全 文 ：＊国家自然科学基金资助项目(No.39430020)、广东省自然科学基金(No.960388)、制浆造纸工程国家重点实验室
和纤维素化学开放实验室资助项目
＊＊通讯联系人
收稿日期:1997-04-14 ,修回日期:1998-07-17
贝壳状革耳菌和黄孢平革菌固体培养酶系比较＊
王彩华　余惠生＊＊　付时雨
(中国科学院广州化学研究所　广州　510650)
提　要　白腐菌黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)与贝壳状革耳菌(Panus conchatus)
在类似自然状态的固体培养条件下酶的分泌情况有较大差异。 P.conchatus和P .chrysospo-
rium 的主要木素降解酶分别是漆酶和锰过氧化物酶;两种菌均产生较高水平的木聚糖酶;P.
conchatus在整个培养过程中所产生的内切葡聚糖酶 、微晶纤维素酶和纤维二糖酶活力均比
P.chrysosporium 相应酶的活力低得多 , 尤其是内切葡聚糖酶。研究结果初步揭示了 P .con-
chaus降解木素的主要酶系及选择性降解木素的原因。
关键词　白腐菌 ,木素降解酶 , 半纤维素酶 ,纤维素酶
分类号　Q939.5　文献标识码　A　文章编号　0001-6209(1999)02-0127-31
　　木素的降解是植物纤维生物转化与利用的关键。迄今为止 ,降解天然木素最有效的
微生物是白腐菌 ,但对木质纤维素生物降解的微观形态变化的研究表明 ,绝大多数白腐
菌 ,如黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium),在降解木素的同时 ,也使纤维细胞壁变
薄 、纤维素被严重降解[ 1～ 2] 。我们的前期工作表明 ,白腐菌贝壳状革耳菌(Panus concha-
tus)可以非常有效地降解草中的木素 ,同时选择性地进攻木素最集中的胞间层 ,使纤维保
持完整地彼此分离。对脱木素后草中纤维素的聚合度测定也表明 ,没有明显的纤维素降
解发生[ 3] 。为探究 P .conchatus能选择性降解木素的原因 ,同时了解该菌的主要木素降
解酶 ,我们检测了此菌种在固体培养过程中酶的分泌情况 ,并与国际上研究最多的 P .
chrysosporium 进行了对比 。
1　材料和方法
1.1　菌种
白腐菌 P.conchatus 从腐朽的松树分离 , P .chrysosporium BMK-F-1767由 Hattaka
A.赠送。两种菌经液体培养后制成菌丝悬浮液备用。
1.2　固体培养
经粉碎的稻草以每瓶 10g 分装于 300 mL 三角瓶内 ,在 120℃下灭菌 30min ,接种 ,混
匀后在 39.5℃静止培养。
1.3　酶液的制备
在稻草发酵过程中 ,取出不同时间发酵样品 ,挤出发酵液 ,然后用水洗三次 ,使酶液总
39 卷　2期
1999 年 4 月
微 生 物 学 报
Acta Microbiologica Sinica
Vol.39
April
　No.2
1999
DOI :10.13343/j.cnki.wsxb.1999.02.006
体积约 100mL。经离心(3500r/min ,15min)后 ,取上清液用于测酶活 。
1.4　酶活力的测定
1.4.1　木素降解酶活力测定:(1)漆酶:用等体积 0.5mmol/ L 2 , 2′-连氮-二(3-乙基苯并
噻唑-6-磺酸)(简称ABTS)溶液和酶液反应 ,测定反应前 3min内反应液在 420nm 处吸光
值的增加 ,每分钟使 1μmol ABTS转化所需的酶量为一个活力单位(U)[ 4] ;(2)锰过氧化
物酶:反应混合液包括 3.4mL 0.11mol/L 乳酸钠缓冲液(pH4.5), 0.1mL 40mmol/L Mn-
SO4 溶液和 0.4mL 酶液 ,加入 0.1mL 1.6mmol/L H2O2溶液启动反应 ,测定 240nm 处反
应液的吸光值的增加 ,定义每分钟使 1μmol M n2+氧化成 Mn3+所需的酶量作为一个酶活
单位[ 5] ;(3)木素过氧化物酶:反应混合液含 0.125 mol/ L 酒石酸钠-盐酸缓冲液
(pH3.5),2.5 mmol/L 藜芦醇 ,0.5 mmol/L H2O2 和适量酶液 ,测定酶反应前 3min内在
310nm处吸光值的增加 ,定义每分钟使 1μmol藜芦醇氧化所需的酶量为一个活力单位
(U)[ 6] 。
1.4.2　半纤维素酶活力测定:主要检测了木聚糖酶的活力 ,方法如下:取 0.1mL 适当稀
释的酶液 ,加 1mL 用 0.1mol/L pH4.8醋酸缓冲液配制的 1%木聚糖(Sigma oat spelts xy-
lan)溶液 ,50℃酶解 30min ,用 DNS法测定还原糖(以木糖计)[ 7] 。定义每分钟释放 1μmol
还原糖(以木糖计)所需的酶量为一个活力单位(U)。
1.4.3　纤维素酶活力测定:内切葡聚糖酶(EG)活力以羧甲基纤维素(CMC)为底物测
定[ 8] ;微晶纤维素酶活力以微晶纤维素(Avicel)为底物测定[ 9] ,纤维二糖酶(Cellobiase)活
力测定遵照 IUPAC Bio technology commission推荐方法[ 10]进行。
2　结果和讨论
2.1　木素降解酶
白腐菌 P .conchatus 和 P.chrysosporium 在固体培养条件下产生木素降解酶的情况
如图 1所示 。在三种木素降解酶(漆酶 Laccase、木素过氧化物酶 Lip和锰过氧化物酶
MnP)中 ,漆酶在 P .conchatus接种 3d后的整个培养过程中都有产生 ,其活力在培养 22d
时达到最高 ,此后持续保持在较高水平;锰过氧化物酶则在培养至 8d时才检测到 ,其活力
相对很低 ,并在培养 26d后降至零;木素过氧化物酶则在整个培养过程中都未检测到 。这
说明漆酶是 P .conchatus在固体培养条件下的主要木素降解酶。而在 P .chrysosporium
培养过程中 ,检测到较高的锰过氧化物酶活力 ,但整个过程未能检测到漆酶与木素过氧化
物酶 。这一结果表明两种菌在固体培养条件下产生的木素降解酶系有很大差异 。
2.2　半纤维素酶
因为稻草中半纤维素主要是木聚糖 ,所以检测半纤维素酶时主要检测了木聚糖酶 。
我们发现在两种菌的培养过程中均有大量木聚糖酶产生 ,其中 P .chrysosporium 产生的
木聚糖酶活力较高(图 2)。由于稻草中大部分木素是与半纤维素有化学键连结 ,组成木
素-碳水化合物复合体(LCC)[ 11] ,半纤维素酶可催化水解复合体的碳水化合物部分 ,有利
于复合体的溶出 。因此 ,半纤维素酶(主要是木聚糖酶)在微生物脱木素过程中可能起着
重要的作用。
128 微　　生　　物　　学　　报 39 卷
图 1　P.conchatus和P .chrysosporium 在固
体培养条件下木素降解酶的产生
Fig.1　Lignin-degrading enzymes produced by P.
concha tus and P.chrysosporium in solid state cul tures
1.Laccase of P.conchatus;
2.MnP of P.chrysospor ium;
3.MnP of P.conchatus.
图 2　P.conchatus和P.chrysosporium 在固体
培养条件木聚糖酶的产生
F ig.2　Xy lanases Produced by P.conchatus and
P.chrysosporium in solid state cultures
1.Xy lanase of P .cochatus;
2.Xy lanase of P .cochatus.
2.3　纤维素酶
P .chrysosporium 在降解植物中木素的同时也引起纤维素严重降解 ,而 P .conchatus
则能高效降解草类木素而很少损伤纤维 ,直到生物作用的后期 ,纤维次生壁木素被降解 ,
而纤维乃至纤维中的微细纤维依然相当完整[ 3] 。用纤维素酶 、特别是内切葡聚糖酶处理
纸浆 ,浆的粘度下降十分剧烈 ,纸张强度被严重破坏[ 12] 。因此 ,在微生物脱木素过程中 ,
纤维素酶 ,尤其是内切葡聚糖酶 ,其活力直接关系到纤维素的降解。
我们对两个菌种在整个培养过程的三种纤维素酶(内切葡聚糖酶 、微晶纤维酶和纤维
二糖水解酶)的酶活力进行了检测 ,发现两种菌在纤维素酶 ,特别是内切葡聚糖酶的产生
上存在差异。P .chrysosporium 产生的内切葡聚糖酶(EG)的活力较高 ,特别是在后期(培
养 18d后),内切葡聚糖酶活力尤高 。此时 ,木质纤维素物料(稻草)中的木素已经有较大
的降解 ,纤维素裸露 ,内切葡聚糖酶对纤维的损伤更显严重;而与之相比 , P.conchatus在
整个培养过程中分泌的内切葡聚糖酶活力均低得多 ,而且到培养后期酶活依然保持着很
低的水平 ,这意味着对纤维素的降解和损伤非常低微(图 3)。另外 ,两种菌产生的微晶纤
维酶和纤维二糖酶活力均较低 , P.conchatus分泌的此二种酶的活力更低(图 4 、5)。
上述研究结果进一步证实了电子显微镜的观测结果 ,并从两种菌分泌纤维素酶的角
度进一步说明白腐菌 P.conchatus对木素降解有更强的选择性 ,同时显示了这株菌种所
具有的应用前景 。
1292 期 王彩华等:贝壳状革耳菌和黄孢平革菌固体培养酶系比较
图 3　P.conchatus和P .chrysosporium 在固
体培养条件下内切葡聚糖酶的产生
Fig.3　Endo-glucanases(EG)produced by P.concha-
tus and P.chrysosporium in solid state cultures
1.EG of P.conchatus;
2.EG of P.chrysosporium.
图 4　P.conchatus和P.chrysosporium 在固体
培养条件下微晶纤维素酶的产生
Fig.4　Avicelase produced by P.conchatus and
P.chrysospor ium in solid state cultures
1.Avicelase of P.conchatus;
2.Avicelase of P.chrysospor ium.
图 5　P.conchatus和 P.chrysosporium 在固体培养条件下纤维二糖酶的产生
Fig.5　Cellobiase produced by P.conchatus and P.chrysospor ium in solid state cultures
1.Cellobiase of P.conchatus;　2.Cellobiase of P.chrysospor ium.
　　木素降解酶属于次生代谢酶 ,在木质纤维中木素的降解 ,乃至木素降解酶的产生往往
发生在接种培养后几天(图 1),而纤维素酶及半纤维素酶则在培养后随即产生 ,且达到较
高的水平(图 2 ～ 5)。可以推断 ,白腐菌代谢木质纤维素首先利用一些容易利用的碳源 ,
当简单的碳源及半纤维素和纤维素有一定的降解后 ,木素的存在开始阻碍半纤维素和纤
维素进一步降解时 ,木素降解酶开始产生。
130 微　　生　　物　　学　　报 39 卷
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COMPARISON OF LIGNOCELLULOLYTIC ENZYME PROFILES
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CHRYSOSPORIUM DURING SOLID STATE CULTURES
Wang Caihua　Yu Huisheng　Fu Shiyu
(Guangzhou Inst itute of Chem istry , Chinese Academy of Sciences , Guangzhou　510650)
Abstract　Most of white-rot fungi , such as Phanerochaete chrysospor ium , can cause severe concomi-
tant cellulose degradation during biodegradation of lignocellulose.Panus conchatus , a white-rot fun-
gus , can cause efficient delignification of st raw with only limited concomitant cellulose degradation.
The results in comparison of lignocelluloly tic enzyme profiles secreted by P.conchatus and P.
chrysosporium during solid state cultures have shown that laccase and Mn-dependent peroxidase are
main lignin-degrading enzymes of these two fungi respectively;high activities of xylanase are secreted
by both fungi;and much lower activities of cellulases i.e.endo-glucanase , avicelase and cellobiase ,
especially endo-glucanase , are produced by P.conchatus during the whole cultures.The results fur-
ther confirm that Panus conchatus has ability of strong selective delignification of lignocellulose
Key words　White-rot fungus ,Lignin-degrading enzyme , Hemicellulase ,Cellulase
131
Prodect Granted by Chinese National Natu ral Science Fund(No.39430020), Guangdong Province Sclence Foundation(grant No.960388), State Key Laboratory of Pulp and Paper Engdneering Foundat ion , Laboratory of Cellulose and LIgno-
cellulosic s Foundation for suport this research.
2 期 王彩华等:贝壳状革耳菌和黄孢平革菌固体培养酶系比较