全 文 ：中国生态农业学报 2009年 9月 第 17卷 第 5期
Chinese Journal of Eco-Agriculture, Sept. 2009, 17(5): 1029−1034


* 国家自然科学基金项目(40801091, 40771202)资助
张晶(1979～), 女, 助理研究员, 主要从事土壤微生物分子生态学研究。E-mail: zhangjing79847984@hotmail.com
收稿日期: 2008-10-21 接受日期: 2009-02-20
DOI: 10. 3724/SP.J.1011.2009.01029
参与土壤氮素循环的微生物功能基因
多样性研究进展*
张 晶 1,2 林先贵 1,2 尹 睿 1,2
(1. 中国科学院南京土壤研究所土壤与农业可持续发展国家重点实验室 南京 210008;
2. 中国科学院南京土壤研究所-香港浸会大学土壤与环境联合开放实验室 南京 210008)
摘 要 土壤氮素循环是生物地球化学循环的重要组成部分, 不但影响着土壤生产力和可持续发展, 还影响
着全球环境变化。土壤微生物在土壤氮循环中发挥着不可替代的作用, 参与了包括固氮作用、氨化作用、硝
化作用和反硝化作用等重要生态过程。近十年中, 分子生物学技术的发展为从功能基因角度研究与土壤氮循
环密切相关的微生物功能群结构、组成和丰度的变化提供了新的契机。本文综述了参与土壤氮循环的微生物
功能基因多样性研究进展, 并展望了未来发展方向。
关键词 土壤氮循环 微生物 功能基因 分子生物学 全球环境变化
中图分类号: X172 文献标识码: A 文章编号: 1671-3990(2009)05-1029-06
Advances in functional gene diversity of microorganism in
relation to soil nitrogen cycling
ZHANG Jing1, 2, LIN Xian-Gui1, 2, YIN Rui1, 2
(1. State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences,
Nanjing 210008, China; 2. Joint Open Laboratory of Soil and the Environment, Institute of Soil Science, Chinese
Academy of Sciences and Hongkong Baptist University, Nanjing 210008, China)
Abstract Soil nitrogen cycling is an important part of biogeochemical cycling. Not only does it influence soil productivity and
durative development, but also influences global environmental changes. Terrestrial microorganisms play a vital role in soil nitrogen
cycling. They participate in important ecological processes such as nitrogen fixation, ammonification, nitrification and denitrification.
With the development of molecular biological technology in recent decades, it is possible to study microbial functional community
composition, structure and abundance in relation to soil nitrogen cycling from the point of functional gene. In this paper, advances in
functional gene diversity in relation to soil nitrogen cycling are reviewed and future areas of improvement identified.
Key words Soil nitrogen cycling, Microorganism, Functional gene, Molecular biology, Global environmental change
(Received Oct. 21, 2008; accepted Feb. 20, 2009)
土壤氮素生物地球化学循环是土壤物质循环的
重要组成部分, 不仅影响土壤质量以及农田等生态
系统的生产力和可持续性 , 还会影响全球环境变
化。所谓氮循环就是指 N2、无机氮化合物、有机氮
化合物在自然界中相互转化过程的总称, 包括氨化
作用、硝化作用、反硝化作用、固氮作用等。土壤
微生物在陆地生态系统中大量存在, 广泛分布, 在
土壤氮循环中起着不可替代的作用, 其中一些种类
将生物圈中以 N2 形式存在的氮通过固定生成氨氮,
并进一步将其同化成有机氮或转化成硝态氮, 又通
过反硝化作用将硝态氮转化为 N2或 NO。近十年来,
随着分子生物学技术的发展, 应用先进的分子系统
学、微阵列技术和功能基因组学技术发掘基因组进
化和功能信息 [1,2], 进而探索微生物功能基因多样
性与土壤氮素循环之间的关系, 成为重新评价土壤
质量与功能的新切入点。
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1 土壤氮循环过程中的微生物功能群和功
能基因
1.1 固氮作用中的微生物功能群和功能基因
固氮细菌种类丰富 , 包括固氮菌属 (Azotoba-
cter)、固氮螺菌 (Azospirillum)、拜叶林克氏菌属
(Beijerinckia)、着色菌属(Chromotium)、Chstridium、
脱硫弧菌(Desulfovibrio)、克氏杆菌(Klebsiella)、类
芽孢杆菌属(Paenibacillus)、假单胞菌属(Pseudomo-
nas)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红螺菌属
(Rhodosospirillum)和硫杆菌属(Thiobacillus)。蓝细菌
和放线菌中一些种类也可以固氮。固氮酶由两个多
亚基的金属蛋白酶组成, 成份Ⅰ包括 N2还原活性位
置, 由 250 k Da蛋白构成, 由 nifD, nifK基因编码。
成份Ⅱ是大约 70 k Da的蛋白, 将ATP水解与电子转
移偶联, 由 nifH基因编码。Fe-S中心在成份Ⅰ和Ⅱ
亚基之间交错存在。nifHDK操纵子的转录是固氮条
件的良好指示物, 它非组成型表达, 由控制固氮的
各因子调控表达。固氮酶多样性研究主要基于 nifH
基因的系统进化分析, 这主要由于 nifD、nifK 基因
序列相对较少, 可能大大限制了系统进化比较分析
的范围。目前, nifH基因数据库快速扩增到 1 500多
个序列, 其中很多来自环境样品, 为发展 RT-PCR、
DNA微阵列和定量 PCR提供了资源[3]。
1.2 硝化作用中的微生物功能群和功能基因
硝化作用是地球氮循环的重要过程, 造成生态
系统的氮素流失、水体富营养化和大气活跃痕量气
体的产生。参与硝化过程的微生物主要有氨氧化细
菌(AOB)或古菌(AOA)及亚硝酸盐氧化菌(NOB)。
AOB 是土壤氮循环的重要驱动者, 主要包括亚
硝化单胞菌属 (Nitrosomonas)、亚硝化球菌属
(Nitrosococcus)、亚硝化螺菌属(Nitrosospira)、亚硝
酸叶菌属(Nitrosolobus)和 Nitrosovicria等。陆地生态
系统中, 已知的所有自养氨氧化细菌分别属于亚硝
化单胞菌属和亚硝化球菌属, 形成了β-变形菌亚纲
单源进化簇。由于氨氧化细菌很难分离培养, 目前
研究多基于微生物分子生态学的方法, 通过靶定 16
S rRNA或氨单加氧酶编码基因 amoA探讨其在生态
系统中的分布和丰度等[4, 5]。最近发现土壤氨氧化细
菌优势种群主要是亚硝化螺菌 , 而不是亚硝化单
胞菌[6]。氨单加氧酶(AMO)是氨氧化细菌的一个膜
靠多亚基的酶类, 负责将氨转化为羟胺, amo操纵子
主要包含 amoC、amoA和 amoB 3个基因。其中AmoA
亚基 27~30 k Da, 被公认为酶的活性中心; AmoB和
AmoC亚基分别为 38~43 k Da和 31.2~31.4 k Da。
已知的 NOB 包括硝化杆菌属(Nitrobacter)、硝
化球菌属(Nitrococcus)、硝化刺菌属(Nitrospina)和硝
化螺菌属(Nitrospira)。其中硝化杆菌是一个系统发
生比较晚的类群 , 其基因组在该种属中比较保守 ,
包括 Nitrobacter hamburgensis、Nitrobacter vulgaris、
Nitrobacter winogradskyi、Nitrobacter alkalicus 等,
这些菌株具有多个 nxrA基因拷贝, 且拷贝数和相似
性有差异。硝化杆菌的亚硝酸盐氧化作用由亚硝酸盐
氧化还原酶(NXR)介导。以具有催化活性的 Nitrobacter
hamburgensis X14T为例, 其NXR酶包括编码 nxrA和
nxrB两个亚基。nxrX基因编码肽基 cis-trans异构酶,
可能协助 NXR 酶的折叠, 位于 nxrA 和 nxrB 基因之
间, 即命名为 nxrAXB基因簇[7, 8]。
1.3 反硝化作用中的微生物功能群和功能基因
反硝化作用呼吸还原硝酸盐为气态产物, 是土
壤氮循环的重要组成部分。具体过程为：NO3−→
NO2−→NO→N2O→N2, 要求 4 个酶连续反应, 包括
硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、NO还原酶和 N2O
还原酶[9]。硝酸盐还原作用或被膜靠硝酸盐还原酶
(NarG)催化 , 或被可溶性细胞质硝酸盐还原酶
(NapA)催化。NarG 由 3 个亚基构成, 即由 narG 基
因编码的 α亚基, 由 narH基因编码的可溶性 β亚基,
由 narI 基因编码的 γ 亚基。narGHJI 操纵子由两个
结构域构成, α和 β亚基组成细胞质域, γ亚基构成细
胞膜域。NapA 由 napA 和 napB 基因编码的异源二
聚体组成, 包含亚钼嘌呤辅助因子和 4个 Fe-S簇具
有催化活性的大亚基。一些细菌同时表达以上两种
酶, 从而拥有不同的生理作用[10]。亚硝酸盐还原作
用被含铜离子的亚硝酸盐还原酶(NirK)或含细胞色
素 cd1亚硝酸盐还原酶(NirS)所催化。从某种意义来
说, 反硝化作用是一个组合, 细菌一般仅拥有其中
的一部分路径[9, 11]。

表 1 土壤氮循环中主要功能基因列表
Tab.1 Main functional genes in soil nitrogen cycling
基因名称
Gene
appellation
编码蛋白质
Protein coded by gene
催化途径
Catalyse ap-
proach
在氮循环中作用
Function in ni-
trogen cycling
nifH 固氮酶铁蛋白 N2→NH4+ 固氮作用
amoA 氨单加氧酶 NH4+→NO2− 硝化作用
nxrA 亚硝酸盐氧化酶 NO2−→NO3− 硝化作用
narG 膜靠硝酸盐还原酶 NO3−→NO2− 反硝化作用
napA
可溶性细胞质硝酸
盐还原酶 NO3
−→NO2− 反硝化作用
nirK
含铜离子的亚硝酸
盐还原酶 NO2
−→NO 反硝化作用
nirS
含细胞色素 cd1亚
硝酸盐还原酶 NO2
−→NO 反硝化作用
norB NO还原酶 NO→N2O 反硝化作用
nosZ N2O还原酶 N2O→N2 反硝化作用
第 5期 张 晶等: 参与土壤氮素循环的微生物功能基因多样性研究进展 1031


2 与氮循环相关的土壤微生物功能基因多
样性研究进展
2.1 农田生态系统
农田生态系统中, 氮素输入途径主要包括大气
氮沉降、化肥施用、生物固氮和秸秆还田等, 氮素
输出途径为淋失、氨挥发以及农作物的输出和硝化
反硝化作用中氮的损失。与传统的土壤化学法对氨
态氮、硝态氮、氧化亚氮含量的研究相比, 现代分
子生态学方法以微生物功能群数量和结构为指示 ,
靶定功能基因, 深入探讨氮素输入输出过程对土壤
中参与氮循环的微生物功能群的影响。
施肥是农业管理的最重要措施之一, 也是氮源
输入的主要方式。随着农田施肥量不断增加, 土壤
氮素富集 , 造成环境污染和土壤生物群落结构改
变[12]。在密集性农田土壤中, 短期铵肥施用在初期
可显著提高硝化作用活性, 刺激氨氧化细菌群落数
量增加, 在后期群落数量趋于稳定, 这种效应不受
NH4+浓度差异的影响。而长期铵肥施用过程中, 氨
氧化细菌群落数量也随着肥料的施用显著上升, 群
落结构未发生显著变化。中等和高 NH4+浓度增加
了土壤 N2O 的释放速率, 促进土壤反硝化群落发生
转换, 这可能是由于硝化作用增加了氧化态氮的供
应所致[13−16]。Coelho 等[17]发现, 氮肥水平是影响高
粱根际土壤固氮细菌群落结构的重要环境因子 ,
Azohydromonas 、 Ideonella 、 Rhizobium etli 、
Bradyrhizobium 在高、低氮水平土壤中都可检测到,
而 Delftia tsuruhatensis 仅在高氮水平土壤根际存在,
Methylocystis则为低氮水平土壤根际的特征类群。不
仅氮肥用量, 氮肥种类也一定程度影响土壤硝化和
反硝化细菌种群结构和数量。与不同无机肥组合相
比, 有机肥显著刺激了土壤氨氧化细菌数量的增加
和群落组成的改变[18,19]。Enwall等[20]发现施有机肥
土壤的反硝化速率高于施无机肥的反硝化速率, 但
反硝化细菌群落组成无明显差异性。而 Wolsing等
[21]基于 nirK 基因研究发现施有机肥和无机肥土壤
反硝化细菌群落结构显著不同。Shen 等 [22]发现长
期施用不同氮肥组合增加了土壤硝化速率, 显著影
响土壤氨氧化细菌的种群结构和丰度, 而对氨氧化
古细菌影响较小。作物根茬以及还田秸秆归还的氮
也是土壤有机质的重要来源, 提高了土壤 nifH 基
因和 napA基因丰度[23]。而其他元素的添加(例如硼
和氯化钠)也会间接影响土壤氮循环 , 对土壤硝化
作用无显著影响, 但提高了土壤固氮细菌丰度[24]。
同时, 植物类型也是影响土壤氮循环一个不可忽视
的因子[25−29]。
土壤杀虫处理在农田生态系统被广泛应用, 其
对土传病原细菌、真菌、线虫性寄生虫以及杂草和
昆虫等都有良好的杀灭效果。但高强度施用在改变
土壤环境的同时, 也很大程度上影响了土壤微生物
功能群[30]。研究结果表明, 施用初期, 甲基溴等蒸汽
式杀虫剂会诱导群落活动和数量的显著降低, 改变
群落结构, 其中对硝化细菌影响最大; 施用 15~60 d
后, 与对照相比, 硝化和反硝化细菌基因丰度略有
提高, 但土壤微生物群落结构发生很大变化; 施用
62 d 后, 土壤底物诱导呼吸和反硝化活性并未完全
恢复, 几乎检测不到硝化活性[31]。
丛枝菌根真菌在农田土壤养分循环中具有潜在
的重要性, 它增加了植物获取有机和无机氮的能力,
而氨氧化细菌和丛枝菌根真菌的相互作用在土壤氮
循环中可能起到意想不到的效果, 氨氧化细菌控制
着从 NH4+到 NO2−硝化作用的速率, 丛枝菌根真菌
通过降低根区 pH 值增加氮的矿化速率, 一定程度
改变了植物根区的氨氧化细菌种群组成, 亚硝酸螺
旋菌Nitrosolobus tenuis和Nitrosolobus tenuis是其优
势类群[32]。
2.2 林地生态系统
林地生态系统的氮循环受植被类型 [33]、小气
候[34]、温度[35,36]、氮沉降、凋落物归还和干扰(火灾)
等诸多因素限制。欧洲氮饱和项目认为其森林氮饱
和临界负荷的最小值为 10 kg(N)·hm−2·a−1, 但目前
中欧森林大气氮输入为 25~60 kg(N)·hm−2·a−1, 大
大超过了森林的年需要量。在北美, 某些森林地区
大气氮沉降量也达到 40 kg(N)·hm−2·a−1。过剩的氮
沉降增加 NH4+和 NO3−的淋失, 加速了土壤酸化。酸
性土壤属于氮饱和类型, 不同程度改变了氮矿化、
硝化和硝酸盐淋失的速率。高氮负荷造成土壤硝化
速率增加, 自养氨氧化细菌群落代谢活性降低[37]。
Mergel等[38]靶定 nifH、narG、nirK和 nosZ基因, 研
究了德国科隆附近酸性林地土壤固氮和反硝化细菌
种群, 发现微生物功能群数量在 0~5 cm 土层最高,
并随深度增加而降低 , 且各土层硝酸盐浓度较高 ,
但对土壤中固氮和反硝化细菌的分布无影响。在挪
威云杉林酸性土壤也有类似发现, 微生物功能群呈
现季节性波动, 秋冬春季数量最高, 夏季数量较低,
施铵肥并不引起以上微生物功能群结构的改变[39]。
Röcsh 等[40]发现橡树和铁树混交林酸性土壤固氮细
菌丰度较低, 而反硝化细菌多样性较丰富。
Yeager 等[41]发现, 混交针叶林土壤固氮细菌和
氨氧化细菌受燃烧影响较大, 野火后土壤微生物生
物量和以上两种微生物数量占土壤微生物总数的比
例降低, 固氮细菌优势种群的数量在火烧后有所增加,
1032 中国生态农业学报 2009 第 17卷


其中梭菌(Clostridium)和类芽孢杆菌(Paenibacillus)在
火烧土壤中丰度较高。亚硝化螺菌属类群进化簇 1,2,4
在未火烧土壤氨氧化细菌中占有绝对优势 (80%~
90%), 而亚硝化螺菌属进化簇 3a在火烧土壤氨氧化
细菌中占有一定优势(65%~95%)。
地点和植被转换也一定程度影响林地土壤氮循
环过程。在美国俄勒冈州, 红桤木和道格拉斯冷杉
是当地的主要树种, Boyle等[42]基于安德鲁斯林地的
氮矿化量和总硝化率较低, 塞勒姆林地的较高进行
了一系列试验, 发现红桤木的硝化潜能显著高于道
格拉斯冷杉, 而从地点来看, 塞勒姆林地土壤的硝
化潜能显著大于安德鲁斯林地, 氨氧化细菌的 amoA
在两地均有发现, 而古细菌 amoA 仅能在塞勒姆林
地检测到, 氨氧化细菌序列与亚硝化螺菌属进化簇
1,2,4 密切相关。在安德鲁斯林地到草地的过渡带,
草地的硝化和反硝化潜能显著大于林地, 硝化和反
硝化细菌群落发生转换, 亚硝化螺菌进化簇 4 是土
壤硝化细菌的优势类群, 根瘤菌是该地反硝化细菌
的优势类群[43−45]。
2.3 草地生态系统
草地生态系统中, 土壤中氮绝大部分为有机结
合态(99.5%), 无机形态氮仅占全氮的 0.5%左右, 维
持在很低水平。在植物生长过程中, 有机氮化合物
在土壤微生物作用下, 分解释放出植物可吸收利用
的多种形态氮素(硝态氮、铵态氮和各种氨基酸等),
食草动物通过采食植物和向土壤归还有效性高的营
养物质(粪和尿)。因此, 氮肥施加、放牧收割以及水
热因子等是影响草地生态系统氮循环正常运转的主
要原因。
高水平的氮输入对草地生态系统的植物多样性
有负面影响 , 在降低植物种群多样性分布的同时 ,
也间接影响了土壤微生物对氮素的周转[46]。研究发
现, 硝酸盐浓度的短期波动对硝酸盐还原菌结构未
造成剧烈变化, 暗示该功能群对硝酸盐具有较高抗
性, 硝酸盐浓度下降和 pH 值上升说明硝酸盐还原
菌代谢活跃[47]。施氮肥降低了 β-变形菌亚纲氨氧化
细菌的异质性和多样性。其中, 未施加氮肥处理中
氨氧化细菌多样性更丰富, 优势种群为亚硝化螺菌
进化簇 1,3和亚硝化单胞菌进化簇 7, 而施加氮肥处
理则为亚硝化螺菌进化簇 3 和亚硝化单胞菌进化簇
7[48]。
放牧和收割等管理措施也影响了土壤氮的矿化
−固定过程 , 增加了土壤氮的矿化速率和植物的吸
氮量。过度放牧则会导致草场大面积退化, 典型草
原被野草类植物所代替, 一定程度上影响着草地土
壤微生物群落。Patra等[49]发现这些管理措施显著影
响着土壤真细菌、固氮细菌、硝酸盐还原细菌和氨
氧化细菌 4 个种群的种群结构, 其中植物种类显著
影响硝酸盐还原细菌种群结构, 而对土壤真细菌、
氨氧化细菌有较弱或中等程度影响, 对固氮细菌种
群遗传结构无明显影响。
温度也是影响草地硝化作用的重要环境因子之
一。Avrahami 等[50]通过 amoA 基因的变性凝胶梯度
电泳指纹图谱分析, 发现酸性草地土壤在 30 ℃以
下可检测到亚硝酸螺旋菌进化簇 1, 且 25 ℃时亚硝
酸螺旋菌进化簇 4为优势类群, 30 ℃时亚硝酸螺旋
菌进化簇 3a、3b和 9为优势类群。而碱性草地土壤
仅在亚硝酸螺旋菌进化簇 3a内发生群落结构演替。
Sharma等[51]发现冬、夏季土壤反复冻融造成 N2O排
放载荷每年增加 20%～70%, N2O在土壤融化第 5 d
达到峰值, 土壤细菌和真菌群落结构发生了显著转
换, 与反硝化过程密切相关的 napA和 nirS基因在融
化初期表达水平增加 , 随后表达水平逐渐降低。
cDNA-DGGE 指纹图谱显示反硝化细菌存在明显的
群落演替现象。
3 展望
与土壤其他元素循环相比, 氮素循环更受到各
国研究者的广泛关注。其原因主要在于：首先, 氮
既是植物必需的营养元素, 又是造成环境污染的重
要元素。其次, 对参与氮循环各重要生态过程的微
生物功能类群的了解比较清晰, 而编码特定功能酶
的功能基因不断成功破译, 极大地促进了与氮循环
密切相关的微生物生态学领域向纵深发展。
目前, 对氮循环特定关键过程功能基因受环境
因子影响的研究较多, 而全面系统研究环境因子如
何连锁性影响氮循环不同代谢过程的微生物种群的
研究很少, 例如, 我们不仅关注不同类型肥料施加
对土壤硝化作用中 amoA 基因型和丰度的变化, 还
关注其对土壤反硝化作用中 nirS、nirK和 nosZ等基
因类型和丰度的变化。气候等环境变化对土壤氮循
环的影响逐渐受到关注。在下个世纪, 北极圈大气
温度升高效应越来越显著, 这种生态效应一方面通
过改变植物群落组成方式提高了植物群落的生产力,
另一方面也间接影响了土壤养分循环, 微生物功能
基因数据与土壤养分数据结合, 将大大促进这一过
程更深层次阐述[52]。
总之 , 在生物化学和生物信息学发展基础上 ,
解析参与氮循环不同代谢过程的功能酶与功能基
因, 完善相应引物设计, 有助于从微生物功能基因
多样性角度深入研究土壤氮循环过程及其影响
机制。
第 5期 张 晶等: 参与土壤氮素循环的微生物功能基因多样性研究进展 1033


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