类代谢有关。Fucose-1-phosphate guanylyltransferase
参与果糖及甘露糖的代谢 , 也是糖酵解的途径之
一。由此可见, 在低温诱导下, 高羊茅主要加强了呼
吸作用的糖酵解过程及细胞壁淀粉的合成作用, 以
增强细胞的抗逆性。
3.4 物质运输相关基因表达
本研究鉴定出天冬酰胺合成酶(Asparagine syn-
thetase)基因, 其表达与体内物质运输有关。天冬酰
胺合成酶是 2000 年发现的除草剂环庚草醚靶标酶,
在植物体中, 天冬酰胺合成酶是催化天冬氨酸和谷
胺酰氨生成天冬酰胺和谷胺酸, 而天冬酰胺又是重
要的运输氮化合物[22]。梁俊俊[23]研究发现棉花铝诱
导蛋白基因 GhAlin 与小麦中的铝诱导蛋白基因
wali7 以及拟南芥天冬酰胺合成酶(AS)基因有较高
的同源性。由此说明逆境胁迫下植物体加强了氮化
合物的运输, 以提高抗逆性。此外, 冬酰胺合成酶残
基还参与体内信号转导作用。
3.5 抗逆相关基因的表达
在所获得的基因中发现了热激蛋白基因 HspA8
和 Hsp90。热激蛋白(Hsp)是生物体在高温、低温、
盐渍、干旱等逆境胁迫下诱导合成的一类应激蛋白。
为考察 Hsp 与获得抗冷性的联系, 在拟南芥中克隆
了在低温下表达的 Hsp 基因, 序列分析表明他们与
番茄的抗冷基因 tom66和 tom111高度同源[4]。目前
在甘蓝型油菜、水稻和菠菜中均发现有热激蛋白基
因可被低温诱导, 其主要功能是参与新生肽的折叠
以及蛋白质变性后的复性、降解, 维持细胞内环境
第 6期 黄锦文等: 低温胁迫下高羊茅抑制消减文库的构建与分析 1167


的稳定[24]。β-1,3-葡聚糖酶作为植物防卫反应中重要
的水解酶, 能够降解病菌细胞壁的葡聚糖, 与植物
系统获得抗性具有密切关系[25]。β-1,3-葡聚糖酶基因
的表达不仅与病原菌侵染有关, 还与其他生物或非
生物诱导物有关。本次基因差显中筛选到 1 条与
β-1,3-葡聚糖酶基因同源性很高的基因, 推测其可能
在低温驯化后参与了防止低温伤害的过程。在所建
文库中还发现与赖氨酸转移基因有极高同源性的基
因(Isolate pop98 tRNA-Lys gene)。王勋陵等[26]在研
究臭氧对植物细胞膜透性的影响中发现赖氨酸能够
降低植物细胞膜的透性 , 增强其对逆境的抵御能
力。目前赖氨酸在动物和人体上的研究证明其能够
提高机体的免疫能力, 但在植物上的研究刚刚开始,
其抗逆功能还有待进一步研究。
综上所述, 高羊茅在逆境低温胁迫下, 通过信
号转导基因的加强表达, 启动了代谢、物质运输和
抗逆等有关基因表达, 以提高体内代谢水平, 增强
其防御性能。但由于试验条件的限制, 本研究仅挑
选部分克隆子进行测序, 因而鉴定出的基因极其有
限, 还有许多低温诱导基因有待于进一步鉴定。此
外, 由于试验过程中处理组和对照组均采用四碱基
的 RsaⅠ进行酶切, 致使试验中很难获得全长 cDNA,
也是本研究的不足之处。今后将进一步以本研究获
得的一些重要候选基因的 EST 为基础, 利用 RACE
等技术克隆全长基因; 对于已鉴定出的一些关键基
因, 本研究也将进一步借助荧光定量 PCR 等方法对
基因进行转录水平上的相对定量分析。
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