全 文 ：浙 江 林 学 院 学 报　2004 , 21(1):110 ～ 114
Journal of Zhejiang Forestry College
　　文章编号:1000-5692(2004)01-110-05
收稿日期:2003-09-26;修回日期:2003-12-02
基金项目:浙江省自然科学基金资助项目(302362)
作者简介:何新华(1966-), 男 , 湖南衡阳人 , 副教授 , 从事生物技术与生物固氮研究。 E-mail:honest66222@sohu.com
非豆科木本植物与放线菌共生固氮
相关基因研究进展
何新华1 , 2 , 陈力耕1 , 陈　怡1
(1.浙江大学 农业与生物技术学院 园艺系 , 浙江 杭州 310029;2.广西大学 农学院 园艺系 , 广西 南宁 530004)
摘要:氮素固定是地球上维持生产力的一个重要生态反应 , 是继CO2固定之后最重要的生化
反应。非豆科木本双子叶植物与固氮放线菌 Frankia 共生形成根瘤固氮 ,这些植物对绿化荒
山 、防止水土流失和保护生态环境等具有重要的作用 ,它们是陆地生态系统中的重要供氮者 。
Frankia菌具有对宿主的侵染范围广 、固氮活性比较强和对氧气不敏感等特性 ,在Frankia菌与
农作物之间建立起新的共生固氮体系的可能性很大。利用生物工程技术和方法构建高效的
Frankia工程菌和新的固氮共生体系将成为今后生物固氮研究领域中的发展方向和追求目标 。
重点介绍了弗氏放线菌中共生固氮相关的固氮基因和谷氨酰胺合成酶基因 、根瘤中结瘤固氮
相关的 nod 基因 、 血红蛋白 cDNA 克隆及其他根瘤特异蛋白 cDNA 克隆等方面的研究进展 。
参33
关键词:植物学;生物固氮;放线结瘤植物;放线菌;共生;基因
中图分类号:Q945.13　　　文献标识码:A
在自然界 , 有 8科 24属 200多种非豆科木本双子叶植物与固氮放线菌 Frankia 共生形成根瘤固
氮[ 1 ,2] 。这类植物统称为放线结瘤植物。它分布广 ,适应性强 ,是绿化荒山的先锋树种 。因其有固氮作用 ,
能培肥 、改良土壤 ,故常作为混交林的半生树种 ,是森林生态系统中的重要供氮者[ 2] 。自 1978年 Frankia
的纯培养及分离成功以后 ,人们对其细胞学 、分类学 、形态学 、生理生化和遗传学等方面都进行了研究 ,
取得了很多突破 。随着分子生物学的发展 ,采用分子生物学手段研究放线菌 Frankia 及与非豆科木本双
子叶植物共生固氮 ,已成为当前非豆科木本植物共生固氮的研究热点 。而对放线结瘤植物共生固氮相关
基因的研究是非豆科木本植物共生固氮的核心内容之一 ,有利于揭示放线结瘤植物共生固氮机理 ,为构
建高效的 Frankia 工程菌和新的固氮共生体系奠定基础。由于放线结瘤植物共生固氮是由 Frankia 菌侵
染宿主植物形成根瘤 , 在根瘤中进行固氮 , 因而本文将从 Frankia 菌和根瘤 2个方面介绍非豆科木本
植物与放线菌共生固氮相关基因的研究进展 。
1　弗氏放线菌中的共生固氮相关基因
目前 , 已报道的弗氏放线菌中共生固氮相关基因主要有固氮基因(nif)、谷氨酰胺合成酶(GS)基
因 、一些水解酶基因及固氮酶氧保护相关的基因。固氮基因包括 nifH , nifD , nifK , nifA , nifB , nifX , nifW ,
nifZ , nifV , nifE , nifN , nifU和 nifS及一些 orf基因[ 1 , 3] ,其中对固氮酶结构基因(nifHDK)研究较多 ,部分
固氮基因的功能尚不清楚 。谷氨酰胺合成酶基因包括 glnA和gln Ⅱ2个基因。
1.1　nif 基因
采用异源探针 、 限制性内切酶图谱和核苷酸序列分析相结合的方法 , 至今已构建了 3个 Frankia
菌株nif 基因的遗传图谱 , Frankia 菌株 EuIK1的 nif 基因顺序为nifK-E-N-X-orf3-orf1-W-Z-B-V-orf2-
S-or a-or b-fdx Ⅰ[ 3] , Frankia 菌株 FaCl的 nif 基因顺序为orfA-orfB-nifV-H-D-K-E-N-X-W-B , Frankia
菌株CpI1的 nif基因顺序是nifH-D-K-3kb-X-orf3-orf1-W-Z-B-orf2-U[ 4] 。这些 nif基因分别属于不同的
操纵子。
nifH , nifD和 nifK基因是分别编码固氮酶的 Fe 蛋白和MoFe蛋白的结构基因 , 3个基因连锁成簇
排列在染色体上[ 3～ 8] , 而且这 3个基因的核苷酸和氨基酸序列比较保守 , 但不同菌株之间 nifH 和
nifD及 nifD和 nifK之间的间隔序列在长度和同源性上差异较大[ 8] 。
nifA是正调控基因 , 在 Frankia EuIK1菌株中发现 2个 nifA基因 , nifA1和 nifA2的完整核苷酸序
列长度分别为 1 926 bp和 1 524 bp[ 9] 。在 Frankia EuIK1菌株中还分离到含氧酸铁氧还蛋白氧化还原酶
基因 (or)和铁氧还蛋白基因 (fdr)。Frankia or基因与肺炎克氏杆菌Klebsellia pneumoniae 的nifJ基因
序列的同源性为 4%, 而 Frankia fdr 基因与棕色固氮菌 Azotobacter vinelandii 的 fdxI 基因有 56%核苷酸
序列相同 。这 2个基因的产物在共生中可能与固氮和碳代谢有关[ 10] 。
1.2　glnA和 gln Ⅱ
谷氨酰胺合成酶是把 Frankia 菌固定的氮素同化并转移到植物体内的一种酶 , 现已从 Frankia 菌
中分离到 2个编码谷氨酰胺合成酶 (GS)的基因 glnA和 gln Ⅱ 。与其他具有双GS 系统的微生物不一
样 , 这2个谷氨酰胺合成酶基因连在一起 , 仅间隔 449 bp。其中 glnA基因只有一个启动子 glnAp1 ,
转录起始于 2个相邻的核苷酸。比较 Frankia glnA启动子和天蓝色链霉菌 Streptomycetes coelicolor启动
子 , 发现有 2个序列相同的区域 , 即 2个序列的-10和-35区域 。另外 , 一系列正向重复序列在启
动子附近成簇排列 , 这在链霉菌启动子区域是普遍存在的 。研究还发现 glnA 启动子和大肠杆菌
Escherichia coli 启动子或类似链霉菌-大肠杆菌的启动子之间存在一定的同源性[ 5 ,11] , Frankia 菌glnA
基因的核苷酸和氨基酸序列比较保守[ 3 ,12] 。
对编码菌株 HFP CpI1谷氨酰胺合成酶 Ⅱ的 gln Ⅱ基因分析 , 发现一个启动子 gln Ⅱp1与革兰氏阴
性细菌中的 NtrA (σ54)结合位点有少量序列相似 。比较 Frankia 菌株 HFP CpI1和绿色链霉菌 S.
viridochromogenes的gln Ⅱ基因上游序列 , 发现绿色链霉菌 gln Ⅱ基因上游序列的一个相似区域对应于
HFPCPⅠ1的 gln Ⅱp1 , 认为 gln Ⅱp1在 Frankia 菌株中作为一个氮调节的启动子 , 但未发现与 gln Ⅱ
p1重叠的正向重复序列 , 因而认为 gln Ⅱ与 glnA 的调节方式不同[ 1] 。Frankia gln Ⅱ基因产物与豌豆
Pisum sativum 的GS和大豆的GS Ⅱ有高度的同源性 , Frankia gln Ⅱ基因从载体 lac启动子转录时 , 能与
大肠杆菌 Esherichia coli ■glnA突变体互补 , 但当 Frankia 启动子转录时 , 则不能互补[ 13] 。
1.3　水解酶基因
Simonet 等在 Frankia 菌中发现了与 Erwinia chysanthemi 的 pel(果胶酶基因)和 Clostridium
thermocellum 的 cel(纤维素分解酶基因)同源的 DNA序列 。Frankia 菌在侵染宿主时与病原菌类似 ,必须
先水解植物细胞壁 ,编码这些水解酶的 Frankia菌基因被认为与结瘤有关[ 4] 。
1.4　固氮酶氧保护相关的基因
脂质胞囊是一道阻止氧扩散的屏障 , 是固氮酶氧保护系统的主要部位。在 Frankia菌胞囊中类何
帕烷 (hopanoid)含量是已知生物中最高的 , 可能与 Frankia 菌固氮酶氧保护机制有关。Dobritsa等已
从几个 Frankia 菌株中分离克隆出与鲨烯-何帕烯 (squaleae-hopene)环化酶 (shc)编码区部分同源的
328 bp DNA片段[ 15] 。
2　放线结瘤植物根瘤中的结瘤固氮相关基因
根瘤是共生固氮的场所 , 在根瘤的发育过程中产生一些专门的蛋白质如血红蛋白和结瘤素。这些
111第 21卷第1 期 何新华等:非豆科木本植物与放线菌共生固氮相关基因研究进展 　
蛋白质的基因在结瘤中顺序表达 , 与 Frankia 菌的固氮基因协同作用 , 完成共生固氮过程。一般把宿
主植物基因编码的根瘤特异性蛋白统称为结瘤素 , 编码这些物质的基因叫结瘤基因。目前对木麻黄
Casuarina equistetifolia 和赤杨Alnus japonica根瘤中相关基因如nod 基因 、血红蛋白 cDNA克隆及其他根
瘤特异蛋白 cDNA克隆进行过研究 , 对与 Frankia 菌共生固氮的其他植物结瘤相关基因研究较少。
2.1　nod 基因
Reddy 等用功能互补法从 Frankia菌株HFPCcI3基因文库中筛选到一个克隆 Rm5610NS6 , 似乎能互
补苜蓿根瘤菌 nodA∷Tn5突变体的功能 , 但进一步的实验分析结果表明 , nodA∷Tn5是因为在获得
FrankiaDNA片段的同时发生突变而恢复结瘤表型 Nod+ , 并不是由于 Frankia DNA片段互补了 nodA-
的功能才产生结瘤表型 , Rm5610NS6恢复结瘤能力与所导入的 Frankia DNA片段无关[ 16] 。崔玉海等选
用3个 Frankia菌株分别建立其质粒基因组文库 , 以豌豆根瘤菌 Rhizobinus leguminosarum 结瘤基因为探
针 , 通过菌落原位杂交 , 从文库中筛选到几个阳性克隆[ 17] 。柏学亮等利用功能互补从赤杨 Frankia 菌
株At4的基因文库中分离到 2个可能可互补豌豆根瘤菌 nod 基因功能的克隆 pAt2GX和 pAt3GX , 并验
证了这2个克隆的互补功能[ 18] 。但迄今为止 , 在 Franida 菌中未发现与根瘤菌nod 同源的 DNA序列 。
2.2　血红蛋白 cDNA克隆
血红蛋白是晚期结瘤素之一 , 在豆科植物和非豆科植物中广泛存在 , 分成共生血红蛋白和非共生
血红蛋白 2种类型 , 其中共生血红蛋白与结瘤固氮有关 。迄今 , 在部分 Frankia 放线菌结瘤植物的根
瘤中也发现了血红蛋白。 Jacobsen-Lyon等[ 19]从木麻黄根瘤 cDNA表达文库中分离到 3个共生血红蛋白
cDNA克隆 , 这些 cDNA克隆属于一个基因家簇 (cashb-sym), 有 90%的氨基酸序列相同 , 它们仅在根
瘤组织中表达。它们与一个单拷贝非共生的血红蛋白基因 (cashb-nonsym)有 53%的氨基酸序列相同 ,
这个非共生的血红蛋白基因在根瘤组织及与共生无关的根组织中表达水平低 。Jacobsen-Lyon等还鉴定
出2个共生和非共生的木麻黄血红蛋白的启动子区 , 并在一个转基因GUS融合的 Lotus系统中检测其
活性。 cashb-sym启动子区含有豆血红蛋白结瘤素 box 共同序列 AAAGATn6CTCTT 的几乎全部拷贝
(AAAGATn7CTCTT), 木麻黄属植物根瘤血红蛋白及其基因序列与大豆的一个新血红蛋白基因的同源
性为 85%～ 87%[ 20] 。木麻黄根瘤共生血红蛋白基因与拟南芥 Arabiopsis thaliana 的一个非共生血红蛋
白 (Claes 2)基因 (AHB2)也有同源性[ 21] 。Gherbi等[ 22]从粗枝木麻黄根瘤分离到一个大型共生血红
蛋白 cDNA (hb-Cg1F), hb-Cg1F mRNA与 Frankia 菌感染状态的相关。Hb在 nif基因表达前对降低氧
气在宿主细胞的细胞质中集聚是很必需的。
2.3　其他根瘤特异蛋白 cDNA克隆及相关基因
据报道 , 迄今已从赤杨根瘤 cDNA 文库中分离到富含谷氨酸和脯氨酸的 cDNA克隆 pAg13[ 23] , 2
个类似枯草杆菌 Bacillus subtilis蛋白酶的丝氨酸蛋白酶Ag12-1和Ag12-2[ 24] , 编码根瘤特异的半胱氨酸
蛋白酶 (AgNOD-CP1)的 cDNA克隆 pAgNg118-203[ 25]富含甘氨酸/组氨酸蛋白质 (AgNOD-GHRP)的一
个基因家簇的不同成员 pAgNt84[ 4 , 26]和 pAg164[ 27]的 2个 cDNA克隆 , PEP 羧化酶的 cDNA 克隆[ 4] , 果
糖激酶和谷氨酸合成酶 cDNA 克隆[ 4] , 脂肪酸还原酶 cDNA克隆[ 4] , 蔗糖合成酶和烯醇化酶的 cDNA
克隆[ 4]等。Bogusz等从木麻黄根瘤中分离出一个金属结合蛋白———金属硫蛋白 cDNA克隆[ 4] 。这些基
因都与结瘤固氮有关 。
3　放线结瘤植物共生固氮基因的利用与展望
利用 Frankia 菌和链霉菌Streptomyces进行原生质体融合 ,已成功地得到了具有嵌合性状的融合子 ,
传代 10次仍保持其结瘤 、固氮和抗生特性[ 28 ,29] 。利用发根农杆菌 Agrobacterium rhizogines和根癌农杆菌
A.tumefacines转染 ,已经在木麻黄科植物上建立了两个转基因系统 ,能在木麻黄上形成转基因的放线
菌固氮根瘤 ,具有固氮酶活性[ 30～ 32] 。
此外 , 潘建菁等[ 33]应用 Frankia菌接种水稻Oryza sativa和玉米Zea mays , 在 2 , 4-D诱导下苗木
出现瘤状突起 , 经测定具有与根瘤菌相似的乙炔还原活性 。
应用现代科学技术建立和完善生物固氮体系已经成为解决人类目前所面临的人口 、 粮食 、能源和
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环境等问题的重要技术措施 , 生物固氮研究已经引起越来越多人的关注。同根瘤菌与豆科植物共生固
氮相比 , Frankia 菌与非豆科木本双子叶植物共生固氮的分子生物学研究尚处于起步阶段 ,对 Frankia
菌固氮基因的调控机理 、Frankia菌与非豆科木本双子叶植物之间的信号传递 、相互识别 、基因的顺序性
表达和调节及对根瘤形成 、发育和固氮作用大小的影响等相互作用的机理 、功能基因组学和蛋白质组学
等方面的研究几乎是空白 。但由于 Frankia 菌具有跨越科 、属植物进行侵染结瘤固氮的特性 ,被认为是
研究扩大寄主范围 、结瘤机制 、固氮基因转移和构建新的固氮物种的理想材料 ,研究和应用潜力巨大 ,也
越来越受到重视 。从研究现状来看 ,试图通过基因工程将 nif基因从豆科植物转移到非豆科农作物中难
度比较大 ,在短期内很难实现 ,而采用细胞工程方法将根瘤菌导入非宿主农作物细胞内则切实可行。除
此之外 ,由于 Frankia 菌具有对宿主的侵染范围宽 、固氮活性比较强和对氧气不敏感等特性 ,在生物固
氮研究中对 Frankia 菌的研究将更为重要 ,有可能由此会找到新的突破口 ,在 Frankia 菌与农作物之间
建立起新的共生固氮体系将具有更大的可能性。随着研究的不断深入 ,人类将进一步揭示 Frankia 菌共
生固氮的奥秘 ,阐明其遗传机制。利用生物工程技术和方法构建高效的 Frankia 工程菌和构建新的固氮
共生体系将成为今后生物固氮研究领域中的发展方向和追求目标。
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Review of related genes of nitrogen-fixation about nonleguminous
woody dicotyledonous plants in symbiosis with actinomycete
HE Xin-hua1 ,2 , CHEN Li-geng1 , CHEN Yi1
(1.Department of Horticulture , College of Agriculture and Biotechnology , Zhejiang University , Hangzhou 310029 ,
Zhejiang, China;2.Department of Horticulture , College of Agriculture , Guangxi University , Nanning 530004 ,
Guangxi , China)
Abstract:Nitrogen fixation is one of important ecological reactions sustaining productive force on the earth , only
second to CO2 fixation.The non-leguminous woody dicotyledonous plants can fix nitrogen gas in symbiosis with
actinomycete Frankia , which has very significant effects on soil restoration , fuel wood , production of wood and
derivatives , agro-forestry , coastal restoration , and the prevention of desertification.These plants are important
nitrogen suppliers among land ecological system.Frankia has the characteristics of extensive host ranges , higher
nitrogenase activity and insensitive to oxygen , so it is very likely to establish a new symbiotic nitrogen-fixing system
between Frankia and crops.Highly efficient engineering Frankia strains and new symbiotic nitrogen-fixing system
obtained by the approaches and technologies of biological engineering will be the most important objectives in the
field of biological nitrogen fixation in the future.We will focus on the research progress about Frankia genes
involved nitrogenmetabolism (including nif gene organization , gln and gln Ⅱ), genes related to nodulation such
as nod genes , hemoglobin genes and other nodule-specific cDNA clones in root nodules formed by infection of
Frankia in the paper.[ Ch , 33 ref.]
Key words:botany;biological nitrogen fixation;actinorhizal plants;actinomycete;symbiosis;gene
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