全 文 ：第 37 卷 第 4 期 江西师范大学学报(自然科学版) Vol． 37 No． 4
2013 年 7 月 Journal of Jiangxi Normal University(Natural Science) Jul． 2013
收稿日期:2013-03-06
基金项目:国家自然科学基金(30860158，31260426)和贵州省科学技术基金(黔科合 J字［2008］2264)资助项目．
作者简介:姜 山(1967-) ，男，贵州贵阳人，副教授，博士，主要从事植物与病原菌互作关系研究．
文章编号:1000-5862(2013)04-0349-06
小立碗藓-灰霉菌互作过程中活性氧代谢及
病程相关蛋白 1 转录表达的变化
姜 山，余治锦，兰世超
(贵州师范大学生命科学学院，贵州 贵阳 550001)
摘要:为了解苔藓植物小立碗藓与病原真菌灰霉菌的互作关系，观察了灰霉菌在小立碗藓配子体中的感
染行为和小立碗藓受感染后的组织病理学变化．另外，还测定了接种灰霉菌后小立碗藓配子体的过氧化
氢量、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性以及病程相关蛋白 1(PR1)
基因转录表达变化．结果表明:(i)在灰霉菌接种早期小立碗藓出现类似维管束植物的过敏性反应; (ii)
接种早期 PR1 基因表达上调和 POD活性增高，说明 PR1 和 POD可能与小立碗藓对灰霉菌的早期防御反
应有关;(iii)病原菌侵染引起小立碗藓配子体内 CAT、SOD活性下降和过氧化氢量升高，说明小立碗藓与
灰霉菌互作中出现了氧化还原态的变化．
关键词:小立碗藓;灰霉菌;活性氧
中图分类号:S 432． 1 文献标志码:A
0 引言
苔藓植物小立碗藓(Physcomitrella patens)隶属
葫芦藓科(Funariaceae)小立碗藓属(Physcomitrel-
la)．小立碗藓具有以下特点: (i)个体较小，再生能
力强，易于组织培养; (ii)同源重组率高，是迄今发
现同源重组率最高的陆生植物，可为基因敲出实验
提供便利条件;(iii)生活史中单倍体配子体占优势，
用于分子生物学和遗传学研究具有优越性; (iv)已
完成基因组测序工作． 上述特点使得小立碗藓被广
泛用于植物基因组学的研究，现已成为植物学研究
的重要模式系统［1-8］．
小立碗藓拟叶和原丝体由单层细胞构成，十分
方便观察病原菌的感染情况，是研究植物-病原微生
物互作关系的理想实验材料［9-11］．但是，目前关于植
物与病原微生物互作关系的研究报道主要集中在维
管束植物，苔藓植物的相关报道较少．苔藓植物是陆
生植物登陆早期的代表，是研究陆生植物进化的理
想实验材料．因此，利用小立碗藓研究植物与病原体
互作关系，可丰富陆生植物与病原体互作关系的研
究数据．已有的研究揭示广谱病原真菌灰霉菌(Bot-
rytis cinerea)能感染小立碗藓，并且诱导查尔酮合酶
和苯丙氨酸脱氨酶等防卫相关基因上调表达［11］．虽
然活性氧及其清除酶过氧化物酶(POD)、过氧化氢
酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)在维管束植物防
御反应中发挥重要作用［12-23］，但是灰霉菌感染对非
维管束植物小立碗藓的过氧化氢产生、POD、CAT、
SOD活性的影响还未见报道． 本文通过形态学、生
物化学和分子生物学手段研究灰霉菌感染后小立碗
藓的生理生化变化，旨在为进一步研究植物登陆早
期与病原微生物的互作关系提供基础数据．
1 材料和方法
1． 1 植物材料
植物材料小立碗藓由首都师范大学何奕騉教授
提供．小立碗藓用 PPNH4培养基(葡萄糖 5 g·L
－1、
酒石酸铵 0． 5 g·L －1、Ca(NO3)2·4H2 O 0. 8 g·
L －1、FeSO4·7H2 O 0. 012 5 g·L
－1、MgSO4·7H2 O
0. 25 g·L －1、CuSO4·5H2O 0． 055 mg·L
－1、ZnSO4·
7H2O 0． 055 mg·L
－1、H3BO3 0． 614 mg·L
－1、MnCl2·
6H2O 0． 389 mg·L
－1、CoCl2·6H2O 0． 055 mg·L
－1、KI
0． 028 mg·L －1、NaMoO3·2H2O 0． 025 mg·L
－1、磷酸
缓冲液(KH2PO40． 25 g·L
－1，4 mol·L －1 KOH，pH值
为 6． 5)、琼脂 7 g·L －1)培养． 在 16 h 光照和8 h黑
暗的光照周期及 25 ℃下培养 20 d后用于本研究．
DOI:10.16357/j.cnki.issn1000-5862.2013.04.005
1． 2 病原菌
灰霉菌 c023 菌株由华东师范大学许玲教授提
供．灰霉菌在 PDA固体培养基(马铃薯 300 g·L －1、
葡萄糖 40 g·L －1、琼脂 20 g·L －1)上培养 10 d 后
用于本实验．用无菌蒸馏水冲洗长有菌丝的 PDA平
板，过滤于离心管中离心(4 000 r·min －1，10 min) ，
去上清液，重复离心 3 次后加入 PDB 培养基(马铃
薯 300 g·L －1、葡萄糖 40 g·L －1)制备成灰霉菌孢
子悬浮液，孢子浓度调整为 5 × 105个·mL －1 ．
1． 3 接种
前期实验发现，因小立碗藓个体较小，如将灰霉
菌直接接种在生长于 PPNH4培养基的小立碗藓上
会导致菌丝在培养基表面大量繁殖并覆盖植株，不
利于病程观察和试验材料采集．因此，本实验接种时
将培养 20 d的小立碗藓浸入灰霉菌孢子悬浮液后，
转移到盛有珍珠岩和适量无菌蒸馏水的培养皿中培
养．同时将对照组植株浸入 PDB 培养基后转入盛有
珍珠岩的培养皿． 对照组和实验组的小立碗藓在
16 h光照和 8 h黑暗的光照周期及 25 ℃下培养．取
接种灰霉菌后 1、2、3、5、7 和 9 d 的小立碗藓用于外
观和细胞内菌丝的观察;取接种后 6、12、24、48、72
和 120 h的小立碗藓用于酶活性及 H2O2含量测定;
取接种 1、2、3 d 的小立碗藓用于病程相关蛋白 1
(PR1)基因转录表达量的测定．
1． 4 小立碗藓拟叶细胞内菌丝的观察
小立碗藓配子体用台盼兰染色 1 min，脱色剂
(2． 5 g 水合三氯乙醛，蒸馏水 1 mL)脱色 30 min
后，在解剖镜下把拟叶剥下并制成装片，于光学显微
镜下观察感染情况．
1． 5 POD、CAT、SOD酶活性及 H2O2含量测定
参照王爱国等［24］的方法，分别取小立碗藓
0. 26 g，加入预冷的酶提取液 3 mL，在液氮中充分研
磨，离心(4 ℃，12 000 r·min －1，20 min) ，上清液存
于 － 20 ℃低温保存箱中供酶活性、H2O2量及蛋白浓
度测定．
POD测定试剂盒、CAT 测定试剂盒、总 SOD 测
定试剂盒、H2O2测定试剂盒均购自南京建成生物工
程研究所;BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)购自
碧云天生物技术研究所． POD、CAT、SOD、H2 O2及
BCA蛋白浓度的测定均根据试剂盒说明书进行．
根据浓度 =吸光度值 ×比色光径，蛋白浓度按
如下公式计算:
样本蛋白浓度
C /(mgprot·mL －1)=C1p(OD －OD0) (OD1 －OD0)，
其中 OD0、OD1、OD 分别为空白管、标准管、样本管
的吸光度值;C1为标准蛋白浓度，单位为 mgprot·
mL －1;p为稀释倍数．
酶活性按如下公式计算:
POD活力 /(U·mgprot － 1)=
1 000(OD2 － OD1)Vt
12LV1C
，
CAT活力/(U·mgprot －1)=271(OD1 －OD2) (60V1C)，
总 SOD活力 /(U·mgprot － 1)=
2(OD1 － OD2)V
OD1V1C
，
其中 OD1、OD2分别为对照管、测定管的吸光度值;C
为样本蛋白浓度，单位为 mgprot·mL －1;L 为比色光
径，单位为 cm;t为反应时间，单位为 min;V、V1分别
为反应液总体积和样本量，单位为 mL．
H2O2含量的计算:
H2O2含量 /(mmol·gprot
－ 1)=
163(OD2 － OD0)
(OD1 － OD0)C
，
其中 OD0、OD1、OD2分别为空白管、标准管、测定管的
吸光度值;C为样本蛋白浓度，单位为 gprot·L －1 ．
1． 6 病程相关蛋白 1(PR1)基因转录表达量测定
RAN提取参照张梅娟等［25］的方法． 取 400 μL
水饱和酚、600 μL SDS提取液和 60 μL β-巯基乙醇
于离心管中备用． 将小立碗藓 130 mg 和 100 mg
PVP于液氮中研磨，转至上述离心管，加 200 μL 氯
仿，剧烈震荡 3 ～ 5 min 后，加 200 μL 醋酸钾，冰浴
15 min，离心 10 min(4 ℃、12 000 r·min －1) ;将水相
转移至离心管，加 1 /2 体积的水饱和酚和 1 /2 体积
的氯仿，混匀并离心 10 min;取水相加等体积 CI 抽
提;水相加 1 /10 体积的醋酸钠(pH值为 5． 2)和 2． 5
体积的无水乙醇，－ 20 ℃沉淀 25 min，离心 15 min;
用 500 μL醋酸钠(pH 值为 5． 6)洗涤沉淀;沉淀溶
于 200 μL DEPC水后，加入 20 μL醋酸钠(pH值为
5. 2)和 500 μL无水乙醇，－ 20 ℃沉淀 20 min，离心
15 min;所得 RNA 加入 500 μL 75%的乙醇，离心
10 min(4 ℃、12 000 r·min －1) ，去上清液，将沉淀
物溶于 DEPC 水中，测定 RNA 浓度． 用 Prime Script
RT reagent Kit With gDNA Eraser 试剂盒(购自宝生
物工程(大连)有限公司)反转录．
以小立碗藓 actin3 作为内参照基因对 PR1 基
因进行实时荧光定量 PCR． 根据已知小立碗藓
PR1［10］和 actin3［26］序列，应用 Primer Premier 5． 0 软
件设计 PR1 和 actin3 基因引物． PR1 正向引物序列:
5-CGCCGATATGCTTTGACT-3，PR1 反向引物序
列:5-GTACTGATCCGCGATGCT-3． actin3 正向引物
序列:5-CGGAATGGTGAAGGTATGAT-3，actin3 反
向引物序列:5-CACGATGTGAAGAAGACGAT-3． 引
物由宝生物工程(大连)有限公司合成．扩增产物分
别为 142 bp和 140 bp．扩增采用 SYBR Premix Ex
TaqTMⅡ试剂盒，条件为:95 ℃预变性 30 s后，95 ℃、
5 s，60 ℃、34 s PCR反应，共 40 个循环． PR1 基因表
053 江西师范大学学报(自然科学版) 2013 年
达量以参照基因 actin3 作为标准进行相对定量，相
对表达量的计算采用 2 － ΔΔCt法［27］．
目的基因相对表达量按如下公式进行计算:
相 对 表 达 量 = 2 － ΔΔCt = 2 －(E － F)－(A － B) =
2(F － B)－(E － A)，其中 A 为对照组待测基因 Ct 值;B 为
对照组参照基因 Ct 值;E 为接种植株待测基因 Ct
值;F为接种植株参照基因 Ct 值． Ct 值为 3 个平行
试验的平均数，3 个实验数据间相差不超过 0． 5．
1． 7 数据统计及分析
以上实验重复 3 次，数据均为 3 次实验的平均
值．使用 SPSS软件对数据进行统计分析．
2 结果
2． 1 小立碗藓接种灰霉菌后的形态学和组织病理
学研究
接种灰霉菌后 1 d，小立碗藓的配子体上出现褐
色斑点．褐色病斑首先出现在拟叶基部或边缘，然后
逐渐扩展到整个植株(见图 1(a) )． 在接种后 9 d，
小立碗藓配子体出现萎黄并死亡． 未接种灰霉菌的
对照组小立碗藓配子体上未见明显褐色斑点(见图
1(b) )．
(a)接种灰霉菌 5 d的小立碗藓拟叶出现褐变(箭头) ;(b)未接种灰霉菌的小立碗藓配子体未见褐色病斑．
图 1 小立碗藓接种灰霉菌后的外观变化
接种后的小立碗藓拟叶置于光学显微镜下观
察，发现接种灰霉菌后 12 h，在小立碗藓拟叶上灰霉
菌孢子开始萌发形成发芽管，然后在发芽管前端形
成附着胞．从接种第 2 天开始在拟叶细胞内发现侵
入菌丝(见图 2(a) ) ，并且感染后期菌丝在细胞内
大量扩增．另外，在有侵入菌丝的细胞上观察到侵入
孔(见图 2(a) )． 说明灰霉菌侵入小立碗藓细胞是
通过侵入孔直接进入细胞内部．
2． 2 灰霉菌侵染对小立碗藓配子体内过氧化氢量
以及 POD、SOD和 CAT活性的影响
接种后 6、12、24、48 h，小立碗藓的过氧化氢量
与对照组植株相比没有显著差异，但是接种 72 h 后
小立碗藓的过氧化氢量增高并显著高于未接种的对
照组(见图 3)．
(a)接种 2 d的小立碗藓拟叶细胞内的侵入菌丝
(黑色箭头)和侵入孔(白色箭头) ;
(b)未接种灰霉菌的小立碗藓拟叶细胞中，未见
侵入菌丝．样品均经台盼蓝染色． Bar = 10 μm．
图 2 灰霉菌在小立碗藓中的感染行为
153第 4 期 姜 山，等:小立碗藓-灰霉菌互作过程中活性氧代谢及病程相关蛋白 1 转录表达的变化
图 3 灰霉菌侵染对小立碗藓配子体内过氧化氢量的影响
接种后 12 h，小立碗藓 POD活性显著高于未接
种的植株，但接种后 120 h 其活性明显下降(见
图 4)．
图 4 灰霉菌侵染对小立碗藓配子体内
过氧化物酶活性的影响
接种后 6、12 和 24 h，小立碗藓的 CAT 活性与
未接种植株无显著差异，但从接种 48 h 开始其活性
呈现下降趋势并显著低于未接种植株，直至接种后
120 h其活性接近零(见图 5)．
图 5 灰霉菌侵染对小立碗藓配子体内 CAT活性的影响
接种 24 h前，小立碗藓 SOD活性与未接种植株
无显著差异，但从接种 48 h 后呈现下降趋势，并显
著低于未接种植株(见图 6)．
图 6 灰霉菌侵染对小立碗藓配子体内 SOD活性的影响
2． 3 灰霉菌感染对小立碗藓体内 PR1 转录表达的
影响
以 PR1 基因的正向引物 /反向引物为引物，接
种和未接种灰霉菌的小立碗藓配子体的 cDNA为模
版进行实时定量 PCR． 结果表明，接种后 1、2、3 d，
PR1 基因表达量分别明显高于未接种的对照组(见
图 7)．
图 7 灰霉菌侵染对小立碗藓配子体内
PR1 蛋白转录表达的影响
3 讨论
虽然接种灰霉菌后 1 d就在小立碗藓拟叶上发
现了褐色的斑点，但是在接种后 2 d 才在拟叶细胞
中发现侵入菌丝．说明早期的褐色病斑不是由灰霉
菌入侵寄主细胞所引起，而可能是由类似维管束植
物过敏性反应所致． 在维管束植物和病原菌的非亲
和关系中，活性氧的产生往往是第一个被检测到的
植物体反应． H2 O2作为活性氧中的一类，低浓度时
能够强化细胞壁，同时也可作为信号分子参与植物
的防卫反应［12-15］．虽然维管束植物的过敏性反应往
往伴随活性氧产生，但是本实验结果显示，在接种病
原菌早期苔藓植物过氧化氢量相对未接种植株并没
有显著增高，说明苔藓植物过敏反应产生机制可能
与维管束植物的有所不同．
在接种后期小立碗藓细胞内菌丝大量扩增可能
253 江西师范大学学报(自然科学版) 2013 年
与过氧化氢量显著增高有关，因为高浓度的活性氧
具有较高的氧化还原活性，可引起细胞内大分子氧
化损伤，最终抑制植物的多种生理生化反应，从而影
响植物体内抗病性表达［14-15］．
POD及其同工酶在维管束植物防御体系中起
重要作用． POD 不仅参与了木质素单体的聚合过
程，而且是细胞内重要的过氧化氢清除剂，因此
POD活性与植物防御反应有着密切的关系［12-13，16-19］．
本实验结果显示，在接种灰霉菌早期(接种后12 h)小
立碗藓的 POD 活性显著高于未接种植株，这可能与
苔藓植物早期防御反应有关．在接种后期小立碗藓
POD活性下降并显著低于未接种植株，可能与大量菌
丝侵入造成细胞内酶活降低有关．
CAT是植物细胞内过氧化氢清除剂，其生理作
用是将 H2O2还原为 H2O和 O2．因此，CAT对维持细
胞内过氧化氢的正常生理水平起到重要作用［19-22］．
本实验结果显示，接种早期小立碗藓 CAT活性与未
接种植株没有显著差异，但是接种 48 h 后其活性显
著下降并低于未接种植株． CAT 的活性下降可能直
接导致感染后期小立碗藓过氧化氢量升高，进而使
得植物细胞受到氧化伤害而丧失抗病性，造成大量
菌丝侵入．
SOD是植物体内防御氧化损伤的重要酶，它的生
理作用是歧化 O2 －产生 H2O2和 O2，在不同的植物病
害系统和互作关系中其活性变化不同［19-23］．接种灰霉
菌后小立碗藓体内 SOD活性在接种 48 h 后下降，这
样的下降可能与菌丝侵入造成的细胞损伤有关．
PRs基因是植物防卫反应基因中的一员，与过
敏性反应和系统获得性抗性密切相关，它的诱导表
达常作为系统获得性抗性建立的标志［28-30］． 本文研
究结果表明，接种灰霉菌诱导了小立碗藓 PR1 基因
的转录表达．因此灰霉菌的侵入可能诱导了小立碗
藓系统获得性抗病性．
综上所述，本文研究结果揭示过敏性反应、POD
活性升高和 PR1蛋白的产生可能作为保守的防卫反
应机制，在植物登陆早期就已存在．同时病原微生物
的侵入导致了苔藓植物细胞内氧化还原态的变化．
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The Changes on Metabolism of Reactive Oxygen Species and Expression
of Pathogenesis Related Protein 1 During Interaction of
Physcomitrella patens with Botrytis cinerea
JIANG Shan，YU Zhi-jin，LAN Shi-chao
(School of Life Science，Guizhou Normal University，Guiyang Guizhou 550001，China)
Abstract:To understand histopathology changes during interaction of Physcomitrella patens with Botrytis cinerea，the
infection behavior of B． cinerea and the lesion on P． patens were observed by microscopes． In addition，H2O2 genera-
tion was detected，transcription expression of PR1 gene and activity of peroxidase(POD) ，catalase(CAT)and su-
peroxide dismutase(SOD)in P． Patens after inoculation with B． cinerea by biochemical and molecular biological
mothers． The results showed that: (i)a disease resistance response which is similar to hypersensitive response in
vascular plants occurred in P． patens during early stages of the pathogen infection;(ii)the ehanced PR1 gene ex-
pression of P． patens and promoted POD activity of P． patens after inoculation with B． cinerea，suggested that PR1
and POD might involved in defense response of bryophyte against B． cinerea．(iii)the increase of H2O2 generation
and decrease of CAT and SOD activity caused by B． cinerea infection，suggested that P． patens occurred changes of
redox status after inoculation with B． cinerea．
Key words:Physcomitrella patens;Botrytis cinerea;reactive oxygen species
(责任编辑:刘显亮)
453 江西师范大学学报(自然科学版) 2013 年