全 文 :中国生态农业学报 2012年 7月 第 20卷 第 7期
Chinese Journal of Eco-Agriculture, Jul. 2012, 20(7): 927−931
* 土壤与农业可持续发展国家重点实验室开放基金(Y052010006)、转基因生物新品种培育科技重大专项(2011ZX08012-005)和江苏高校
优势学科建设工程项目资助
** 通讯作者: 俞元春(1961—), 男 , 教授 , 博士生导师, 主要从事土壤生态研究, E-mail: ycyu@njfu.edu.cn; 刘标, 男 , 研究员 , E-mail:
85287064@163.com
冷春龙(1980—), 男, 硕士研究生, 主要从事环境保护工作。E-mail: 450410554@qq.com
收稿日期: 2011-11-22 接受日期: 2012-02-08
DOI: 10.3724/SP.J.1011.2012.00927
转基因抗虫棉对赤子爱胜蚓生长、生殖
及 SOD活性的影响*
冷春龙1,2 俞元春1,3** 吴电明1,4 舒洪岚5 刘 标6**
(1. 南京林业大学森林资源与环境学院 南京 210037; 2. 江西省武宁县环境保护局 武宁 332300; 3. 中国科学院南京土
壤研究所 土壤与农业可持续发展国家重点实验室 南京 210008; 4. 中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中
心 石家庄 050022; 5. 江西财经大学 南昌 330032; 6. 环境保护部南京环境科学研究所 南京 210042)
摘 要 转基因抗虫棉给人类带来经济效益的同时, 也存在生物安全性问题。蚯蚓通过影响土壤的物理和生
物性质使土壤肥力发生变化。目前国内外针对转基因抗虫棉对蚯蚓的影响研究十分有限, 本研究通过室内喂
养试验研究了转基因抗虫棉对赤子爱胜蚓生长、生殖及超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响。试验设置 5个处理:
100 g牛粪+500 g土壤(CK)、50 g转基因抗虫棉叶+550 g土壤(50T)、100 g转基因抗虫棉叶+500 g土壤(100T)、
50 g非转基因抗虫棉叶+550 g土壤(50NT)、100 g非转基因抗虫棉叶+500 g土壤(100NT)。结果表明, 喂养同
等剂量转基因抗虫棉叶与非转基因抗虫棉叶的蚯蚓体重变化趋势基本一致, 总体来说喂养 100 g棉叶(100T和
100NT处理)的蚯蚓体重高于喂养 50 g棉叶(50T和 50NT处理)和喂养牛粪(CK)的蚯蚓。在培养试验结束时, 喂
养 100 g转基因抗虫棉叶(100T处理)蚯蚓体重下降为前一次测定时的 23.8%。喂养同等剂量的转基因抗虫棉叶
和非转基因抗虫棉叶的蚯蚓茧数和新产生的小蚓数无显著差异(在 0∼27和 0∼57之间变化), 但喂养 100 g转基
因抗虫棉叶(100T 处理)的小蚓数低于其他处理。在大多数培养时间内, 同等剂量转基因抗虫棉叶处理对蚯蚓
体内 SOD活性的影响与非转基因抗虫棉叶处理差异不显著, 但是在试验结束时(201 d), 喂养 50 g棉叶(50T和
50NT处理)的蚯蚓体内 SOD活性显著高于喂养 100 g棉叶(100T和 100NT处理)的蚯蚓。
关键词 转基因抗虫棉 赤子爱胜蚓 体重 蚯蚓茧数 小蚯蚓数 SOD
中图分类号: S154.1 文献标识码: A 文章编号: 1671-3990(2012)07-0927-05
Effect of transgenic pest-resistant cotton on the growth, reproduction
and SOD activity of Eisenia foetida
LENG Chun-Long1,2, YU Yuan-Chun1,3, WU Dian-Ming1,4, SHU Hong-Lan5, LIU Biao6
(1. College of Forest Resources and Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China; 2. Jiangxi Wuning Environment
Protective Bureau, Wuning 332300, China; 3. Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences; State Key Laboratory of Soil and
Sustainable Agriculture, Nanjing 210008, China; 4. Center for Agricultural Resources Research, Institute of Genetics and Developmen-
tal Biology, Chinese Academy of Sciences, Shijiazhuang 050022, China; 5. Jiangxi University of Economics and Finance, Nanchang
330032, China; 6. Nanjing Institute of Environmental Sciences, Ministry of Environmental Protection, Nanjing 210042, China)
Abstract While as much as transgenic pest-resistant cotton cultivation economically benefits humanity, it also affects ecosystem
bio-safety. Studies have shown that earthworm improves soil fertility via enriching soil physical and biological properties. However,
few studies have reported on the effects of transgenic pest-resistant cotton on soil earthworms. This work studied the effects of trans-
genic pest-resistant cotton on the growth, reproduction and superoxide dismutase (SOD) activity of field-fed earthworms (Eisenia
foetida). The five treatments of the experiment included 100 g cow manure + 500 g soil (CK), 50 g transgenic cotton leaf + 550 g soil
(50T), 100 g transgenic cotton leaf + 500 g soil (100T), 50 g non-transgenic cotton leaf + 550 g soil (50NT), and 100 g
928 中国生态农业学报 2012 第 20卷
non-transgenic cotton leaf + 500 g soil (100NT). Results showed similar varied trends in the body weights of earthworms fed on the
same doses transgenic and non-transgenic cotton leaves. In general, the body weights of earthworms fed on 100 g cotton leaf (100T
and 100NT) were higher than those fed on 50 g cotton leaf (50T and 50NT) and cow dung (CK). At the end of the experiment, how-
ever, the body weights of earthworm fed on 100 g transgenic cotton leaf dropped to 23.8% of the previous measurement. There were
no significant differences in numbers of earthworm cocoons (0~27) and new earthworms (0~57) between earthworms fed on the
same doses of transgenic and non-transgenic cotton leaf. However, the number of new earthworms fed on 100 g transgenic cotton
leaf (100T) was lower than those for the other treatments. For the most incubation period, SOD activity of earthworms fed on trans-
genic cotton leaf was not significantly different from those fed on the same doses of non-transgenic cotton leaf. At the end of the
experiment after 201 days, SOD activity of earthworms in the 50T and 50NT treatments were significantly higher than those in the
100T and 100NT treatments.
Key words Transgenic pest-resistant cotton, Earthworm Eisenia foetida, Body weight, Cocoon number, New earthworm
number, Superoxide dismutase (SOD)
(Received Nov. 22, 2011; accepted Feb. 8, 2012)
转基因抗虫棉给人类带来经济效益的同时, 也
存在生物安全性问题[1−3]。转基因抗虫棉的外源基因
可能来自植物、动物或微生物, 例如转 Bt基因棉花
中的外源基因来自于微生物。这些可能出现的新组
合、新性状是否会改变原有的生态环境, 并影响到
生态系统稳定性, 已引起各方面的关注[4−6]。转基因
抗虫棉的抗虫基因表达蛋白进入土壤生态系统后 ,
可以进入昆虫(包括靶标害虫和非靶标害虫)体内被
降解 [7], 但也会残留在土壤中 [8], 改变土壤的特异
生物功能类群以及土壤的生物多样性[9−11]。蚯蚓通过
影响土壤的物理和生物性质而影响对植物养分的供应,
它在土壤肥力上的重要性已为大家所公认 [12−14]。
Saxena 等[15]研究表明种植转 Bt 基因玉米和非转基
因母本玉米的土壤对大蚯蚓(Lumbricus terrestris)的
死亡率和体重方面的影响没有显著差异, 但在其肠
道和排出的泥土中检测到了 Bt毒素。如果把蚯蚓放
到没有种植过转基因玉米的新鲜土壤中 2~3 d 后,
其肠道内的毒素就检测不到了。Zwahlen 等[16]研究
表明转基因玉米对成年和幼年大蚯蚓都没有致死效
应, 但室内培养 200 d后, 在含有转基因玉米叶片土
壤中成年大蚯蚓的体重比初始体重降低 18%, 而在
含有非转基因玉米叶片土壤中成年大蚯蚓的体重比
初始体重仅降低 4%[16]。Vercesi等[17]研究也表明转
基因玉米对蚯蚓的存活率、繁殖和生长情况均没有
显著影响, 只是在高剂量 Bt玉米组织处理下的蚯蚓
茧孵化显著低于非 Bt玉米组织处理。目前国内外针
对转基因抗虫棉对蚯蚓的影响研究十分有限[18], 而
且大多数研究表明转基因植物对蚯蚓的影响不显
著。本文通过室内喂养试验, 研究了转基因抗虫棉
对蚯蚓生长、生殖及超氧化物歧化酶(SOD)活性的
影响, 以期为揭示转基因抗虫棉对蚯蚓的影响机理
提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 基质的准备
采集转基因抗虫棉(“中棉所 41”, 携带 Bt 和
CpTI 双价外源基因)和非转基因抗虫棉(“中棉所 35”)
的衰老棉叶, 用蒸馏水清洗干净, 60 ℃烘干至恒重,
用剪刀剪成宽 0.5 cm左右的小叶片, 放在保鲜袋中,
−20 ℃保存备用。其基本化学性质如表 1。
土壤基质采自南京林业大学树木园, 没有种植
过转基因抗虫棉, 风干, 过 2 mm筛备用; 牛粪采自
南京环境科学研究所试验专用牛粪, 其基本理化性
质见表 2。
表 1 试验用棉叶基质的基本化学性质
Table 1 Chemical properties of cotton leaves used in the test g·kg−1
棉花品种
Cotton variety
外源基因
Exogenous gene
总蛋白
Total protein
可溶性糖
Soluble sugar
全碳
Total C
全氮
Total N
全磷
Total P
全钾
Total K
中棉所 41 Zhongmiansuo 41 Bt, CpTI 317.07 123.42 722.74 14.58 7.72 12.90
中棉所 35 Zhongmiansuo 35 — 205.00 51.13 711.01 7.71 2.18 4.88
表 2 土壤基质和牛粪的基本化学性质
Table 2 Chemical properties of soil and cow dung used in the test
基质
Matrix
pH
有机质
Organic matter
(g·kg−1)
全氮
Total N
(g·kg−1)
全磷
Total P
(g·kg−1)
全钾
Total K
(g·kg−1)
水解氮
Hydrolyzable N
(mg·kg−1)
有效磷
Available P
(mg·kg−1)
速效钾
Available K
(mg·kg−1)
土壤 Soil 6.09 19.20 1.30 0.47 9.12 47.56 0.11 46.21
牛粪 Cow manure 8.57 317.30 12.71 8.81 19.51 1 157.00 117.40 6 109.00
第 7期 冷春龙等: 转基因抗虫棉对赤子爱胜蚓生长、生殖及 SOD活性的影响 929
1.2 供试蚯蚓
试验蚯蚓为赤子爱胜蚓(Eisenia foetida), 来自
南京环境科学研究所的试验用蚯蚓。收集的蚯蚓在
实验室培育一段时间后, 选取带有生殖环带、大小
较一致的健康蚯蚓, 用蒸馏水冲洗干净并在滤纸上
吸干水分, 称重(约为 0.20~0.40 g), 将其放在测试基
质表面, 即可用于正式试验。
1.3 试验设计
设 5个处理: 100 g牛粪+500 g土壤(对照)、50 g
转基因抗虫棉叶+550 g土壤、100 g转基因抗虫棉叶
+500 g土壤、50 g非转基因抗虫棉叶+550 g土壤、
100 g非转基因抗虫棉叶+500 g土壤, 重复 3次。各
处理分别用 CK、50T、100T、50NT和 100NT表示。
称取 500 g(或 550 g)土壤置于高 15 cm、直径 13
cm、总体积约 2 L的培养瓶中, 加少量水, 放入高压
灭菌锅中灭菌杀死土壤基质中的有机体, 冷却后按
设计加入牛粪(已灭菌)和棉叶, 混匀, 用去离子水调
节水分至土壤最大持水量的 30%。在每个培养瓶中
各放入健康蚯蚓 10 条, 用纱布扎好瓶口, 将培养瓶
置于温度为(20±2)℃、湿度为 80%~85%的培养箱内,
试验过程中不提供光照。为了研究转基因抗虫棉对
蚯蚓的长期影响, 试验过程中约每 2 个月添加 1 次
棉叶, 其添加量为原始加入量的 1/2。
在试验过程中, 每隔 14 d检查培养瓶中蚯蚓条
数、卵数、重量(小心清除蚯蚓体表泥土), 检查完毕
后全部放回原来的培养瓶中。等有第 2 代蚯蚓出现
时(42 d), 开始随机采 1条蚯蚓, 以后每隔 2个星期
(分别在 56 d、70 d、84 d、98 d、112 d和 201 d)随
机采 1 条蚯蚓, 采集的蚯蚓称重后放入装有 2 mL
0.86%冷生理盐水的 5 mL离心管中, 存于冰箱冷冻
以测定 SOD酶活性。
1.4 SOD活性测定
按每 0.1 g生物量加 0.9 mL 0.86%冷却过的生理
盐水, 制成 10%匀浆液。在 2 ℃、3 000 r·min−1条件
下离心 12 min, 取上清液, 用南京建成生物工程研
究所提供的超氧化物歧化酶试剂盒和考马斯亮兰蛋
白试剂盒测定上清液中的 SOD活性。
1.5 数据处理
利用 Microsoft Excel软件、DPS数据处理系统
软件的Duncan新复极差法(简称DMRT法)进行各处
理间的差异显著性检验(P<0.05)。
2 结果与分析
2.1 急性毒性试验
转基因抗虫棉叶和常规棉叶喂养蚯蚓试验过程
中, 于第 14 d和第 28 d检查培养瓶中蚯蚓的生长情
况, 记录蚯蚓的死亡数据(数据未列出)。结果表明,
本试验中作为对照的牛粪处理蚯蚓个体在 28 d 内无
一死亡, 这说明本试验的条件比较可靠。与对照处理
的结果一样, 50NT、100NT、50T和 100T处理的蚯蚓
在 28 d 内均未出现致死现象, 这说明即使是高剂量
的抗虫棉叶片, 也不会对蚯蚓产生急性毒杀效应。
2.2 转基因抗虫棉叶对蚯蚓生长与生殖的影响
在转基因棉花未对蚯蚓产生毒杀效应的前提下,
进一步开展转基因棉花对蚯蚓的生长和生殖影响的
试验。不同时期蚯蚓平均体重的变化状况如图 1。
图 1 转基因抗虫棉对赤子爱胜蚓体重的影响
Fig. 1 Effect of transgenic pest-resistant cotton on body
weight of E. foetida
对照: 100 g牛粪+500 g土壤; 50T: 50 g转基因抗虫棉叶+550 g
土壤; 100T: 100 g 转基因抗虫棉叶+500 g土壤; 50NT: 50 g非转基因
抗虫棉叶+550 g土壤; 100NT: 100 g非转基因抗虫棉叶+500 g土壤。
下同。CK: 100 g cow manure + 500 g soil; 50T: 50 g transgenic cotton
leaf + 550 g soil; 100T: 100 g transgenic cotton leaf + 500 g soil; 50NT:
50 g non-transgenic cotton leaf + 550 g soil; 100NT: 100 g
non-transgenic cotton leaf + 500 g soil. The same below.
从图 1可以看出, 对照处理(无棉叶加牛粪)与其
他处理有所不同, 在喂养前 28 d 内, 蚯蚓体重增加
21.28%; 但之后一直下降, 试验结束时下降到原始
体重的 34.04%。50T与 50NT处理的蚯蚓在喂养 14
d 后, 净体重增加 10.0%, 而 100T 和 100NT 处理的
净体重增加 20.0%; 之后, 50T 与 50NT 处理的蚯蚓
净体重变化趋势一致, 试验结束后蚯蚓的体重与原
始体重相差不大; 100T除在 201 d出现急速下降(降
幅为 23.8%)外, 与 100NT 处理的变化趋势一致, 蚯
蚓净体重一直处于上升趋势。在整个培养期内, 蚯
蚓净体重总的变化趋势是 100T 和 100NT 高于 50T
和 50NT, CK最低, 可能与添加棉叶的量、食物的适
口性(棉叶和牛粪的区别)等原因密切相关。
转基因抗虫棉叶和常规棉叶喂养蚯蚓后, 不同
时期蚯蚓生殖状况的变化如表 3所示。在喂养 201 d
的过程中, 各处理的蚯蚓茧数目在 1~16 个范围内;
喂养 14 d 对照处理的蚯蚓茧数显著低于其他处理;
28 d 对照处理的蚯蚓茧数显著低于 100NT, 与其他
处理差异不显著; 除 50T喂养 56 d外, 喂养 42 d后
930 中国生态农业学报 2012 第 20卷
各处理的蚯蚓茧数没有显著差异。
各处理中新产生的小蚯蚓数目随喂养时间的延
伸有增加趋势。喂养前 28 d内, 各处理间均未发现
新产生的小蚯蚓, 直到 42 d后才开始发现; 而 100T
和 100NT 处理在喂养 56 d 后才检查到小蚓出现,
100T处理小蚯蚓数第 56 d、70 d和 84 d显著低于
50T和 50NT处理, 但与 CK及 100NT处理没有显著
差异。之后各处理间没有显著差异, 但 100T处理有
低于其他处理的趋势。
2.3 转基因抗虫棉叶对蚯蚓体内超氧化物歧化酶
(SOD)活性的影响
由图 2所示, 在试验前期(前 70 d), CK处理 SOD
活性高于其他处理, 42 d时显著高于 50T和 50NT处
理, 56 d和 70 d时显著高于其他处理; 84 d后, CK处
理的 SOD 活性趋于降低, 201 d 时 CK 处理的 SOD
活性显著低于 50NT处理。50T处理的 SOD活性 56
d时显著低于 50NT处理, 84 d时显著高于 50NT处
理, 其他时期 50T与 50NT处理 SOD活性无显著性
差异。100T和 100NT处理蚯蚓体内的 SOD活性变
化趋势与 50T和 50NT处理相同。培养 98 d后, 50T
和 50NT 处理 SOD 活性有增加的趋势, 而 100T 和
100NT 处理则相反。在试验结束时 50T 和 50NT 处
理 SOD活性显著高于 100T和 100NT处理。
3 讨论与结论
28 d 的室内培养试验表明, 高含量的抗虫棉叶
对蚯蚓没有急性毒杀效应。在 201 d 的蚯蚓喂养试
验中, 与喂养非抗虫棉叶相比, 喂养 50 g和 100 g抗
虫棉叶(50T和 100T)在 126 d内对蚯蚓的体重无显著
影响, 但在 201 d时, 100T处理蚯蚓的体重相对前一
次大幅度下降; 这与 Zwahlen 等[16]的研究结果相一
致, 其主要原因可能是转基因植物不但改变了土壤
中微生物群落结构[19], 而且影响到转基因植物中化
学成分的组成结构[16,20]。例如, Saxena 等[20−21]发现
转基因玉米维管束鞘及厚壁组织细胞中含有更高含
量的木质素, 这可能减慢凋落物的分解速率, 也有
表 3 转基因抗虫棉叶对赤子爱胜蚓生殖的影响
Table 3 Effect of transgenic pest-resistant cotton leaves on reproduction of E. foetida
蚯蚓茧数目 Cocoon number of earthworm 新生赤子爱胜蚓数目 Number of new earthworm 喂养天数
Feeding days (d) CK 50T 100T 50NT 100NT CK 50T 100T 50NT 100NT
14 1±1d 11±1a 8±3bc 11±2ab 5±1c — — — — —
28 6±2b 10±1ab 12±4ab 11±3ab 13±4a — — — — —
42 14±6a 10±3a 6±3a 12±3a 14±9a 2±3a 5±2a — 3±2a —
56 14±1a 6±7b 4±3a 12±3a 7±4a 7±3ab 19±4a 2±2b 19±16a 3±4ab
70 7±6a 4±4a 11±5a 3±2a 12±4a 19± 8abc 39±5a 7±7c 31±14ab 10±15bc
84 10±8a 6±3a 11±6a 8±7a 7±5a 26±20ab 34±5a 7±5b 32±10a 11±18ab
98 8±1a 5±4a 7±3a 4±3a 4±4a 26±20a 24±13a 4±3a 14±12a 9±14a
112 10±7a 7±1a 14±6a 6±3a 9±1a 31±27a 38±15a 9±9a 30±23a 18±29a
126 8±5a 6±4a 10±3a 7±1a 6±3a 24±16a 37±14a 15±12a 35±22a 22±28a
140 4±1a 3±1a 16±6a 10±3a 9±2a 22±16a 36±10a 11±11a 30±18a 25±35a
154 6±1a 6±1a 13±2a 8±2a 8±1a 28±13a 41±9a 17±12a 35±19a 27±35a
168 7±3a 4±2a 14±11a 9±4a 9±5a 30±15a 36±12a 13±8a 38±23a 31±28a
201 8±2a 4±1a 14±13a 9±4a 9±5a 35±14a 39±15a 20±6a 45±21a 33±31a
同行不同小写字母表示处理间在 0.05水平上差异显著 Values followed by different lowercase letters in the same line are significantly dif-
ferent at 0.05 level.
图 2 转基因抗虫棉叶对赤子爱胜蚓 SOD活性的影响
Fig. 2 Effect of transgenic pest-resistant cotton leaves on SOD activity of E. foetida
第 7期 冷春龙等: 转基因抗虫棉对赤子爱胜蚓生长、生殖及 SOD活性的影响 931
可能向蚯蚓提供低质量的食物, 从而不利于其生长
生殖, 但更长时间的喂养试验及转基因植物叶片成
分组成等数据的获得还需要进一步的研究。
喂养 14 d对照处理的蚯蚓茧数显著低于其他处
理; 28 d对照处理的蚯蚓茧数显著低于 100NT, 与其
他处理差异不显著; 除 50T喂养 56 d外, 喂养 42 d后
各处理的蚯蚓茧数没有显著差异。各处理直到 42 d才
开始发现新产生的小蚯蚓, 100T和 100NT处理直到
56 d才检查到小蚯蚓, 100T处理 56 d、70 d和 84 d的
小蚓数显著低于 50T 和 50NT 处理, 但与 CK 和
100NT处理没有显著差异。56 d后其他处理间没有
显著差异, 但 100T 处理有低于其他处理的趋势, 可
能是由于高剂量的抗虫棉叶片对蚯蚓的生殖有抑制
作用[17], 但尚需要更多的数据支持。
超氧化物歧化酶(SOD)是一种含有金属元素的
活性蛋白酶, 广泛分布于各种生物体内, 如动物、植
物、微生物等。SOD 具有特殊的生理活性, 是生物
体内清除自由基的首要物质, SOD 在生物体内的水
平高低意味着衰老与死亡的直观指标。现已证实 ,
由氧自由基引发的疾病多达 60多种。它可对抗与阻
断因氧自由基对细胞造成的损害, 并及时修复受损
细胞, 复原因自由基造成的对细胞的伤害[22]。生物
体内 SOD含量不是恒定的, 当生物所生存的环境出
现逆境时, 生物体内会诱导 SOD的产生。反过来说
如果 SOD活性越低, 生物生存的环境越理想[23]。本
试验中, 除 56 d和 84 d外, 其他时期同等剂量抗虫
棉叶和非抗虫棉叶对蚯蚓体内 SOD活性的影响不显
著。但是在试验结束时, 50T和 50NT处理的 SOD活
性显著高于 100T和 100NT处理。
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