全 文 ：I’ 西 植 物 Cu i h a i a 1 0 ( 1 ) : 4 9一 5 3. 1 9 90
大白杜鹃染色质组成成分的研究
张洪渊 刘克武 杨守忠 罗胜清 杨玉龙
(四川大学生物系 , 成都 》
摘要 采用略加改进的 H u a n g 及 B o n n e r 法和 S i n d a i r 法制备四川荣经大白杜鹃 ( R h o -
d o d e o d or o d ec or “ 仍 F ar cn h . ) 的染色质 . 分析其组成成分 , 其结果为蛋白质 : D N A o l . 5 :0
组蛋白 , D N A = 1 . 0 5 : 非组蛋白 , D N A 二 0 . 4 5 ; RN A : D N A = 0 . 1 3。
关键词 杜鹃花属 ; 染色质 ; 组蛋白
国内外不少作者对高等植物染色质作了一系列研究 , 先后对洋 葱 、 大 麦 、 小 麦 、 萝 卜
I ’ J 、 豌豆 [ “ , 、 大豆 1 3〕 、 花椰菜 I` 」、 裸麦 I “ 〕 、 烟草 `“ 〕 、 马铃薯 1 7〕等进行了染色质 组 成
分析 , 由这些研究结果表明 , 不同科属 、 不同物种间在染色质组成上均存在一定差异 。 对于
染色质的研究有益于对高等植物的生理 、 病理 、 分类等方面的研究 。 我们对四川荣经县大白
杜鹃的染色质组成作了初步分析 , 现报告如下 。
材料和方法
一 、 材料和试剂
i
。 材杆 : 大白杜鹃 ( R h o d o d o d r o o d e e o r o m F r a n e h . ) 取 自四川荣经县泥 巴山 ( 海
拨 2 0 0 0米 ) 。
2
。 试 剂 : 牛血清白蛋 白 ( 电泳纯 , 国产分装 ) , 用微量凯氏定氮法测得其纯度为 81 . 10
%
。
醉母 R N A ( B D H产品 ) , 用定磷法测得其纯度为 74 . 21 % 。
D N A ( 上海东海制药厂产品 ) , 用定磷法测得其纯度为 72 .声9 % 。
其他试剂均为国产分析纯或化学纯 。
二 、 方法
1
。 染 色质的分离 : 采用 R . C . C . H u a n g 及 J . B o n n er 【吕〕 的方法略加改进 。 取大白
杜鹃嫩叶约 8 5 0克 , 洗净 、 剪碎 , 加入 1 7 0 0毫升 0 . 2 5m o l / L 蔗糖一 0 . 0 5 m o l / L T r i s一 H C I
一 0 . 0 1 m ol / L M g C 1 2溶液 ( p H S ) , 高速组织捣碎机捣碎 , 用纱布及尼龙袜过滤 , 滤液
以 4 0。。 x g 离心 30 分钟 , 取沉淀的上层粗制染色质 , 再加入上述溶液匀浆 , 1 0 0 0 0 丫 g 离 心10
分钟 , 再取沉淀上层如法反复进行几次 , 最后用 1 50 毫升 0 . 01 m ol / L T r is 一H C I _ ( p H S )
溶液洗涤 , 得染色质粗品约 40 。毫克 。 于粗制品中加入 20 毫升 0 . 1 m ol / L T r is 一 H C I (P H )S
溶液 , 在玻璃匀浆器中匀浆 , 最后以 2 0 0 0 0 x g 离心 1 小时 , 取沉淀得染色质约 3 0 毫克 。
2
。 染 色质组成成分分析 : 参照 iS ne al ir , G . D . 等 〔“ 〕的方法 。 取上述制备的染色质 0 . 3
克 , 加入预冷的 o . 2 5N H C I一 0 . 9% N a CI 溶液 20 毫升 , 经玻璃匀浆器充分匀浆 , 匀浆液 在
4 ℃下搅拌 1 . 5小时 , 以 1 2 0 0 O x g 离心 10 分钟 , 取出上清液 ( 含组蛋 白 ) , 用0 . 2 5N H C I一
的 广 西 植 物 1 0卷
0
.
9 %N
a
C I溶液补充到 2 5毫升 , 用 F o l i n 酚法 [ ’ “ 3
测上清液中组蛋白的含量 , 以牛血清白蛋白作对照 。
上述去组蛋白的染色质沉淀 , 用冷 10 %三氯乙酸
洗两次后加入 10 毫升 0 . 3 N K O H 溶液 , 匀浆 , 匀浆
液在 37 ℃水浴保温 1 小时 , 冷却使沉淀完全 , 然后用
6 % H C 10
`调 p H I ~ 2 , 在 1 2 0 0 0 x g离心 5 分钟 ,
取出上清液 ( 含R N A ) , 用 0 . s N H C I一 6 % H C IO `
溶液 ( p H I . 5 ) 补充到 25 毫升 , 用地衣酚法 I “ ]测上
清液中 RN A 的含量 , 以酵母 R N A 作对照 。
沉淀加 15 毫升 10 % H C IO `再匀浆 ,匀浆液在 70 ℃
水浴保温 30 分钟后以 1 2 0 0 0 K g 离心10 分钟 , 取出上清
沁篇恕然咖。
质标准曲线
F i g
.
1
图 1 蛋白!
C a l i b r a t i o n e u r v e o f p r o t e i n
如 J
盆拼考
. 万 . .a 帅
娜妇 . 自` ,~ 一一 ~
弧 , 。 备间 ,食喊花弓祖眺 . n龟
液 ( 含 D N A ) ,用 10 % H C IO . 补充到 2 5毫升 , 用二
苯胺法 [ ` 2 〕测定上清液 D N A 的含量 , 以标准 D N A 作
对照 。
沉淀加适量 0 , I N N a O H 液溶解 , 经 1 2 0 0 0 x g离
心 5 分钟 , 取出上清 液 ( 含 非 组蛋 白 ) , 用 O . I N
N a O H液补充到 2 5毫升 , 用 F ol in 酚法测定其量 即为
非组蛋白含量 。
根据D N A 、 组蛋白、 非组蛋白和 R N A的含量 ,
以 D N A 的含量为 l , 计算出大白杜鹃染色质各组分
的比值 。
图 a R N A标准曲线
F i g
.
2 C a l i b r a t i o n e u r v e o f R N A
急
结果和讨论
根据测定的实际含量按照文献 〔 ’ 3 ]的方法分别绘
制牛血清白蛋 白标准曲线 ( 图 1 ) 、 R N A 标 准曲线
( 图 2 ) 和 D N A 标准曲线 ( 图 3 ) 。
按照与制定以上几种标准曲线相同的反应条件 ,
分别测定染色质的组蛋白抽提液 、 非组蛋白抽提液 、
D N A 抽提液和 RN A 抽提液中相应组分的含量 , 结
果见表 1 、 表 2 、 表 3 。
_秘
图 3 D N A标准曲线
F 19
.
3 C a l i b r a t i o n e u r v e o f D N A
1期 张洪渊等 :大白杜鹃染色质组成成分的研究 5 1
表 , 染色质组蛋白和非组蛋白侧定
T a卜. e 1 O e t . rm l n a t i o n o n c o n t e n t s o f c h r o m a t扭n 卜Is t o n e a n d . o n卜. s t o n .
组 蛋 白 非组蛋白
H元s t o n e N o n五i s t o n e
样品体积 (。 l) 0。 2 0。 4 0。 5 0 。 8
S a 皿 P l e 丫 0 1“ m e
吸收值 A SOOn ln 0。 17 2 0。 3 44 0。 19 1 0。 29 6
A b , o r b a n e e
由标准曲线查得样品稀释液中蛋白质 94 。 0 186 。 0 10 5。 0 155 。 8
浓度 (卜g /二 l )
C o n e e n t r a t i o n d e t e r nr i o e d o f
P r o t e i n 三n s a nt P l e d i l u t e s o l u t i o n
o n t五e e a l ib r a t i o n e u r v e
样品蛋白质浓度 (卜 g / nI l) 47 0。 0 4 65 。 0 2 10 。 0 19 4 。 7
C o o e e o t r a t i o n o f s a m P l e P r o t e i n
样品蛋白质浓度均值 (“ g / nt l) 46 7。 5 20 2。 4
A丫 e r a g e v a l u e o f e o n e e n t r a t i o n
o n s a 口 P l e P r o t e i n
表 2 染色质 ONA含 t 浏定
T扭七l e 2 D e t e r m l n a t l o n o n c o n t e n t o f c h r o m ` t i n DN几
D N 人
样品 ( D N A提取液 ) ( m l)
S a 口 P l e ( D N A e盆 t r a e t )
吸收值 人 59 5 n m
A b s o r b a n e e
由标准曲线求得样品稀释液中的浓度
(卜 g / m l )
C o n e e n t r a t i o n d e t e r m i n e d o f
D N A i n : a m P l e d i l让 t e s o l u t i o n o n
t五e e a l ib r a t i o n c u r v e
样品 D N A浓度 (卜 g / 。 1)
C o n e e n t r a t i o o o f s a nt P l e D N A
0
。
0 78 0
。
125 0
。
16 2
4 4
。
3 6 7
。
5 88
.
8
4 43
。
0 4 50
。
0 44 4
。
0
样品 D N人浓度均值 (协g /口 l)
A 甲 e r a g e v a l o e o f e o n e e n t r a t i o n
o n s a m P l e D N A
4 4 5
。
7
广 西 植 物 1 0卷
表 3
T a b l e 3 D e t 禅r m 谊n a t
色质RN A含最测定
o n c o n t e n t o f c h r o m a t ! n RN A
样品 ( R N A提取液 ) ( m l)
S a m P l e ( R N A e x t r a e t )
吸收值 A6 7 O n m
人b s o r b a n e e 一一…一” · 0“ 1 ” · ` 2 2 ! ” · ` , 4
由标准曲线求得样品稀释液中 R N A
浓度 (协 g / m l )
C o n e e n t r a t i o n d e t e r m i n e d o f
1 7
_
8 29
。
3 4 6
.
6
RN A i n s a m p l e d i l u t e s o l u t i o n o n
t五e e a l i b r a t i o n e u r v e
样品 R N A浓度 (卜g / m l)
C o n e e n t r a t i o n o f s a m P l e RN A
5 9
`
3 58
。
7 58
.
3
样品 R N A浓度均值 (卜 g / m l)
A v e r a g e v a l u e o f c o n e e n t r a t i o n
o n s a 口 P l e RN A
5 8
。
8
根据上述结果 , 大白杜鹃染色质各组分的比值为 :
组蛋白 : D N A =
非组蛋 白 : D N A
4 6 7
。
5 _
4 4 5
。
7
_ 2 0 2
。
4
4 4 5
。
7
1
。
05
= 0
。
4 5
R N A : D N A = 0
。
1 3
蛋白质 : D N A = 4 6 7
。
5 + 2 0 2
。
4
4 4 5
。
7
二 1 。 5 0
文献报道高等植物的染色质各组分的比值 , 一般组蛋白 : D N A 约 为 1 , 非 组 蛋 白 :
D N A 在。 . 5~ 2 之间 。 我们所测定四川荣经大 白杜鹃染色质组成大体也在此范围 。
此外 , 我们将提取的大白杜鹃染色质组蛋白 , 用 15 %胶浓度进行聚丙烯酸胺凝胶电泳 ,
用氨基黑 10 B染色 , 明显的显示 6 条区带 , 符合真核细胞组蛋白凝胶电泳的特征 。
在制备植物染色质及其组分分析中 , 正确选材甚为重要 , 虽然同种植物各部位的染色质
组成基本恒定 , 但选材不 当会给实验带来较大误差 。 例如某些植物的根茎难于破碎 , 其染色
质制备中收率较低 。 因此选择叶片较为方便 。 用植物叶制备染色质时 , 常常受叶 绿 素 的 干
扰 , 因此叶绿素要尽量除尽 。 为了避免叶绿素的干扰 , 我们选用大白杜鹃嫩叶 , 效果较好 。
此外 , 在作染色质组成分析时 , 测定 R N A含量中常有 D N A 干扰 , 为此 , 在用定磷法测
定时 , 分别再用二苯胺法及地衣酚法校正 D N A及 R N A含量 , 可得到较为满意的结果 。
1期 张洪渊等 :大白杜鹃染色质组成成分的研究 5 3
参 考 文 献
(1〕 a N d ea u et a l ., 19 74 : A r e h . B i o e五e m . B i o P h y s . , 16 1 : 1 7 1一 177 .
〔 2 〕 F a nt b r o u g五 e t a l . , 1 96 5 : B i o e五e m i s t r y , 7 : 5 75一 5 54 .
〔 3 ) L i n e t a l . , 1 9 74 : B i o e五e m . B i o P五y s . R e s . C o m m a o . , 60 : 吐95一 5 0 6 .
〔 4 〕 F u k a s a w a a n d H a m a d a , 19 7 6 : E x p . C e l l R e s . , 1 0 1: 9 7一 1 0 3 .
〔 5 〕 L a R u e a n d P a l l o l l a , 19 76 : C a n . J . B i o e h e m . , 54 : 7 6 5一 77 1 .
〔 6 〕 G i g o t e t a l二 1 9 7 6 : N u e l e i e A e i d s R e s . , 3 : 2 3 25一 2 3 29 .
〔 7 〕 T u a n a n d B o n n e r , 196 4 : P l a n t P五y s i o l . , 39 : 76 5一 7 72 .
( 8 〕 R . C . C . H u a n g a n d J . B o n n e : . , 1 9 65 : P r o e . N a t . A e a d . S e i . , 54 : 9 60 .
〔 9 〕 5 i n e l a i r , G . D . a n d B r a s e h . K . , 29 78 : E x P . C e l l R e s . , 11 1: 1 .
〔10〕 L o w r y , O . H 二 19 53 : J . B i o l . C五e m . , 1 9 3 : 2 e 5 .
〔1 1〕 S e五j e i d e . 0 . A . , 1 9 69 : A n a l . B i o e 五e m . , 2 7 ( 3 ) : 43 7
〔12 〕 B o r l o n , K . A . , 19 56 : B i o e五e m . , 6 2 : 3 15 .
( 13 〕 北京大学生物系遗传学教研室 , 1 9 83 : 遗传学实验方法和技术 。 P . 64 一 71 . 高等教育出版社。
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,
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( D e p a r t m e n t o f B i o l o g y
,
S i e五u a o U n i v e r s i t y , C五e n g d u )
Ab s t r a e t A n i m P r o v e d H u a n g m e t h o d a n d S i n d a i r m e t h o d w e r e
P r e P a r i n g e h
r o m a t i n f
r o m R h o d o d e o d r o o d e e o r 。。 F r a n e h . o f Y u n 3i n g ,
T il
e i r e o m P o n e n t w e r e a n a l y s
e d
.
T h e r e s u l t
s a r e P r o t e i n s : D N A = 1
。
t o n e : D N A = 1
.
0 5 ; n o n h i s t o n e : D N A = 0
.
4 5 ; R N A : D N A = 0
.
1 3
-
Ke y w o r d s R 人o d o d e n d r o n ; e h r o m a t i n ; h i s t o n e
u s e d f o r
S i e 五u a n .
5 0 ; h i s
-