全 文 ：广 西 植 物 G u ih a i a g( 3 ): 2 4 3一2 4 6 . 18 9 9
甘蔗幼叶切段培养中的体细胞胚胎发生
李春瑶 李军生 梁倩华 杨继华
( 广西师范大学生物系 , 桂林 )
摘要 本文从形态学和组织学方面研究了甘蔗幼叶胚性愈伤组织发生及体细胞胚胎的形 成 过
程 。 甘蔗幼叶片切段培养于含 2 . 4一 D l . s m g / 1 的M S培养基上 , 4 一 6 天后切段 开始形成愈伤组
织 . 约 10 天后愈伤组织表面出现白色颗粒状结构 。 将含有白色颗粒状结构的愈伤组织转移至 不 含
激素的培养基中 , 7 一 10 天后可见有小植株长出 。 组织学和形态学观察表明 , 甘蔗离体 再生植株
是通过体细胞胚胎发生途径 。
关键词 甘蔗 ; 体细胎胚胎发生
甘蔗是重要的禾本科植物 ,全世界每年的食糖有 65 %来源于甘蔗 。 目前甘蔗组培技术已被
广泛地应用于研究甘蔗生理 、 甘蔗无性快速繁殖 、 甘蔗突变体育种及病毒去除等方面 仁` ’ “ ’
` 2” 弓” ` ’ ` , 〕 。 关于甘蔗 离体再生 的成苗途径 , 目前有多种看法 , 有的研究者们认为通过不
定芽途径即愈伤组织分化芽途径 〔 2 ’ ` ” ’ ` ” ’ 7飞 , 有的认为通过体细胞胚胎 发 生 途 径 [今” 。 ,
2 ’ 〕 , 有的则认为两条途径都存在 :5 J 。 大多数这些结论 的得出 , 都缺乏详尽的形 态科学及组
织学证据 。 本实验以广西培育出的甘蔗 良种桂糖 1 号为材料 , 从组织学及形 态学方面详细研
究甘蔗离体培养中愈伤组织发生和体细胞胚 的形 成过程 。
材 料 和 方 法
材料 本实验中采用的材料是广西培育的良种桂糖 n 号 。 蔗种由柳城 县甘蔗研究中心提
供 , 栽种于网室 。 实验时 , 取成长蔗 ( 高约 2 米 ) 蔗尾 , 用 70 %酒精消毒外表后 , 剥去外层
老叶 , 无菌条件下取 一 1 及 一 2 叶叶片 , 用解剖刀将幼嫩部分切成 Z m m 长的切段 , 分别放在含
有一定激素浓度的培养基中培养 , 每个 150 m m l 三角瓶放 10 个切段。
培养墓 基本培养基为 M S , 附加蔗糖 3 % , 琼脂 0 . 8 % , P H S . 8 , 附加不 同浓度的2 . 4 -
D构成各种培养基 。 培养基在 1 . 2 k g / c m Z下灭菌 20 分钟 。
培养条件 愈伤组织诱导及继代培养在黑暗进行 , 胚状体分化及成苗则在光下 ( 约 1 5 0 0
L u x )
, 培养温度 2 5 ℃ , 相对湿度 60 一 80 % 。
组织学方法 在外植体培养的不同时期 ( o , 2 , 4 , 6 , s , 1 0 , 1 2 , 1 4 , 1 6 , 1 5 ,
2 0天 ) 及愈伤组织分化的不同阶段 ( 0 , 2 , 4 , 6 , 8 , 1 0 , 1 2 , 1 4天 ) 取培养材料固定
于 F A A 固定液中 , 固定好的材料经一系列不同浓度梯度的乙醇脱水 , 然后按常规石 蜡 切片
法制片 , 切片厚度 10 一 1 2拼, 代氏苏木精染色 。 制好 的片在奥林匹斯显微镜下 观察 并 摄影 。
广 西 植 物 匀卷
结 果
一 、 甘蔗叶片切段脱分化和 愈伤组织形成过程
将幼嫩的日一卜片切段 ( Zm 。 长 ) 置于含 2 . 4一 D l .s m g / 1的M S培养基 中 , 一天后 , 即可见
叶片切段吸水膨胀 、 伸长 , 三天后切段几乎伸长专倍 。 第四天 , 用放大镜可观察到两端切口
出现突起 , 第六天用肉眼即可看到在两端切 口靠背表面的地方有淡黄色的愈伤组织形成 , 而
在叶片的上表面很少或没有愈伤组织形成 。 这些淡黄色的愈伤组织随培养时间的延长而逐渐
增多 。 在切 口 部位长出的愈伤组织渐渐由两切 口向背面表皮漫延 ,最后从叶片的背表面包围了
整个切段 。 从叶片上刚产生出来的愈伤组织多为淡黄色 , 培养 10 天后 , 在这些淡黄色的愈伤
组织中开始出现 白色致密的颗粒结构状 , 这些白色颗粒状结构增殖很快 , 如果将含有这些颗
粒状结构灼愈伤组织转移到不含激素的培养基中 , 则约 7 一 10 天后可见小植株长出 。
通过组织学方法可把生产出来的愈伤组织分为胚 `!生愈伤组织和非胚性愈 伤 组 织 两类 。
胚性愈伤组织较硬 , 结构紧密 、 表面光滑 、 轮廓清楚 , 主要由细胞小 、 细胞质浓厚 、 核大而
染色深的细胞组成 , 细胞间排列紧密 。 胚性愈伤组织细胞极易分化出胚状体 , 因而在这类愈
伤组织上可看到许多大小不同的白色颗粒状结构 ( 图版 I : 1 ) 。 另一类愈伤组织淡褐色 ,
结构松软 、 轮廓不清楚 , 它 由细胞较大 、 浓袍化 、 核相对较小且排列松散的细胞组成 ( 图版
I : 2 )
, 这类愈伤组织偶尔能分化出根 。
叶片在含有2 . 4一 D l . s m g / 1的 M S培养基上 , 主要产生胚性愈伤组织 , 其 占总愈伤组织
的 80% 以上 , 因而在分化培养基上能分化出大量胚状体 , 继而发育成完整植株 。
从组织切片上可以看出 , 培养初期由于细胞吸水 , 使得叶片背表面正对着小维管束的都
位产生突起 。 培养 2 天后 , 即可见两突起间的表皮细胞及两小维管束间薄壁细胞恢复分裂机
能 ( 图版 I : 3 ) , 细胞分裂逐渐形 成一个分生中心 , 由这一分生中心继续分裂导致愈伤组
织形成 ( 图版 I : 4 ) 。 通过这种方式产生的愈伤组织具有胚胎发生的能力 。
叶片还有一种形成愈伤组织的方式 , 这种方式的细胞 分裂首先见于小维管束上方细胞突
起的表皮下细胞 ( 图版 I : 5 ) , 这些细胞分裂产生分裂中心 , 突破表皮而形 成而可见的愈
伤组织 ( 图版 I : 6 ) 。 目前还不能断定 由这种方式形成的组织是否非胚性 , 但见愈伤组织
表面细胞排列很松散 。
二 、 叶片切段培养中的体细胞胚胎发生
叶片切段培养约 10 天后 , 在产生的胚性愈伤组织表面即出现一些细胞质丰富 、 细胞核较大
的细胞 (凶版 I : 7 ) 。 这些细胞具有胚胎发生能力 ,在含有 2 . 4一 D培养基上 ,这 些胚性细驹分
裂形成 2 、 4 、 8 及多细胞的结构 (图版 I : 8 ; l : 9 , 10 ) , 并进一步发育为球形胚 ( 图版! :
11 )
。 这些球形期胚状体如果转移到不含激素的培养基 中 , 则很容易发育为成熟胚并萌澡成完
整植株 。 组织学观察证实 , 这些球形胚的进一步发育与禾本科植物合子胚的胚胎发育过程极
为相似 。 它首先在球形胚的一侧进行细胞分裂形 , 成一个小突起 (图版 I : ` “ ) , 随后在禅个突
起部位分化出胚根及胚芽原基 (图版 l : 1 3) , 并进一步发育为成熟胚 (图版 l : 14 一 15) . 成
熟的胚状体具有禾本科植物合子胚所具有的典型特征 , 即盾片 、 胚芽鞘 、 胚芽 、 胚根和胚根
鞘 。 胚状体 与母体愈伤组织无维管联系 , 只是通过 由数个或数层细胞构成的胚柄状结构与愈
3期 李春瑶等 : 甘蔗幼叶切段培养中的体细胞胚胎发生
伤组织相连 。 成熟的胚状体在不含2 .4 一D 的培养基 中可萌发成完整植株 ( 图版 I: 6 1 )。
讨 论
1
。 关于甘蔗组织培养过程中的成苗途径
目前 , 关于甘蔗组织培养过程中植株再生途径的观点很多 , 但许多这些观点的得出都缺
乏详尽的组织学证据 〔 “ ’ 〕 。 H o a n d V as il 红2 ” 通过对甘蔗离体再生途径及一系列禾 本 科植
物离体再生途径的研究后指出 , 甘蔗离体再生植株可能都是通过体细胞胚胎发生途径而非其
它途径 。
H ac
c
iu
s认为 , 判断体细胞胚的重要待征是它具有两极性 , 在胚状体发育早期即在方向
相反的两极有苗端和根端的分化 ; 在胚状体的发育过程中 , 它的维管组织与愈伤组织无联系
( 引自张不方 仁7 」 ) 。 从本实验中形成的胚状体来看 ,完全符合 H ac o isu 判断胚状体的条 件 ,
产生的胚状体也与禾本科植物合子胚 “ 的一样 , 具有单片的盾片及胚芽鞘 、 胚芽 、 胚根及胚
根鞘等结构 。 胚状体上胚芽鞘出现在叶片出现之前 , 这与 A h l o w al ia 一 “ 〕区分甘蔗不定芽发
生和胚状体发生的观点是一致的 。 本实验的组织学观察还发现胚状体的发育过程与禾木科植
物合子胚的胚胎发育过程类似 , 因而认为 , 在木实验条件下 , 甘蔗幼叶片离体再生植株是通
过休细胞胚胎发生途径 。
2
。 体细胞胚胎的起源
关于禾本科植物离体胚胎发生的起源问题 , 目前有两种观点 , 一是认为通过 多 细 胞 起
源 , 胚状体直接 由一团胚性愈伤组织分化而来 ` “ ’ 2 ” 。 更多的研究者认为体 细 胞胚来源于
核大 、 细胞质浓厚 、 细胞壁厚的胚性细胞 ” ” 。” 8 一 “ “ 〕 。 从本实验结果看出 , 甘蔗体细胞胚
是从单细胞发生的 , 由胚性单细胞经过类似合子胚胚胎发育途径发有成成熟的胚状体 , 而不
是通过多细胞起源 。
参 考 文 献
〔 1 〕 轻工业部甘蔗糖业研究所等 , 1 9 8 5 : 甘蔗我培学 1 3 3一 1桩页 , 农业科学出版社 。
〔 2 〕 叶树茂等 , 1 0 7 9 : 植物生理学通讯 , J 9 7 : ) ( 3 ) : 1 3一 z G。
( 3 〕 韩光禧等 , 1 0 8 3 : 广西农学院学报 , ( 3 ) : 8 3一94 。
〔4 〕 曾吉恕 , 1 0 7 9 : 植物生理学报 , 5 ( 4 ) : 吐2 2一、 2 6 。
〔 5 ) 梁倩华等 , 1 9 8 4 : 植物生理学通讯 , ( 2 ) : 哭一咒 。
〔6 〕 李杨汉 , 1 0 7 9 : 禾本科作物的形态与解剖 4 8 页 , 上海科技出版社 。
〔 7 〕 张不方等 , 2 9 8 2 : 植物学报 , 2 4 ( 3 ) : 2 5 2一 2 8理。
〔 8 ) A h l o o w a l i a , B . 5 . e t a l , 2 9 8 3 : P l a n t r e 乙e n e r a t i o n v i a s o m a t i e e m b r y o g e n e s i s i n
s u g a r e a e n
.
P l a n t C e l l R o p o r t Z
:
2 2一 2 5 .
〔 9 〕 B o t t i , C . e t a ! , 1 9 8 2 : C a n . J . B o t . 6 2 : 1 6 2 9一 1 6 3 5 .
〔1。〕 H e i n z , D . J . a n d M e e , G . W . P . 2 9 6 9 : C r o p S e i . g : 3 4 6一 3 4 5 .
〔1 1〕 H e i n z , D . J . o t a l , 1 9 7 7 : I n : A p p l i e d a 二 d f u n d a m e n t a l a s p e e t s o f p l a n t e e l l ,
t i s
s u e a n d o r g a n e u l t u r e ( R
e
i n e
r t
, e t a l e d 。 ) 3一 1 7 . N e w Y o r k .
〔2 2 〕 L i u , M . C . 2 9 8 2 : I : : P l a n t t i s s u e e u l t u e r 一M e t il o d : a o d a p p l i e a t i o n s i n a g r i e u l -
2 4 6广 西 植 物 9 卷
tu re
.
( T
.
A
.
T ho r pe e d) 29 9一3 24 .A e a de m i e P re s s .
〔1 3 〕 M eC a i n, J . W . 1 9 86 : B o t . G a z . 1 4 7 ( 4 ) : 4 5 3一 4 6 0 .
〔14 〕 M o r i , K , 1 9 7 1 : J A R Q . 6 : 1 一 7 .
〔1 5 ) N a d a r , H . M . e t a l , 1 9 7 7 : C r o p S e s . 1 7 : 8 1 4一 8 1 6 .
〔16 〕 N a d a r , H . M . e t a l , 2 9 7 5 : C r o p S e i . 1 5 : 2 1 0一 2 1 6 .
〔17 〕 N i e k c l l , L . G . 1 9 6 7 : P r o e . I S S C T 1 2 : 8 5 7一 5 9 2 .
( 1 8〕 V a 5 11 , V . e t a l , 1 9 5 1 : A m e r . J . B o t . 6 5 ( 6 ) : 86 4一 5 7 2 .
〔1 9〕 V a s i l , V . e t a l , 1 9 8 2 : A m e r . J . B o t . 6 9 ( 9 ) : 1 4 4 1一 1 4 4 9 .
〔2 0〕 W a n g , D . Y . e t a l , 1 9 8 2 : P l a n t S e i . L e t t . 2 5 : 1 4 7一 1 5 4 .
〔2 1〕 W a i一 J a n e H o , V a s i l , I . K . 1 9 5 3 : P r o t o p l a s m a . 1 1 5 : 2 6 9一 2 8 0 .
〔2 2〕 W a i一 J a n e H o , V a s i l , I . K . 19 8 3 : A n n . B o t . 5 1 : 7 1 9一 7 2 6 .
〔23〕 W o r n i e k e , 1 9 8 2 : p r o t o p l a m o a竺1 1 1 : 5 3一 6 2 .
SOM A T IC E MB RYOG EN E S!5 AN D P L AN T RE G E N ER AT旧N
F R OM LE AF T IS SU E S O F S U G ARC A N E
L i
,
C h u n Y a o ; L i
,
J u n S h e n g ; L i a n g
,
Q i a n H u a a n d Y a n g
,
J i H
u a
( D e P a r t m e
n t o f B i o l o g y
,
G u a n g x i N o r m a l U n i v e n s t i y )
Ab : r t a e t T h e f o r m a t i o n o f e : n b r y o g e n i e e a l l u s a n d s o m a t i e e m b r y o g e n e s i s f r o m
s u g a r e a n c ( S
a e e h a r u m o f f i e i n a r u m L
.
) l
e a v e s w e r e i n v e s t i g a t e d
.
W h e n e u l t u r e d o 血
m e d i u m s u p p l o m e n t e d w i t h 2
.
4 一 d i e h l o r p h e n o x y a c e t i e a e sd ( 2
.
4 一D ) 1
.
5 / z
, s u e r o s e 3 男 ,
s e g m e n t s o f y o u n g l e a v e s b o g a n t o p r o d u e e e a l l u s a f t e r 4 一 6 d a y s i n e u l t u r e , a n d
t h e a nt o u n t o f e a l l u s i n e r e a s e d w i t h t h e e u l t u r e t im e
.
I n a b o u t 1 0 d a y s s o m e w h i t e
,
e o m P a e t n o d u l a r s t r u e t u r e s a p p e a r e d o n t h e s u r f a e e o f t h e e a l l u s
.
H i s t o l o g i e a l s t u d -
1
0 5 s h o w e d t h a t t h e w il i t e e o m p a e t n o d u l a r s t r u e t u r e s w e r e e m b r y o i d s w h i e h a p p e a r -
e d i n t h e e a r l y d e v e l
o
P i n 乳 s t a g e . T r a n s f e r r e d o f t h e e a l l u s e o n t a i n i n g n o d u ! a r s t r -
u e t u r e s t o M S m e d i u m d e
v o i d i n g o f P l a n t h o r m o n e s
,
p e r f e e t e m b r y o i d s w e r e f o r 坦 e d
w h i e 五 d e v e l o p e d l a t e r i n t o p l a n t l e t s . I t w a s s u g g e s t e d t h a t t h e P l a n t s r e g e n e r a t e d
f r o m t h e e a l l u s v i a s o m a t i e o m b r y o g e n e s i s
.
K e y w o r d s ; u g a r e a e n ; s o m a t i e e 血 b r y o 塞e n e s i s