全 文 ：中国生态农业学报 2009年 9月 第 17卷 第 5期
Chinese Journal of Eco-Agriculture, Sept. 2009, 17(5): 938−943


* 国家自然科学基金项目(30771400)、霍英东教育基金会高等院校青年教师基金(111032)、福建省科技计划重点项目(2007Y0002)和福建
省高等学校优秀人才支持计划资助
†
同等贡献
** 通讯作者: 汪世华(1976~), 男, 博士, 副教授, 主要从事农业微生物与分子生物学方面的研究。E-mail: wshyyl@sina.com
林玲(1982~), 女, 硕士研究生, 助理实验师, 主要研究方向为生物化学与分子生物学。E-mail: linling0033@163.com
收稿日期: 2008-05-15 接受日期: 2008-08-21
DOI: 10. 3724/SP.J.1011.2009.00938
木质素降解菌的筛选及其纤维素酶基因克隆表达研究*
林 玲† 林志伟† 郭梧年 杨 菁 汪世华**
(福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室/生命科学学院 福州 350002)
摘 要 以高效降解木质素为指标, 进行木质素降解菌的筛选和纤维素酶处理纤维材料的研究。通过测定 14
株白腐菌菌株在愈创木酚、苯胺兰和鞣酸培养基上生长状况和酶活分泌能力, 得到 8 株能产生阳性反应的菌
株。以木质素和综纤维素失重的比值(SF指数)为指标, 对这几株菌进行复筛, 从中筛选出具有生长优势和强酶
分泌能力的菌株平菇 10969 和侧耳 WP1。与黄胞原毛平革菌 Phanerochaete chrysosporium RP78 和 P. chry-
sosporium BKM-F-1767 两株模式菌相比, 白腐菌具有良好的生长优势、强酶系分泌能力和降解的优势。从分
离的白腐菌中克隆纤维素酶基因(egl2), 表达蛋白并测定酶活。用粗酶液处理不同的纤维材料, 结果表明, 其
还原糖产量为综纤维素(酸解)>菌草(白腐菌处理)>未处理菌草。白腐菌的研究对草质资源的充分利用、污染物
的降解、燃料乙醇的开发以及我国生态农业的持续发展等都有着重要意义。
关键词 白腐菌 木质素降解菌 纤维素酶 综纤维素 基因克隆 还原糖 污染物降解
中图分类号: TQ92 文献标识码: A 文章编号: 1671-3990(2009)05-0938-06
Screening and cloning ligninolytic strain and cellulase gene expression
LIN Ling, LIN Zhi-Wei, GUO Wu-Nian, YANG Jing, WANG Shi-Hua
(1. Key Laboratory for Biopesticide and Chemical Biology, Ministry of Education; College of Life Sciences,
Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)
Abstract In order to effectively biodegrade lignin, lignin-degrading bacteria screening and fiber material treatment with cellulase
were conducted. Eight strains producing positive reaction were selected by detecting the growth status and enzyme activity of 14
strains on the media with guaiacol, aniline and tannic acid. The strains were re-screened by using the ratio of Klason lignin degrada-
tion rate to holocellulose degradation rate (SF index) as indicator. In comparison to Phanerochaete chrysosporium RP78 and P.
chrysosporium BKM-F-1767, strains Pleurotus ostreatus Po 10969 and Ganoderma applanatum WP1 were selected because their
higher growth rate, enzyme secretion and degradation ability. Meanwhile, cellulase gene (egl2) was cloned, expressed and enzyme
activity determined. Reducing-sugar produced by different treatments was determined by soaking the materials with crude enzymes
solution. The results show that sugar-reduction ability of the materials is in the order of: Juncao Penniusetum sinese Roxb treated
with NaClO2>Juncao P. sinese Roxb treated with Po10969>untreated Juncao P. sinese Roxb. Research on white rot fungus is signifi-
cant for making full use of plant resources, safe degradation of pollutants and fuel ethanol exploration, as well as the sustainable de-
velopment of eco-agriculture in China.
Key words White rot fungus, Lignin-degrading bacteria, Cellulase, Holocellulose, Gene clone, Reducing sugar, Pollutant
degradation
(Received May 15, 2008; accepted Aug. 21, 2008)
木质素(Lignin)是在植物中产生的一类难于降
解的高分子化合物的通称, 是自然界中仅次于纤维
素的第二大有机物 [1], 它与半纤维素一起构成了包
裹在纤维素周围的基质, 其作用是使植物细胞壁加
固, 是植物抵抗外界微生物和机械压力的保护性屏
障[2, 3]。木质素结构的复杂性和无规则性决定了其难
第 5期 林 玲等: 木质素降解菌的筛选及其纤维素酶基因克隆表达研究 939


降解性 , 同时阻碍了纤维素的降解。木质纤维素
是自然界中广泛存在、可再生且数量巨大的生物质
资源, 但目前仍未被充分利用, 主要障碍在于木质
素难于降解和转化。选育高产木质素降解酶菌株以
及研究相关降解酶类是研究木质素降解的主要
内容。
白腐菌是自然界中木质素最有效降解者之一, 可
彻底降解木质素为 CO2和水, 在自然界碳素循环中起
着关键作用。其中的黄孢原毛平革菌(Phanerochaete
chrysosporium)作为木质素生物降解模式种, 一直是
被广泛研究的对象, 但其木质素降解酶活性并不令
人满意。可降解木质纤维素的白腐菌在有纤维素存
在的情况下可产生降解纤维素的酶系, 主要由纤维
二糖水解酶、内切(外切)-1,4-β-葡聚糖酶和 β-葡萄糖
苷酶组成[3]。1974 年 Eriksson 等[4]在研究黄孢原毛
平革菌(P.Chrysosporium)降解纤维素的速率时推测
该降解有氧化酶类参与。后来 Westermark 等 [5]和
Ayers 等 [6]分别进一步证实了多种降解酶参与了纤
维素的降解。
本研究利用定性和定量方法筛选并鉴定具有木
质素降解能力的白腐菌, 检测其产生的主要木质素
降解酶类, 以期考察具有木质素降解能力的真菌种
类, 并试图筛选出有较强降解能力的真菌用于高木
质纤维素含量菌草中, 加速木质纤维素的转化。并
通过体外克隆表达纤维素酶基因, 进一步研究该酶
的降解能力。其研究结果将对生态农业、环境和生
物质资源转化有着非常重要的经济和生态效益, 在
提高农副产品利用效率方面具有广阔应用前景, 特
别是在农作物残渣的利用、环境保护、我国生态农
业的可持续发展上有着重大意义。
1 材料与方法
1.1 试验菌株
供试白腐菌黄孢原毛平革菌 (Phanerochaete
chrysosporium)RP-78 和 BKM-F-1767 由美国森林菌
物研究中心(Center for Forest Mycology Research)赠
送 , 平 菇 10969[Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.)
Kummer, Po10969]、姬平菇[P. cornucopiae (Pau1.:
Pers.) Roll, PcR]、黄平菇(P. citrinopileatus, Pc)、毛
木 耳 193 [Auricularia polytricha (Mont.) Sacc,
Au193]、毛木耳 2811[A. polytricha (Mont.) Sacc,
Au2811]、香菇 2141(L. edodes, Lc2141)、香菇 Lc26(L.
edodes, Lc26)、香菇 Lc236 (L. edodes, Lc236)、灵芝
Gu0801 [Ganoderma lucidum (Leyss.: Fr.) Karst.,
Gu0801]、蘑菇 Ag96 (Agaricus bisporus(Lange) Sing,
Ag96)、伏芩 05116 [Poria cocos (Schw.) Wolf.,
Pc05116]、树舌 WP0014 (G. applanatum, WP0014)、
树舌 WP1 (G. applanatum, WP1)均由福建农林大学
菌草研究中心提供。
1.2 培养基
基础培养基为 BM 培养基; 菌种保藏培养基为
PDA培养基; 选择培养基为愈创木酚 1.0 g, 酒石酸
铵 0.1 g, 蛋白胨 2.6 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, KH2PO4
1.0 g, Na2HPO4 0.2 g, 琼脂 18 g, 加蒸馏水至 1 000
mL; 苯胺兰固体培养基是在 BM培养基中加入 0.01
g·100mL−1的Azure B(棉兰)和 1.8 g·mL−1的琼脂; 鞣
酸固体培养基是在 BM培养基中加入 1.8 g·mL−1的
琼脂, 高压灭菌后加入已单独灭菌的鞣酸至终浓度
为 0.01 g·100mL−1。
1.3 试验方法
1.3.1 菌株筛选
菌株选择性筛选、苯胺兰固体培养基筛选和鞣
酸固体培养基筛选参照文献[7]进行。
1.3.2 变色圈试验
将在选择性筛选培养基上产生变色圈的菌株作
进一步测定。一种是变色圈在菌落的外圈形成
(d1/d2<1), 另一种是变色圈在菌落的内圈形成
(d1/d2>1)。 d1/d2<1, 则该菌能选择性降解木素 ,
d1/d2>1, 则该菌首先降解综纤维素[8]。
1.3.3 降解率测定及选择性指数(SF)的计算[9]
Klason 木素测定: 用洁净毛刷仔细将待测样本
刷入 250 mL三角瓶中, 加入 72%硫酸(m/m) 15 mL,
塞紧瓶塞, 摇荡 l min, 使试样完全被酸浸润, 室温
下放置 2.5 h, 之后, 将三角瓶内容物移入 1 000 mL
锥形瓶中, 加入蒸馏水的量包括漂洗水在内总体积
为 560 mL, 使硫酸终浓度达到 3%。将 1 000 mL锥
形瓶装上回流冷凝器, 煮沸 4 h, 静置一段时间, 用
已恒重的沙芯漏斗过滤, 将沙芯漏斗放入 105 ℃烘
箱中烘干至恒重, 砂芯漏斗所增之重即为 Klason 木
素重量。
综纤维素测定见参考文献 [9], 其中 SF 指数
=Klason木素降解率/综纤维素降解率。
1.3.4 酶活测定方法
纤维素酶活力测定参照 DNS 法[10,11]。用 DNS
法测定释放的还原糖量, 并以葡萄糖作标准, 计算
释放出的具体还原糖量。
1.3.5 纤维素酶基因的克隆
根据目的基因的序列 , 设计两对序列引物
(Egl2F: 5′ -GGATCCATGCAGACTGTCTGGGGCCA
-3′; Egl2R: 5’ – AAGCTTGCTACTTTCTTGCGAGA
CACGA-3′), 扩增纤维素酶 egl2 基因成熟肽区。剩
余步骤参照常规方法进行。
940 中国生态农业学报 2009 第 17卷


1.3.6 蛋白的表达与处理综纤维素和菌草
重组菌株接种于 80 mL LB 培养基中大量表达,
离心后超声破碎, 得到粗酶液, 称取综纤维素(亚氯酸
钠处理), 巨菌草(白腐菌处理)和巨菌草(未处理)0.5 g,
分别加入 3 mL酶液和 3 mL 10 mmol·L−1醋酸-醋酸钠
缓冲液(pH 4.8)30 ℃处理 24 h, 液体总体积为 9 mL。
用 DNS法测定还原糖含量, 以热失活的酶活做对照。
2 结果与分析
2.1 菌落直径和变色圈直径的比值测定(dl/d2)
利用选择性培养基筛选产生变色圈的菌株, 发
现共有 12株菌株产生变色反应, 其中有 9株菌落直
径小于变色圈直径。标准菌株在选择性培养基上不
生长, 也不产生变色圈, 而部分菌株不能在选择性
培养基上生长, 但可以产生变色圈(部分菌株接种的
当天即可产生变色圈)。本试验测定了 14 株供试菌
株的菌落和变色圈直径, 并计算其比值, 结果见表 1
和图 1。
由表 1可知, 在选择性培养基上生长 2 d后, 各
菌株在培养基上的生长差异明显, 菌落直径从 0.50
cm到 3.30 cm不等。在供试菌株中, P. chrysosporium
RP-78和BKM-F-1767既没有生长, 也没有产生变色
圈 , 分析原因 , 可能是该菌株属于共生菌 , 生长需
要特殊条件, 由于培养基条件不适合, 没有生长。除
平菇 10969 外, 其他菌在选择性培养基上也不能生
长, 但可以产生变色圈, 且所产生的变色圈大小有
所不同。dl/d2 的值均不大于 1, 但在平板上的生长
能力相差很大, 其中只有平菇 10969 在选择性培养
基内长势很好, 一周内即将长满平板, 菌落形态也

表 1 菌落直径(d1)、变色圈直径(d2)及其比值(d1/d2)
Tab. 1 Colony diameter (d1), photochromic laps (d2),
and their ratio (d1/d2)
供试菌株
Strain
菌落直径
d1 (cm)
变色圈直径
d2 (cm)
菌落直径/变色圈直径
d1/d2
RP-78 − − −
BKM-F-1767 − − −
Po10969 3.30 4.33 0.762Bc
PcR 0.50 2.20 0.227Cde
Pc 0.50 2.13 0.234Cde
Au193 0.50 2.10 0.238Cde
Au2811 0.50 2.10 0.238Cde
Lc2141 0.50 0.50 1.00Aa
Lc26 0.50 0.50 1.00Aa
Lc236 0.50 0.50 1.00Aa
Gu0801 0.50 2.55 0.196Cde
WP0014 0.50 2.54 0.197Cde
WP1 0.50 2.80 0.178Ce
Ag96 0.50 1.85 0.270Cd
− 指不生长或未检测, d1 为 0.50 表示没有生长; 数值后不同大
写字母表示差异极显著(P<0.01), 小写字母表示差异显著(P<0.05)。
− represents not growing or detection; d1 equal to 0.5 means no growing;
Values followed by different capital letters are extremely significantly
different (P<0.01), and by small letters are significantly different (P<0.05).


图 1 菌株在 3种培养基上筛选的部分结果图
Fig. 1 The partial pictures of the strains on three different medium
A 表示选择性培养基, 菌株编号 1为 P. chrysosporium BKM-F-1767, 2为 Po19696, 3 为 WP1, 4为 Lc26, 下同; B 表示苯胺兰培养基, C
表示鞣酸固体培养基。A represents selective medium, Strain No.1 represents P.chrysosporium BKM-F-1767, Strain No.2 represents Po19696, Strain
No.3 represents WP1, Strain No.4 represents Lc26, the same No. as below. B represents aniline medium, C represents tannic acid medium.
第 5期 林 玲等: 木质素降解菌的筛选及其纤维素酶基因克隆表达研究 941


十分规则, 其他菌株未表现出生长优势。
2.2 苯胺兰固体培养基和鞣酸固体培养基的筛选
将产生变色反应的 12 株菌株转接到苯胺兰固
体培养基筛选, 发现 8 株菌落外脱色圈形成的情况,
BKM-F-1767 生长速度最快, 4 d 就能长满培养皿,
蓝色的苯胺兰退色快, 并且脱色圈比较大。同时, 将
在苯胺兰固体培养基上使苯胺兰脱色的菌株再转接
到鞣酸固体培养基, 结果发现, 8株均能产生阳性反
应(+), 部分结果见图 1。
2.3 木质素降解
木质素降解结果见表 2, 综纤维素降解结果见
表 3。由表 2可知, P. chrysosporium BKM-F-1767的
木质素降解率最高, 在 15 d 的培养中, Klason 木素
的降解率达到 13.51%; 其次是平菇 10969, 而香菇
2141、树舌 WP1、黄平菇等降解率在 9%左右; 毛木
耳 193木质素降解率最低, 只有 1.12%。从总体上看,
大多数菌的木素降解能力相差不十分明显, 由于多
数菌都选择性地降解木质素, 故降解能力相差不大,
多数在 10%左右波动, 优先降解综纤维素的菌株也
表现出很强的木质素降解能力, 如树舌 WP1, 木质
素降解能力达 9.59%, 可见对木质素的降解能力与
选择性无关。
由表 3 可知, 不同白腐菌的综纤维素降解能力
不同, 在供试菌株中, 树舌 WP1 对综纤维素降解能
力最强, 达 14.70%; 灵芝Gu0801最低, 只有 6.32%。
选择性降解综纤维素的菌株也表现了一定优势; 供
试菌株综纤维素降解能力大体上可分为几个不同的
区段, 降解率较低的有伏芩、灵芝 Gu0801, 降解率
在 6%左右; 降解能力中等的是香菇 2141、黄平菇,
降解率在 9%左右; 降解能力较强的是树舌 WP1、平
菇 10969、姬平菇, 降解率在 10%以上。
从以上结果可以看出, 供试菌株对稻草的降解
能力存在一定差异, 所选菌株都有不同程度的木质
素降解能力, 同时也会使综纤维素发生降解。

表 2 不同白腐菌菌株处理前后木质素的变化
Tab. 2 Change of Klason lignin before and after treated with different strains of white rot fungi
菌株
Strain
菌草初重
Weight of grasses before
treatment (g)
G11)(g) G22)(g)
减重
Decreasing
weight (g)
木质素含量
Content of Klason
lignin (g·kg−1)
降解率
Degradation ratio
(%)
对照 CK 2.01 70.84 69.94 0.90 447.8 −
BKM-F-1767 2.04 70.63 69.84 0.79 387.3 13.51Aa
LC2141 2.05 71.18 70.35 0.83 404.9 9.58Cc
PcR 2.02 70.91 70.06 0.85 420.8 6.03Dd
Pc 2.02 70.39 69.56 0.83 410.9 8.24Cc
P0 10969 2.04 71.23 70.42 0.81 397.1 11.33Bb
WP1 2.05 71.45 70.62 0.83 404.9 9.59Cc
Au193 2.01 71.84 70.95 0.89 442.8 1.12Gg
Au2811 2.05 71.18 70.32 0.86 419.5 6.32Ee
Gu0801 2.04 71.12 70.24 0.88 431.4 3.67Ff
Pc05116 2.01 70.77 69.91 0.86 427.9 4.44Ee
1) G1指未经白腐菌处理草粉中 Klason木素的含量与砂芯漏斗重量之和; 2) G2 指经白腐菌处理草粉中 Klason 木素的含量与砂芯漏斗重
量之和。G1 represents the weight of Klason lignin in the grasses before treated with white rot fungi plus the weight of the sand core funnel; G2
represents the weight of Klason lignin in the grasses after treated with white rot fungi plus the weight of the sand core funnel.

表 3 不同白腐菌菌株处理前后综纤维素含量的变化
Tab. 3 Change of holocellulose before and after treated with different strains of white rot fungi
菌株
Strain
菌草初重
Weight of grasses
before treatment (g)
G11)(g) G22)(g)
减重
Decreasing
weight (g)
综纤维素含量
Content of holocellulose
(g·kg−1)
降解率
Degradation ratio
(%)
对照 CK 2.02 50.78 49.48 1.30 643.60 —
BKM-F-1767 2.05 50.85 49.66 1.19 580.50 9.81Dd
LC2141 2.02 50.54 49.36 1.18 584.20 9.23Cc
PcR 2.01 74.50 73.34 1.16 577.10 10.33Bb
Pc 2.02 51.29 50.11 1.18 584.16 9.24Cc
Po 10969 2.06 74.47 73.31 1.16 563.10 12.51Bb
WP1 2.04 50.53 49.41 1.12 549.02 14.70Aa
Au193 2.04 74.58 73.38 1.20 588.23 8.60Ee
Au2811 2.05 74.65 73.43 1.22 595.12 7.53Ff
Gu0801 2.04 74.41 73.18 1.23 602.94 6.32Gg
Pc05116 2.08 51.09 49.84 1.25 601.00 6.62Hh
1) G1指未经白腐菌处理草粉中综纤维素的含量与砂芯漏斗重量之和; 2)G2指经白腐菌处理草粉中综纤维素的含量与砂芯漏斗重量之和。
G1 represents the weight of holocellulose in the grasses before treated with white rot fungi plus the weight of the sand core funnel. G2 represents the
weight of holocellulose in the grasses after treated with white rot fungi plus the weight of the sand core funnel.
942 中国生态农业学报 2009 第 17卷


2.4 选择性指数(SF)计算
各菌株 SF 指数计算结果(表 4)表明, 高效木质
素降解菌不仅要求菌株对木质素的降解率高, 且应
尽可能少地破坏综纤维素。通过对选择性指数的计
算, 可以看出 BKM-F-1767 选择性指数最高, 达 1.38,
香菇 2141达 1.04, 其他菌株都在 1以下。可见虽然
木质素降解能力相差不大, 但综纤维素的降解能力
决定了选择性指数的高低。从高效木质素降解菌的角
度考虑, 树舌WP1和平菇 10969应是理想的菌株。
2.5 克隆载体的构建
根据 T 载体上目的基因的序列, 合成两对引物,
PCR 扩增(图 2), 回收试剂盒进行回收后, 连接到
pMD 18-T载体, 转化大肠杆菌DH5a, PCR和酶切验
证。选择 pET-28a为原核表达载体, 并分别以 BamHⅠ
和 HindⅢ作为上、下游酶切位点。将纤维素(egl2)
的 ORF 片段克隆到表达载体 pET-28a 以研究 Egl2
蛋白的特性。
2.6 蛋白的表达及酶谱分析
根据 DNAman 的预测结果, egl2 开放阅读框
编码的蛋白大小约 42.1 kDa, 再加上表达载体上的

表 4 SF指数计算
Tab. 4 The result of selective factor
菌种
Strain
木质素降解率
Degradation
ratio of Klason
lignin (%)
综纤维素降解率
Degration ration of
holocellulose (%)
SF指数
Selective
factor
BKM-F-1767 13.51 9.81 1.38
Lc2141 9.58 9.23 1.04
PcR 6.03 10.33 0.58
Pc 8.24 9.24 0.89
Po 10969 11.33 12.51 0.91
WP1 9.59 14.70 0.65
Au193 1.12 8.60 0.13
Au2811 6.32 7.53 0.84
Gu0801 3.67 6.32 0.58
Pc05116 4.44 6.62 0.67


图 2 PCR验证扩增 egl2基因
Fig. 2 PCR result of egl2
M: DL2000 marker; 泳道 1和 2: PCR产物; 泳道 3: 阴性对照。
M: DL2000 marker; Lane 1, 2: Product of the PCR; Lane 3: Negative
control.
His-tag, 融合蛋白分子量分别约为 45.7 kDa。试验结
果证明, 本研究成功地构建了 pET28a-egl2 原核表
达重组子。在诱导后 2 h开始取样, 都可以获得较好
的结果(图 3)。但 Egl2蛋白均在胞内形成包涵体, 酶
活性检测表明形成包涵体的蛋白质没有酶活性。将
细胞超声波破碎之后, 用 6 mol·L−1的尿素溶解包
含体, 并用 Ni柱分离纯化(图 3)。但变性蛋白经过分
离纯化与复性, 只能部分恢复其酶学功能(图 4)。
2.7 综纤维素的降解
通过上面试验中的蛋白表达及酶活检测, 表明
表达的纤维素酶经复性后具有酶活。为比较哪种纤
维素材料易被纤维素酶和半纤维素酶水解, 试验以
白腐菌处理的菌草, 亚氯酸钠处理的菌草和未处理
的菌草为原料, 用该酶的粗酶液 30 ℃处理 24 h, 测
定其还原糖含量, 结果见表 6。


图 3 Egl2蛋白质 SDS-PAGE电泳结果
Fig. 3 SDS-PAGE analysis of Egl2 protein
M: 蛋白 Marker; 泳道 1: 诱导转化子 pET28a-egl2/BL21(DE3)
包涵体蛋白; 泳道 2: 未诱导转化子 pET28a-egl2/BL21(DE3)包涵体
蛋白; 泳道 3: 纯化的 Egl2蛋白; 泳道 4: 诱导转化子 pET28a /BL21
(DE3)不可溶蛋白。M: Protein marker; Lane 1: Proteins from insoluble
fractions of pET28a-egl2/BL21(DE3) with induction; Lane 2: Negative
control [proteins from insoluble fractions of pET28a-egl2/BL21(DE3)
without induction]; Lane 3: Purified Egl2 from insoluble fractions of
pET282a-egl2/BL21(DE3); Lane 4: Proteins from insoluble fractions of
pET28a /BL21(DE3) with induction.


图 4 复性前后酶活测定
Fig. 4 Enzyme activity with refolding proteins or unfold proteins
管 1: 复性的重组蛋白; 管 2: 未复性的重组蛋白; 管 3: 失活的
酶液对照。Eppendorf 1: Refolding proteins of recombination; Eppen-
dorf 2: Unfolding proteins; Eppendorf 3: Negative control with boiled
proteins.
第 5期 林 玲等: 木质素降解菌的筛选及其纤维素酶基因克隆表达研究 943


表 6 纤维素酶处理不同纤维素材料的效果
Tab. 6 Result of various cellulose treated with cellulase
样品
Sample
还原糖含量
Contents of reducing sugars (mg·mL−1)
1 1.268±0.014Aa
2 0.827±0.028Bb
3 0.543±0.02Cc
1指巨菌草经 NaClO2处理; 2指巨菌草经平菇 10969处理; 3指
未处理的巨菌草; 还原糖浓度以木糖含量计算。数据后不同大写字
母表示差异极显著(P<0.01), 不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。1
represents Juncao P. sinese Roxb treated with NaClO2; 2 represents
Juncao P. sinese Roxb treated with Po10969; 3 represents Juncao P.
sinese Roxb without treated. Content of reducing-sugars is measured by
the strandary curve of xylose. Values followed by different capital
letters are extremely significantly different (P<0.01), and by small
letters are significantly different(P<0.05).

3 讨论
由于木质素结构的复杂性, 许多木质素降解的
研究集中在利用木质素类典型化合物, 这类化合物
具有木质素的某些特定结构, 包括单聚物香草酸、
愈创木酚、苯酚、磷甲基苯酚等。本试验选用相对
便宜的愈创木酚为惟一碳源的选择培养基, 从供试
菌株中分离到 12株能产生变色圈的菌株。又将这些
菌株分别接种于苯胺兰及鞣酸初筛平板。在菌株筛
选的定性试验中, 通过比较变色圈直径和菌落直径
的大小来判断对木质素的优先降解能力。通过三轮
培养基筛选后, 对部分供试菌株进行复筛, 以木质
素降解试验测定对木质素、综纤维素降解能力, 并
通过计算一定时间内木质素和综纤维素失重的比值
(SF 指数), 作为筛选高效木质素降解菌的依据。在
定量试验中 , 各菌株对稻草的降解能力相差较大 ,
BKM-F1767 选择性指数最高 , 达到 1.38, 而香菇
2141 达到 1.04, 其他都在 1 以下。可见虽然木素降
解能力相差不大, 但综纤维素的降解能力决定了选
择性指数的高低。从高效木质素降解菌的角度考虑,
树舌 WP1和平菇 10969应是理想的菌株。
通过 PCR扩增里氏木霉纤维素的编码基因 egl2,
连接到 pET-28a 载体上 , 再转化到 E. coli BL21
(DE3)宿主菌中。将阳性克隆子用 IPTG进行诱导表
达, 结果表明: 纤维素酶的表达会在大肠杆菌中形
成无活性的包涵体; 利用亲和纯化技术纯化出目的
蛋白并进行复性后 , 所得纤维素酶具有一定的活
性。egl2部分片段基因编码的蛋白形成疏水性氨基
酸过多, 占总氨基酸残基的 30%, 真核纤维素酶为
胞外酶, 把内切葡聚糖酶基因克隆在大肠杆菌中表
达, 可能缺少一些加工修饰, 如糖基化位点的修饰
或磷酸化修饰等 , 进而影响重组蛋白的活性 , E.
coli中加入少量诱导剂 IPTG能诱导 Egl2蛋白的大
量表达, 细胞形成包涵体, 以使细胞免于被毒害。
经白腐菌预处理的纤维材料是否有利于纤维素
酶和半纤维素酶对其水解, 试验测定了 3 种不同处
理的纤维材料, 其还原糖含量为综纤维素(酸解)>菌
草(白腐菌处理)>未处理菌草。可能原因一是白腐菌
对木质素的降解率不及化学方法; 二是白腐菌非选
择性地降解纤维材料; 三是白腐菌处理过的菌草带
有一些来源于白腐菌的胞外分子, 这些分子可能影
响了酶活性。白腐菌是迄今为止最有效、最主要的
木质素降解微生物, 降解木质素可以分为选择性和
非选择性两种, 在选择性降解菌种中, 其对木质素
和半纤维素的降解比对纤维素降解的比率大, 而在
非选择性降解菌种中, 木质素、纤维素和半纤维素
都被等量降解。
参考文献
[1] Kishi K., Hildebrand D. P., Kusters-van Someren M., et al.
Site-directed mutations at phenylalanine-190 of manganese
peroxidase: Effects on stability, function, and coordination[J].
Biochemistry, 1997, 36(14): 4268−4277
[2] Li D., Alic M., Brown J. A., et al. Regulation of manganese
peroxidase gene transcription by hydrogen peroxide, chemical
stress, and molecular oxygen[J]. Applied and Environmental
Microbiology, 1995, 61(1): 341−345
[3] Beguin P., Aubert J. P. The biological degradation of cellu-
lose[J]. FEMS Microbiol. Rev., 1994, 13(1): 25−58
[4] Eriksson K. E., Pettersson B., Westermark U. Oxidation: An
important enzyme reaction in fungal degradation of cellu-
lose[J]. FEBS Lett., 1974, 49(2): 282−285
[5] Westermark U., Eriksson K. E. Carbohydrate-dependent en-
zymic quinone reduction during lignin degradation[J]. Acta
Chem. Scand. B, 1974, 28: 204−208
[6] Ayers A. R., Ayers S. B., Eriksson K. E. Cellobiose oxidase,
purification and partial characterization of a hemoprotein
from Sporotrichum pulverulentum[J]. FEBS Journal, 1978,
90(1): 171−181
[7] 郁红艳, 曾光明, 黄国和, 等. 木质素降解真菌的筛选及产
酶特性[J]. 应用与环境生物学报, 2004, 10(5): 639−642
[8] 张业录, 赵华. 木素降解菌的筛选和氯酚生物降解研究[J].
天津轻工业学院学报, 2000 (4): 17−21
[9] 邓勋. 几种食用菌菌株对稻草的生物降解研究[D]. 哈尔滨:
东北林业大学, 2004
[10] 张龙翔 , 张庭芳 , 李令媛 . 生化实验方法与技术(第 2 版)
[M]. 北京: 高等教育出版社, 1997
[11] 靖德兵 , 李培军 , 孙铁珩 , 等 . 黑曲霉固体发酵生产纤维素
酶培养基构成优化研究[J]. 中国生态农业学报, 2004, 12(3):
172−174