全 文 ：中国生态农业学报 2010年 5月 第 18卷 第 3期
Chinese Journal of Eco-Agriculture, May 2010, 18(3): 548−555


* 新疆维吾尔自治区成果转化项目(200654101)、新疆维吾尔自治区科技攻关项目(200531101)和新疆农业科学院院长基金项目(2007Y07)资助
范咏梅(1968~), 女, 研究员, 主要从事园艺作物病害研究。E-mail: yongmeifan@126.com
收稿日期: 2009-05-08 接受日期: 2009-09-06
DOI: 10.3724/SP.J.1011.2010.00548
新疆灰霉病菌多态性及其致病力分化分析*
范咏梅 1 陈林凤 1,2 郝敬喆 1 竞中梅 3
(1. 新疆农业科学院植物保护研究所 乌鲁木齐 830091; 2. 新疆农业大学农学院 乌鲁木齐 830052;
3. 吐鲁番地区农业技术推广中心 吐鲁番 835000)
摘 要 灰霉病菌(Botrytis cinerea)是引起植物病害的重要病原。本研究将来自新疆 3 个主要生态区域的 12
个灰霉病菌菌株, 经人工接种于 7个寄主的离体叶片上测定病原菌的致病性, 并采用 RAPD技术分析了 12个
菌株的遗传多态性。研究结果表明, 12个灰霉菌株的致病力存在明显差异, 可分为强、中、弱 3种致病型, 其
中来自和田的黄瓜灰霉菌和伊犁特克斯的番茄灰霉菌致病力最强; 阿克苏番茄灰霉菌的致病力最弱。根据在
不同寄主上的致病反应, 12个菌株被划分为 4个菌群。RAPD分析结果表明, 在 0.65阈值下, 12个灰霉菌株可
分为 4 个菌群, 说明供试灰霉菌株间有高度的遗传分化。灰霉病菌致病力强弱与菌株寄主、地理位置均无直
接相关性, 但灰霉菌株的遗传距离与菌株来源存在明显相关性。
关键词 灰霉菌 致病力分化 RAPD分析 DNA多态性 遗传分化 遗传距离
中图分类号: S436.412.1 文献标识码: A 文章编号: 1671-3990(2010)03-0548-08
Polymorphism analysis of Botrytis cinerea and its pathogenicity
differentiation in Xinjiang
FAN Yong-Mei1, CHEN Lin-Feng1,2, HAO Jing-Zhe1, JING Zhong-Mei3
(1. Institute of Plant Protection, Xinjiang Academy of Agricultural Science, Urumqi 830091, China;
2. College of Agronomy, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China;
3. Turpan Extension Center for Agricultural Techniques, Turpan 835000, China)
Abstract Botrytis cinerea is a pathogen for a variety of economically important plants grown in and out of glass greenhouses. 12
isolates of B. cinerea obtained from different hosts in three ecological regions of Xinjiang were artificially inoculated in in-vitro fresh
leaves of 7 hosts. The respective pathogenicities of the pathogens were then confirmed by lesion size. Using RAPD method, a genetic
diversity of 12 isolates was also analyzed. The results show significant difference in pathogenicity among the 12 isolates. The patho-
genicity types of the isolates are divided into strong, medium and weak. With a particular reference to Hetian cucumber grey mold
and Yili Tekesi tomato grey mold, pathogenicities of two isolates are strongest. The isolates which cause Akesu tomato grey mold has
the weakest pathogenicity. 12 isolates are divided into 4 groups based on cluster analysis of lesion size in inoculated leaves of differ-
ent hosts. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis shows that band patterns of the isolates are genetically different. 12
isolates are divided into 4 groups at a threshold of 0.65. Although no correlation exists among the pathogenicities, sampling sites and
sample hosts, some form of correlation is, however, noted between the sampling site and genetic distance.
Key words Botrytis cinerea, Pathogenicity differentiation, RAPD, DNA polymorphism, Genetic differentiation, Genetic
distance
(Received May 8, 2009; accepted Sept. 6, 2009)
灰霉病菌(灰葡萄孢, Botrytis cinerea Pers.)是重
要的植物病原菌, 属半知菌亚门葡萄孢属, 它引起
植物幼苗、果实及贮藏器官的猝倒、落叶、花腐及
烂果, 该病菌的寄主范围非常广泛, 可危害番茄、草
莓、黄瓜、葡萄、苹果等多种蔬菜、果树以及观赏
植物[1−3], 也是引起采后植物病害的重要病原[4−5]。灰
第 3期 范咏梅等: 新疆灰霉病菌多态性及其致病力分化分析 549


霉菌作为重要的农作物模式真菌被国内外广泛研ٛ
究[4], 由于杀菌剂(如二甲酰亚胺 Dicarbaoximide类)
的推广使用, 使灰霉病菌在田间产生了抗性。目前
灰霉病菌的抗性遗传研究报道较多, 研究结果表明
灰霉病菌基因组某一位点基因(如 Daf1)发生了突变,
也说明灰霉病菌的遗传变异发生比较频繁[1,5]。
灰霉病菌的致病力分化和遗传变异研究是有效
防治灰霉病的基础, 但前人多单一研究灰霉病菌的
致病性或者遗传性, 通常根据灰葡萄孢菌株在番茄
或葡萄果实上所致病斑的平均直径大小, 将供试菌
株致病力划分为强、中和弱 3种类型[6−7], 并认为菌
株致病力差异与菌株地域来源无明显相关 [6], 也与
地域及寄主无关[8]。Kerssies等[5]采用孢子采集器捕
捉了玫瑰种植空间的 30个灰霉菌株, 应用 RAPD方
法发现菌株之间存在明显的遗传分化 , 但在致病
力、采样时间、采样地点以及 RAPD 图谱之间未发
现相关性。而从病理学, 结合分子生物学技术综合
研究不同来源灰霉病菌的致病力及其相互间遗传关
系的研究较少。为探索不同寄主间灰葡萄孢的关系,
本试验采集新疆不同地区和不同寄主上的灰霉病菌,
采用致病性测定, 针对 7 个寄主研究灰霉病菌的致
病性, 应用 RAPD 技术分析了不同来源的灰霉菌株
遗传多态性, 以了解不同寄主间灰霉病菌致病力分
化和亲缘关系, 为生产上防治不同植物灰霉病提供
理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
采自新疆阿克苏、吐鲁番、和田、塔城、伊犁
等地的 6 种寄主植株灰霉病样, 经分离纯化鉴定共
得到 12株灰霉病菌(表 1)。
1.2 供试寄主
采用“津优 1 号”黄瓜、“美国极早白玉”西
葫芦、“999 希望大线椒”辣椒、“佳红 4 号”番
茄、“三生烟”烟草(Nicotiana tabacum L.)、“新屯
1号”草莓(Fragaria ananassa Drch.)、“克瑞森无核”
葡萄(Vitis vinifera L.)7种植物作为灰霉病菌致病性
测试的寄主。其中前 5种植物种子分别用 0.1%升汞
水消毒 5 min, 再用蒸馏水冲洗数次后催芽, 播种到
装有灭菌土的营养钵中, 在光照培养室 25 ℃恒温
培养, 幼苗长到 2 叶 1 心时均取第 1 片新鲜平展叶
片供接种用; 供试后 2 种植物新展开叶片则采自大
棚。
1.3 病菌的致病力测定
参照 Viaud 等[1]的离体叶片接种法: 在培养皿
内铺双层滤纸, 加少量水, 进行灭菌。剪取生长整齐
一致的各供试寄主幼苗的第 1 片平展真叶, 冲洗后
用 75%的酒精表面消毒 30 s, 用灭菌水冲洗 3遍, 待
吸干叶表水后, 展平铺到灭菌培养皿上。用直径为 3
mm 的打孔器在培养好的各地灰霉菌菌落边缘打取
菌饼, 反接于叶片的不同部位。每片叶接 4 块菌饼,
每个菌株在每个寄主上接 5 片叶, 对照接相同大小
的 PDA培养基块。接种后置于 25 ℃恒温光照培养
箱内, 3 d后调查发病情况。按照十字交叉法测量病
斑大小, 并根据各处理的病斑大小评价各菌株致病
力的差异。参照朱建兰等[9]的灰霉病斑调查方法, 其
分级标准为: 0级, 无症状或症状不明显; 1级, 形成
直径 2~5 mm(包含 2 mm)水渍状黄褐色病斑; 2 级,
形成直径 5~10 mm(包含 5 mm)水渍状黄褐色病斑; 3
级, 形成直径 10~15 mm(包含 10 mm)水渍状黄褐

表 1 灰霉菌菌株的编号、寄主及采集地
Tab. 1 Number, hosts and sampling places of Botrytis cinerea isolates in Xinjiang, China
序号
Number
菌株
Isolate
寄主
Host
采集地
Sampling place
生态区域
Ecological region
1 1)HH-a2) 黄瓜 Cucumis sativus L. 和田 Hetian 南疆 Southern Xinjiang
2 TuH-a 黄瓜 Cucumis sativus L. 吐鲁番 Turpan 东疆 Eastern Xinjiang
3 TH-a 黄瓜 Cucumis sativus L. 塔城 Tacheng 北疆 Northern Xinjiang
4 YHH-a 黄瓜 Cucumis sativus L. 伊犁霍城 Yili Huocheng 北疆 Northern Xinjiang
5 SP-a 葡萄 Vitis vinifera L. 鄯善 Shanshan 东疆 Eastern Xinjiang
6 TL-a 辣椒 Capsicum annuum L. 塔城 Tacheng 北疆 Northern Xinjiang
7 TX-a 西葫芦 Cucurbita pepo L. 塔城 Tacheng 北疆 Northern Xinjiang
8 TQ-a 茄子 Solanum melongena L. 塔城 Tacheng 北疆 Northern Xinjiang
9 AF-a 番茄 Lycopericon esculentum Mill. 阿克苏 Akesu 南疆 Southern Xinjiang
10 TuF-a 番茄 Lycopericon esculentum Mill. 吐鲁番 Turpan 东疆 Eastern Xinjiang
11 HF-a 番茄 Lycopericon esculentum Mill. 和田 Hetian 南疆 Southern Xinjiang
12 YTF-a 番茄 Lycopericon esculentum Mill. 伊犁特克斯 Yili Tekesi 北疆 Northern Xinjiang
1) HH、TuH、TH、YHH、SP、TL、TX、TQ、AF、TuF、HF、YTF是菌株的名称 HH, TuH, TH, YHH, SP, TL, TX, TQ, AF, TuF, HF, and
YTF are the names of the isolates. 2) “a”指在 24 h黑暗条件下培养 “a” indicates that the isolates are cultured under darkness absolutely for 24 h.
550 中国生态农业学报 2010 第 18卷



色病斑; 4级, 形成直径 15~20 mm(包含 15 mm)水渍
状黄褐色病斑; 5 级, 形成直径≥20 mm 水渍状黄
褐色病斑。
1.4 数据分析
采用 DPS统计软件对供试灰霉菌株引起的病斑
直径数据进行方差分析, 采用 Duncan’s 新复极差检
验(LSR test)进行多重比较。
1.5 病菌的 RAPD分析
1.5.1 DNA提取
针对供试新疆不同地区不同寄主的 12 株灰霉
病菌, 根据 Saghai等[10]和刘少华等[11]方法并略有改
进提取病原菌总 DNA, 具体方法如下: 用直径为 5
mm 的打孔器在病原真菌的菌落边缘打取菌盘, 放
入三角瓶中 , 每瓶接 4 块菌盘 , 在 23 ℃、130
r·min−1振荡培养 6 d, 然后用真空抽滤机收集各菌
株菌丝, 烘干后液氮速冻, −80 ℃下保存备用。称取
0.2~0.5 g菌丝, 加入液氮碾磨至粉状并装在 2 mL离
心管内, 加 800 µL提取 buffer (700 mmol·L−1 NaCl,
50 mmol·L−1 Tris-HCl、pH8.0, 10 mmol·L−1 EDTA,
1% CTAB, 1%巯基乙醇), 60 ℃水浴 45 min, 期间每
5 min 震荡 1 次, 取出冷却至室温, 加 800 µL 的氯
仿、异戊醇 (24∶1), 混匀 , 抽提 8 min, 12 000
r·min−1离心 10 min, 取上清液, 再加 800 µL氯仿、
异戊醇(24∶1)混匀, 抽提 5 min, 12 000 r·min−1离
心 10 min, 取上清液, 加等体积异丙醇, 混匀后于
−20 ℃冰冻 30 min。12 000 r·min−1离心 10 min,
弃上清, 70%乙醇洗沉淀 2 次, 干燥 5~10 min 后加
30 µL的 TE溶解沉淀, 然后加 Rnase(10 µg·µL−1)
2 µL, 37 ℃水浴 30 min后, 于−20 ℃保存备用。
1.5.2 PCR扩增
将提取的 DNA 用 DNA 浓度测定仪(Eppendorf
Bio Photometer)测定其浓度, 将其浓度稀释至 100
ng·µL−1作为模板 DNA。PCR反应所用随机引物(表
2)、Taq酶、dNTP均购自北京天根生工化技术有限
公司。
本研究采用 20 µL反应体系, 即 ddH2O 14.4 µL,
10×buffer (含 Mg+) 2 µL, dNTP(2.5 mmol·L−1) 1.6
µL, 引物(5 u)0.6 µL, Taq酶(2.5 u) 0.4 µL, 模板(100
ng·µL−1)1 µL。将反应管置于 PTC2200 型热循环
仪上进行热循环, 以合成新的 DNA片段。反应时首
先在 94 ℃下预变性 4 min, 再进入循环。循环的参
数设计为: 94 ℃变性 1 min, 36 ℃退火 1 min, 72 ℃
延伸 2 min, 共进行 45 个循环。最后 1 个循环完成
后在 72 ℃下延伸 5 min。反应结束后, 点样于 4.5%
的聚丙烯酰胺胶上电泳检测各菌株 DNA 谱带。在
280 V·cm−1、恒压下电泳, 当溴酚兰离凝胶前缘 2~3
表 2 RAPD分析所用引物及其序列
Tab. 2 Primers used in RAPD analysis and their sequences
引物编号
Primer code
序列
Sequence
S1 5′-GTAGACCCGT-3′
S2 5′-GGGATATCGG-3′
S3 5′-CCCAGCTGTG-3′
S4 5′-ACGGTACCAG-3′
S5 5′-AAGACCCCTC-3′
S6 5′-GGACAACGAG-3′
S7 5′-GGTGACGCAG-3′
S8 5′-TGGCCCTCAC-3′
OPF-01 5′-ACGGATCCTG-3′
OPF-02 5′-GAGGATCCCT-3′
OPF-04 5′-GGTGATCAGG-3′
OPF-05 5′-CCGAATTCCC-3′
OPF-06 5′-GGGAATTCGG-3′
OPF-08 5′-GGGATATCGG-3′
OPF-10 5′-GGAAGCTTGG-3′
OPF-11 5′-TTGGTACCCC-3′
OPF-12 5′-ACGGTACCAG-3′
OPF-13 5′-GGCTGCAGAA-3′
OPF-14 5′-TGCTGCAGGT-3′

cm 时停止电泳, 取出凝胶块放入脱色盘中, 加 200
mL 10%的乙醇和 1 mL 冰醋酸混匀, 水平摇动 3~5
min, 向脱色盘中加入 200 µL20%的AgNO3摇动 5~8
min, 倒掉脱色盘中的液体, 用蒸馏水冲洗 2~3 次,
倒掉蒸馏水, 加入 200 mL NaOH(3%)和 1 mL甲醛
(40%), 迅速混匀, 然后水平摇动 5~15 min至显影清
晰, 倒掉显影液体, 用蒸馏水冲洗 1~2次。扫描仪下
观察各菌株 DNA 片段带型并照相。试验共筛选 19
个引物, 每个引物至少重复两次。
1.5.3 PCR扩增结果分析
根据各引物扩增的电泳照片选择清晰且可重复
出现的条带记为 1, 同一位置不出现的为 0, 由此生
成 0 和 1 原始矩阵, 统计每个引物扩增出的总带数
和其中的多态性带数。采用 NTSYS PC(1992)分析软
件进行数据的综合分析。计算多态性百分率, 多态
性百分率=特征谱带数×100／总谱带数 (％ )。用
NTSYS-PC(2.02j)软件中的 SIMQUAL 程序计算
Jaccard遗传相似性系数(Genetic similarity, GS), 并
获得遗传相似系数矩阵。计算公式为:
GSij=2Nij/(Ni+Nj) (1)
式中, Nij指两个个体间共有的带数, Ni+Nj指两个个
体所有带数之和。用 NTSYS-PC(2.02j)软件中的
SAHN程序和 UPGMA(Unweighted pair group mean
average)方法进行聚类分析, 并通过 Tree plot 模块
生成系统树图。
第 3期 范咏梅等: 新疆灰霉病菌多态性及其致病力分化分析 551


2 结果与分析
2.1 不同菌株的致病力比较
12个灰霉菌株均在接种 24 h后开始发病, 形成
水浸状病斑或枯斑, 严重时使叶片被侵染部位呈褐
色, 表面着生白色的菌丝。但 12个菌株并不是对供
试所有 7 个寄主的叶片均表现很强的致病性, 同一
菌株在不同寄主叶片上形成病斑大小存在一定差
异。12个灰霉菌株在西葫芦、番茄及烟草叶片上更
容易形成水浸状的病斑, 形成侵染后, 病斑的扩展
速度也较快, 造成病斑周围衍生区域组织变黄, 但
病斑表面菌丝相对稀少, 而在辣椒、葡萄叶片上形
成水浸状病斑较少, 多形成枯斑, 病斑边缘比较明
显, 病斑扩展较慢, 但病斑表面的菌丝生长较旺盛
(图 1)。
根据灰霉菌株在不同寄主叶片上形成病斑的大
小, 将供试 12个菌株的致病力类型分为强、中、弱
3 种, 平均病斑大小在 3 级以上的菌株为强致病力,
平均病斑在 1 级以下的菌株为弱致病力, 平均病斑
在 2级的菌株为中等致病力。从试验结果(表 3)看, 12
个灰霉菌株中, 致病力强的菌株 4 个, 占总菌株数
的 33.3%; 对辣椒叶片致病力中等的菌株 8个, 占总
菌株数的 66.7%。对西葫芦叶片致病力强的菌株 11
个, 占总菌株数的 91.7%; 致病力中等的菌株 1 个,
占总菌株数的 8.3%。对黄瓜叶片致病力强的菌株 2
个, 占总菌株数的 16.7%; 致病力中等的菌株 6 个,
占总菌株数的 50%; 致病力弱的菌株 4 个, 占总菌
株数的 33.3%。对番茄叶片致病力强的菌株 9个, 占
总菌株数的 75%; 致病力中等的菌株 2 个, 占总菌
株数的 16.7%; 致病力弱的菌株 1个, 占总菌株数的
8.3%。对烟草叶片致病力强的菌株 4 个, 占总菌株
数的 33.3%; 致病力中等的菌株 7个, 占总菌株数的
58.3%; 致病力弱的菌株 1个, 占总菌株数的 8.3%。
对草莓叶片致病力强的菌株 1 个 , 占总菌株数的
8.3%; 致病力中等的菌株 10 个 , 占总菌株数的
83.3%; 致病力弱的菌株 1个, 占总菌株数的 8.3%。
对葡萄叶片致病力强的菌株 1 个 , 占总菌株数的
8.3%; 致病力中等的菌株 11 个 , 占总菌株数的
91.7%(表 3)。
总体而言, 采自和田的黄瓜灰霉菌和采自伊犁
特克斯的番茄灰霉菌的致病力最强, 它们对 4 种寄
主叶片(西葫芦、黄瓜、番茄、烟草)都有较强的致病
力; 采自阿克苏的番茄灰霉菌的致病力最弱, 它对
两种寄主叶片(番茄、烟草)致病力都为最弱。
2.2 灰霉病菌致病性与地理位置的关系
为更好地反映新疆主要农业生态区域灰霉病菌
的致病力分化特点, 分别在新疆 3 个主要生态区域
(南疆、北疆和东疆, 涉及 8个地区或市, 见表 1), 针
对新疆农业生产中主要种植作物及灰霉病菌危害的


图 1 12个灰霉菌株对辣椒(A)和西葫芦(B)叶片的致病性
Fig. 1 Pathogenicity of 12 isolates to the leaves of C. annuum (A) and C. pepo (B)
C图显示 12个菌株在 A图和 B图中的接种位置。C indicates the codes and inoculation positions of 12 isolates in Fig. A and B. 1, HH-a; 2,
TuH-a; 3, TH-a; 4, YHH-a; 5, SP-a; 6, TL-a; 7, TX-a; 8, TQ-a; 9, AF-a; 10, TuF-a; 11, HF-a; 12, YTF-a.
552 中国生态农业学报 2010 第 18卷


表 3 12株灰霉菌株对 7个寄主的致病性
Tab. 3 Pathogenicity of 12 B. cinerea isolates to 7 hosts
病斑直径 Lesion size (cm) 菌株
Isolate 辣椒
C. annuum
西葫芦
C. pepo
黄瓜
C. sativus
番茄
L. esculentum
烟草
N. tabacum
草莓
F. ananassa
葡萄
V. vinifera
YTF-a 1.46aA 1.80aA 1.04aA 1.18cdeBCD 1.18bB 0.88bcBC 0.68cdeBC
HF-a 1.36abA 2.05aA 0.62abcABC 1.44abcABC 1.18bB 0.50cdC 0.84bcdBC
AF-a 1.16abcA 1.93aA 0.58abcdABC 0.00gE 0.38bcB 0.70bcdBC 0.68cdeBC
TL-a 1.00abcA 1.60aA 0.14cdBC 1.10cdeBCD 0.72bcB 0.42dC 0.72cdeBC
TuH-a 0.98abcA 1.93aA 0.58abcdABC 1.00cdefCD 0.58bcB 0.74bcdBC 1.18aA
YHH-a 0.96abcA 1.90aA 0.66abcABC 1.34bcdABC 2.48aB 0.76bcdBC 0.84bcdBC
HH-a 0.96abcA 2.00aA 1.14aA 1.22cdeBC 0.96bcB 1.12abAB 0.94bAB
TuF-a 0.90bcA 1.55aA 0.34bcdABC 0.54fDE 0.58bcB 0.56cdBC 0.62eC
SP-a 0.86bcAB 1.73aA 0.42bcdABC 1.00cdefCD 0.72bcB 0.78bcdBC 0.78bcdeBC
TH-a 0.86bcAB 1.88aA 0.84abAB 1.86aA 0.96bcB 0.86bcBC 0.88bcBC
TX-a 0.82bcAB 1.70aA 0.56abcdABC 1.74abAB 1.22bB 0.70bcdBC 0.64deC
TQ-a 0.80cAB 0.78bB 0.00dC 0.80efCD 0.94bcB 0.64cdBC 0.66deBC
同行不同小写字母表示在 0.05水平差异显著, 不同大写字母表示在 0.01水平差异显著。Values with different small letters within the same
line are significantly different at 0.05 level, with different capital letters within the same line are significantly different at 0.01 level.

表 4 12株灰霉菌 DNA扩增产生的 RAPD位点统计结果
Tab. 4 Statistical results of RAPD bands amplified by DNA in 12 B. cinerea isolates
随机引物
Primer
RAPD位点
RAPD bands
多态性位点
Polymorphic bands
多态性位点频率
Percentage of polymorphic bands (%)
S1 11 11 100.0
S2 16 14 87.5
S3 21 14 66.7
S4 14 12 85.7
S5 11 10 90.9
S8 18 18 100.0
OPF-02 14 9 64.3
OPF-05 17 16 94.1
OPF-11 10 10 100.0
OPF-13 16 13 81.3
总计 Total 148 127 85.8

主要寄主, 采集分离了黄瓜、葡萄、辣椒、西葫芦、
茄子、番茄等 6 种作物的灰霉病菌。根据每一个灰
霉菌株在 7 个寄主上的致病性, 采用 UPGMA 法进
行聚类分析构建致病性树系图(图 2)。图 2表明供试
12个菌株可被划分为 4个菌群, 菌群Ⅰ包含 1号(和
田)、2 号(吐鲁番)、7 号(塔城)、10 号(吐鲁番)、11
号(和田)共 5个菌株, 菌群Ⅱ包含 3号(塔城)、4号(伊
犁霍城)、5号(鄯善)、8号(塔城)、9号(阿克苏)共 5
个菌株, 菌群Ⅲ包含 12号(伊犁特克斯)1个菌株, 菌
群Ⅳ包含 6号(塔城)1个菌株。结果表明灰霉菌株的
致病性与其来源地没有直接相关性, 如同样来自新
疆北疆塔城地区的 4 个菌株(3、6、7、8 号)被分别
归入了 3 个菌群(Ⅰ, Ⅱ, Ⅳ), 也就是说, 根据灰霉
菌株在 7 个不同寄主上的致病反应并不能划分出其
相应的地理位置。同样地, 灰霉菌株与其寄主间也
没有直接相关性。

图 2 12个灰霉菌株致病力聚类分析图
Fig. 2 Pathogenicity cluster analysis dendrogram for 12
B. cinerea isolates
1, HH-a; 2, TuH-a; 3, TH-a; 4, YHH-a; 5, SP-a; 6, TL-a; 7, TX-a;
8, TQ-a; 9, AF-a; 10, TuF-a; 11, HF-a; 12, YTF-a. 下同 The same
below.
第 3期 范咏梅等: 新疆灰霉病菌多态性及其致病力分化分析 553


2.3 DNA多态性统计结果
2.3.1 RAPD扩增结果
在所测试的 19个引物中, 有 10个引物对供试 12
株灰霉菌菌株基因组 DNA 均有扩增产物出现, 且重
复性较好。不同引物对每个供试菌种扩增的条带数不
等, 在 5~21条之间, 扩增片段的DNA分子量为 200~3
000 bp, 10个引物共扩增得到 148条带, 其中有 127个
RAPD位点具有多态性, 多态性位点频率为 85.8%。
不同引物产生多态性片段的比例差别较大。由
表 4可知, 引物 S1、S8、OPF-01多态性位点频率达
100%, 而引物 OPF-02只有 64.3%, 说明灰霉菌种间
有高度的遗传分化, 存在相当高的遗传多样性。部
分引物扩增结果见图 3。
12 株灰霉菌用不同引物进行扩增时, 有的引物
获得了较多的多态带, 有的引物则扩增出差异较小
的带型, 如表 4所示, 引物 S8、OPF-05多态性带为
18 条和 16 条, 而引物 OPF-02 多态带仅有 9 条; 而
不同地理来源的菌株之间, 带型有一定差异, 3、6、
7、8号菌株均来自塔城, 3号和 6号菌株的谱带较为
一致, 7号和 8号菌株的谱带较为一致, 但谱带的相
似度并未达到 100%。图 3A 900 bp处, 6号菌株有一
明显条带, 而 3号菌株则没有, 图 3D 800 bp处, 8号
菌株有一明显条带, 而 7 号菌株条带不明显, 说明
新疆灰霉病菌群体为适应不同的生态环境发生了一


图 3 引物 S2(A)、S3(B)、OPF-02(C)和 OPF-05(D)的扩增结果
Fig. 3 The amplified result of primer S2 (A), primer S3 (B), primer OPF-02 (C) and primer OPF-05(D)
M: 分子量标记 Marker.
554 中国生态农业学报 2010 第 18卷


定的适应性变异。从图 3 可以看出, 2、5、10 号菌
株的条带和其他菌株相比有明显差异, 它们均来自
东疆; 1、9、11号菌株间条带较为一致, 它们均来自
南疆。同一大田生态系统内菌株之间的遗传背景较
为一致, 如图中所示 1 号菌和 11 号菌都来自和田,
其谱带比较一致, 谱带间的相似度较高。
采用同一引物扩增, 除差异条带外, 12 株灰霉
菌仍然具有共同的谱带, 如在引物 S3作用下所有菌
株在 600 bp及 2 200 bp下均有明显共同的条带; 在
引物 OPF-02作用下, 所有菌株在 390 bp及 480 bp
下均有清晰共同的条带。这些共同带可能是灰霉病
菌的特征带。此外, 实验结果还显示在引物 S2作用
下, 除 5 号菌株外, 其余菌株在 500 bp 均有清晰共
同的条带; 在引物 OPF-05作用下, 1 000 bp处除 5
号、10 号菌株, 其余菌株均有明显共同的条带, 这
些共同的谱带可能反映出某一类菌株共同的遗传信
息, 笔者试验中已将这些片断克隆到 pGEM-T 载体
中进行测序, 这将有助于理解灰霉菌的遗传特征。
2.3.2 遗传分化的聚类分析
为进一步说明 12个菌株间的遗传关系, 将获得
的 12 个菌株的带谱读取数据后, 根据 Nei’s 遗传距
离, 应用 UPGMA 法进行聚类分析构建树系图, 结
果如图 4 所示。采自新疆不同地区、不同寄主植物
上的 12 株灰霉菌, 经过 RAPD 扩增及聚类分析后,
在 0.67阈值处可分为 4个菌群, 分别命名为菌群Ⅰ、
菌群Ⅱ、菌群Ⅲ、菌群Ⅳ。其中菌群Ⅰ含有 9株菌,
3 号和 4 号亲缘关系较近, 都是黄瓜灰霉菌; 菌群
Ⅱ、菌群Ⅲ、菌群Ⅳ各含 1 株菌, 分别是吐鲁番黄
瓜灰霉菌、鄯善葡萄灰霉菌和吐鲁番番茄灰霉菌。
进一步分析供试菌株群体基因型划分发现 :
1)受试灰霉菌株群体基因型的划分与不同寄主来源
无直接关系, 即未表现出来自同一种植物的菌株被
划分为 1 个基因型, 或者 1 个基因型中仅由来自同
种植物的菌株组成。2)本试验采集的菌株分别来自
新疆 6个地方, 阿克苏、和田属南疆, 塔城、伊犁属
北疆, 吐鲁番、鄯善属东疆。树状图在 0.7阈值下又
可分为 5 类, 其中菌群Ⅰ被分为两类, 命名为菌群
Ⅰ-1 和菌群Ⅰ-2, 图中可明显看出菌群Ⅰ-1 中除 8
号来自东疆吐鲁番及 7 号来自北疆塔城外, 其余 3
株菌均来自南疆, 菌群Ⅰ-2 的 4 株菌均来自北疆,
分别为塔城黄瓜灰霉菌、塔城辣椒灰霉菌、伊犁霍
城黄瓜灰霉菌和伊犁特克斯番茄灰霉菌。菌群Ⅱ、
菌群Ⅲ和菌群Ⅳ都来自东疆, 分别为吐鲁番黄瓜灰
霉菌、鄯善葡萄灰霉菌和吐鲁番番茄灰霉菌。由此
可以看出供试灰霉菌株群体基因型的划分与不同地
理来源具有一定的相关性。

图 4 12 株灰霉菌株 RAPD聚类分析树状图
Fig. 4 RAPD cluster analysis dendrogram for 12
B. cinerea isolates

上述结果基本表明各个菌株之间的亲缘关系及
遗传变异情况, 也说明真菌基因型遗传背景具有共
同性和变异多样性。
3 讨论
以往的研究表明, 针对同一寄主, 不同灰霉病
菌菌株的致病力存在差异, 并且灰霉病菌的致病力
分化与其寄主和采样地点无直接相关性 [6−8], 这与
本研究结果一致。由于灰霉病菌的侵染能力很强 ,
在有伤口和无伤口的情况下, 灰霉病菌都能产生有
效侵染 [5], 且光照等培养条件对灰霉病菌的孢子萌
发、菌丝生长均会产生较大影响[6−8, 12]。因此, 病原
菌所处的微生境或者侵染环境对病原菌的致病性可
能存在较大影响, 且病原菌如何在寄主上建立有效
的侵染可能是影响灰霉病菌致病力强弱的关键。
本研究中, 不同来源灰霉菌株的 RAPD 图谱显
示出明显的地理特征, 即灰霉病菌存在明显的遗传
多样性 , 与菌株的来源存在直接相关性 , 这与
Kerssies等[5]报道不完全一致, 可能的原因是菌株采
集区域的限制, 包括气候生态条件和地理位置。本
次研究中, 灰霉菌株涉及新疆 3 个生态区, 即新疆
北疆、南疆和东疆, 气候生态条件差异也较大, 尤其
处于北疆的伊犁, 历史上称为“塞外江南”, 其气候
与南疆差异极为明显, 同时, 3个农业生态区域的地
理位置相距较远。因此, 这两种差异可能造成来自
新疆的灰霉病原菌菌株间在遗传多态性方面明显不
同, 灰霉菌株的遗传多态性显现出地理区域特征。
较新疆相比, 以往研究中灰霉菌所在的采集区域相
对较小, 相互之间生态气候差异也较小, 不足以对
病原菌的遗传变异造成较大影响。
本试验证明, 利用离体叶片可较好地测定灰霉
第 3期 范咏梅等: 新疆灰霉病菌多态性及其致病力分化分析 555


病菌的致病力分化, 可将病菌区分为强、中、弱等
不同致病类型。病原菌对离体叶片的穿透生长能力
测定结果显示, 对叶片穿透生长能力强的菌株, 其
致病力也相对较强, 即灰霉菌对不同叶片的穿透生
长能力与致病力呈明显正相关。本研究中, 同一灰
霉菌株对不同寄主形成的病斑存在两种症状: 在番
茄、西葫芦、烟草叶片上病原菌形成的病斑多呈水
浸状 , 扩展快 , 但在病斑表面上菌丝较少 , 这可能
是因为菌丝侵入植物组织内, 阻断植物组织有效吸
收营养 , 以至于造成病斑周围衍生区域组织变黄 ;
在辣椒、葡萄叶片上病原菌形成的病斑不呈水浸
状, 扩展慢, 但在病斑表面上菌丝生长相对旺盛。这
两种症状的差异可能和寄主叶片的表皮角质层厚
薄、叶片的相对成熟程度及叶组织中的营养成分不
同有关。
目前, 针对灰霉病菌的生理型尚没有明确的划
分依据和阐述。从致病性鉴定结果看, 本研究选定
的 7个作物作为灰霉病菌的致病力分化的鉴别寄主,
能较好地区分不同菌株的致病性差异。该结果可
进一步为划分灰霉病菌的致病型或生理型提供科学
依据。
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