全 文 ：　植物研究　2009, 29(2):234 ～ 241　BuletinofBotanicalResearch
基金项目:国家自然科学基金资助项目(39860048);贵州省自然科学基金资助项目(黔科合丁字 [ 2005] 2033号)
第一作者简介:郑道君(1979— ),男 ,硕士 ,主要从事苦丁茶种质资源研究。
＊　通讯作者:E-mail:kudingcha no1@yahoo.com.cn
收稿日期:2008-05-08
中国木犀科苦丁茶 ISSR实验条件优化的研究
郑道君1, 2　刘国民 1, 2＊ 　梁远发 3　鄢东海 3　令狐昌弟3 　田永辉3
(1.海南大学热带生物资源教育部重点实验室 ,海口　570228)
(2.海南大学苦丁茶研究所 ,海口　570228)
(3.贵州省茶叶科学研究所 ,湄潭　564100)
摘　要　系统地研究了中国木犀科苦丁茶 ISSR反应体系中的主要影响因子 ,建立了一套稳定的 ISSR-PCR反应
参数。筛选出了 10个有效引物 , 并以中国木犀科苦丁茶 8个物种共 21份种质材料为供试材料对优化后的反应条
件的重复性 、多态性进行了检测。优化后的反应体系为:10×buffer2.5μL, 2.0 ～ 3.0mmol· L-1 MgCl2 , 150 ～ 300
μmol· L-1 dNTPs, Taq酶 1.0 ～ 1.5U,引物 0.4 ～ 0.5μmol· L-1 , DNA模板 5 ～ 320ng。 PCR扩增程序为:94℃预
变性 4min, 然后按 94℃变性 40s, 50 ～ 54℃退火 45s, 72℃延伸 120s,进行 35个循环 ,最后 72℃延伸 8min。 该反
应条件可应用于中国木犀科苦丁茶亲缘关系和遗传多样性分析。
关键词　木犀科;苦丁茶;ISSR;影响因子;体系优化
中图分类号:Q943　文献标志码:A　文章编号:1673-5102(2009)02-0234-08
StudiesonOptimizationofISSRAmplifiedConditionsin
KudingchaSpeciesinOleaceaeofChina
ZHENGDao-Jun1, 2　LIUGuo-Min1, 2＊　LIANGYuan-Fa3　YANDong-Hai3
LINGHUChang-Di3　TIANGYong-Hui3
(1.KeyLaboratoryofTropicalBiologicalResearches.MOE, HainanUniversity, Haikou　570228)
(2.KudingchaResearchInstituteofHainanUniversity, Haikou　570228)
(3.TheTeaResearchInstituteofGuizhouProvince, Meitan　564100)
Abstract　TheinfluentialfactorsofISSRforKudingchaspeciesinOleaceaeofChinaweresystematicalystud-
ied, asetofstableISSR-PCRreactionparameterswasestablished.10 efectiveISSRprimerswereselectedout,
andwiththem21 testgermplasmmaterialsfrom8 KudingchaspeciesinOleaceaeofChinawereexaminedforthe
repeatabilityandpolymorphismoftheoptimizedreactionconditions.TheoptimumISSR-PCRreactionsystemwas
that2.5μL10 ×PCRbufer, 2.0 ～ 3.0mmol·L-1 MgCl2 , 150 ～ 300μmol· L-1 dNTPs, 1.0 ～ 1.5 Taqpoly-
merase, 0.4 ～ 0.5 μmol· L-1 primers, and5 ～ 320 ngDNAtemplatewerecontainedin25 μLreactionsolu-
tion.Theoptimizedamplificationprogramwasthatpre-denaturingat94℃ for4min, thendenaturingat94℃ for
40 s, primerannealingat50℃ ～ 54℃ for45 s, extensionat72℃ for120 s, for35 cycles, atlastextensionat
72℃ for8 min.Theproductionswerestoredat4℃.TheoptimizedISSR-PCRreactionsystemwassuitablefor
thestudyofgeneticdiversityandrelationshipofKudingchagermplasmresourcesinOleaceaeofChina.
Keywords　Kudingchaspecies;Oleaceae;ISSR;influentialfactors;Optimizationofsystem
　　“苦丁茶 ”是我国民间一大类代茶保健饮料的
统称 ,其原植物至少涉及到 12科 13属 ,共 30余物
种(包括变种和变型)[ 1] 。其中以粗壮女贞(Ligus-
trumrobustum(Roxb.)Blume)为代表的木犀科苦丁
茶在我国西南地区最为流行。
木犀科苦丁茶种类繁多(据目前已有的报道
多达标 11种),其异物同名和同物异名的现象非
常普遍 。由于各地所推崇的木犀科苦丁茶的种类
不尽相同 ,这种异物同名和同物异名现象往往给种
子 、种苗以及代茶产品的流通造成诸多不便 ,同时
也给文献引用 、原植物认定 ,种植规划的制订以及
新产品研发带来不少麻烦 ,有时甚至导致一些法律
纠纷。此外 ,木犀科苦丁茶个别种类的分类学地位
问题在学界亦存在某些不同意见。为了很好地解
决上述问题 ,我们拟采用 ISSR标记技术从 DNA分
子水平上进行探讨。
ISSR(Inter-simplesequencerepeat,简单序列重
复区间)是 Zietkiewicz等[ 2] 1994年创建的一种基
于 SSR的简单重复序列区间扩增多态性分子标
记 。由于 ISSR技术所需 DNA用量少 ,检测方便安
全 、费用低廉 ,具有很好的稳定性和多态性 [ 3] ,近
年来已在亲缘关系[ 4, 5] 、遗传多样性[ 6 ～ 8]等研究领
域得到广泛应用。尽管 ISSR有诸多优点 ,但由于
它也是一种基于 PCR的分子标记 ,所以反应体系
和程序不同也会产生不同的结果。为了能实现 IS-
SR分析结果的可靠性和重复性 ,进行 ISSR-PCR反
应体系的优化是非常必要的。为此 ,我们以粗壮女
贞为实验材料对其 ISSR分析中的模板浓度 、
dNTPS浓度 、Mg2+浓度 、Taq酶用量 、引物浓度以及
反应循环次数和退火温度等影响因素进行了比较
系统的研究 ,建立了一套稳定的反应参数 。在此基
础上我们筛选出了一批有效引物 ,并用 8种木犀科
苦丁茶共 21份供试种质材料对优化后的反应体系
的重复性 、多态性进行了检测。
1　材料与方法
1.1　材料
从海南大学苦丁茶种质资源圃中所定植的木
犀科苦丁茶 8个物种共 21份种质材料的植株上取
功能叶或嫩芽作为本研究的供试材料 ,各份种质材
料的种名 、编号和采集地如表 1所示 。
1.2　试剂与仪器
1.2.1　试剂
CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、Tris(三氯氨
基甲烷)、EDTA(乙二胺四乙酸)均购自广州威佳
科技有限公司 , ISSR引物的选购参考邱英雄 [ 9] , V.
J.V.Gemas等[ 10]人所用的引物 。 LambdaDNA/
HindⅢ +EcoRⅠ Markers, 3 S100 bpDNAladder,
TaqDNApolymerase和 4XdNTPmix购自上海申能
博彩生物科技有限公司等 。
表 1　供试材料及来源
Table1　Thetestmaterialsandtheirorigins
序号
No.
材料编号
Codes
采集地
Origins
1 CD-01 川滇小蜡LigustrumdelavayanmHariot.
贵州务川
WuChuan, GuiZhou
2 CD-02 川滇小蜡L.delavayanmHariot.
贵州务川
WuChuan, GuiZhou
3 CD-03 川滇小蜡L.delavayanmHariot.
贵州务川
WuChuan, GuiZhou
4 RM
日本毛女贞
L.japonicumThunb.var.
pubscensKoidz
贵州务川WuChuan, GuiZhou
5 NS
牛矢果
Osmanthusmasumuranus
Hayata
海南尖峰岭
JinFengMountain, HaiNan
6 RB 日本女贞L.japonicumThunb.
湖南衡阳
HongYang, HuNan
7 LY 丽叶女贞L.henryiHemsl.
云南丽江
LiJiang, YunNan
8 XG 序梗女贞L.pedunculareRehd
贵州荔波
LiBo, GuiZhou
9 CZ-047 粗壮女贞L.robustum(Roxb.)Blume
贵州余庆
YuXing, GuiZhou
10 CZ-058 粗壮女贞L.robustum(Roxb.)Blume
贵州台江
TaiJiang, GuiZhou
11 CZ-068
粗壮女贞(或紫茎女贞)
L.robustum(Roxb.)Blume
(=L.pururascensY.C.Yang)
四川屏山
PingShan, SiChuan
12 CZ-069 粗壮女贞L.robustum(Roxb.)Blume
四川叙永
XuYong, SiChuan
13 CZ-070 粗壮女贞L.robustum(Roxb.)Blume
云南会泽
HuiZhe, YunNan
14 CZ-072 粗壮女贞L.robustum(Roxb.)Blume
云南盐津
YinJin, YunNan
15 NZ-13 女贞L.lucidumAit.
湖南祁东
QiDong, HuNan
16 NZ-35 女贞L.lucidumAit.
云南西畴
XiChou, YunNan
17 NZ-36 女贞L.lucidumAit. 江西南昌NanChang, JiangXi
18 NZ-11 女贞L.lucidumAit.
贵州植物园
ArboretumofGuiZhou
19 NZ-22 女贞L.lucidumAit.
贵州湄潭
MeiTan, GuiZhou
20 NZ-27 女贞L.lucidumAit.
贵州扎佑
ZhaZuo, GuiZhou
21 NZ-23 女贞L.lucidumAit.
贵州台江
TaiJiang, GuiZhou
2352期 郑道君等:中国木犀科苦丁茶 ISSR实验条件优化的研究
1.2.2　仪器
离心机 ,电热恒温水浴锅 ,电冰箱 ,移液枪 ,紫
外分光光度计 , icyclerTMThermalCycle型 PCR仪 ,
水平电泳仪 , GelDocXR型凝胶成像系统等 。
1.3　方法
1.3.1　总 DNA的提取
采用改良后的 CTAB法(详见另文报道)。
1.3.2　ISSR扩增反应
反应在 icyclerTMThermalCycler型 PCR仪上
进行。 ISSR基本反应体系组成为:10 ×反应 bufer
2.5 μL, 2.0 mmol· L-1 MgCl2 , 200 μmol· L-1
dNTPs, Taq酶 2.0U,引物 0.4 μmol· L-1 , DNA模
板 40 ng,最后用无菌超纯水补足至 25μL。反应体
系的优化按单因子梯度设置进行。在保持其他因
子一致不变的条件下 ,变化单一因子 ,筛选最优浓
度 。
ISSR-PCR基本扩增程序为:94℃预变性 4
min,然后按 94℃变性 40 s, 52℃退火 45 s, 72℃延
伸 120s,进行 40个循环 ,最后 72℃延伸 8 min。退
火温度设置 7个梯度 ,循环数各设置 8个梯度 ,其余
条件则同基本程序 ,在优化后的反应体系下进行。
1.3.3　扩增产物的检测
取扩增产物 10和 2 μL上样缓冲液(含 40%
蔗糖 、0.25%溴酚蓝)混匀 ,点样于 1.4%琼脂糖凝
胶(含 0.5μg·mL-1 EB)的上样孔中 ,以 3S100bp
DNAladder作为对照分子量标准 ,在 0.5 ×TBE缓
冲液中电压 5 V/cm电泳 1.5 ～ 2.0 h,然后在 Gel
DocXR型凝胶成像分析系统下照相并记录 ,检验
优化结果。
1.3.4　预备实验
不同的物种有其相应的不同引物 ,不同的引物
有不同的退火温度 ,同一引物对不同的物种也有不
尽相同的退火温度。因此 ,在对某一种物种进行实
验条件优化前 ,有必要进行优化前的预备实验 ,找
出效果相对较好的引物及其退火温度用于实验条
件优化 ,以求得到效果较好 ,易于分析的实验条件
优化结果。本研究中选择常用的 3条 ISSR引物
UBC-811、UBC-819和 UBC-841,设置 50℃, 52℃和
54℃ 3个退火温度梯度 ,按上述 ISSR基本反应条
件进行预备实验 。
1.4　各反应因子含量的梯度组合及反应程序各条
件的设置
1.4.1　模板的用量
ISSR反应中对模板 DNA浓度要求的范围通
常较宽 ,但不同的物种及不同的 DNA提取方法所
要求最佳的 DNA模板浓度范围也不尽相同 [ 11 ～ 13] 。
因此有必要通过试验来确定合适的模板浓度 。本
实验在 5.0 ～ 320.0 ng之间设置 8个模板 DNA用
量梯度 , 即 5.0, 10.0, 20.0, 40.0, 80.0, 160.0,
240.0和 320.0ng/25μL,以确定适宜的模板 DNA
浓度范围。
1.4.2　Taq酶的用量
Taq酶的用量是影响 ISSR扩增结果的重要因
子。其用量受模板的质量 、反应体积 、酶活性 、酶的
耐热性等多种因素的制约 。若酶用量过少 ,可能扩
增不出条带;相反 ,酶用量过大 ,会造成不必要的浪
费 ,还可能出现非特异性条带和弥散现象 。大量的
ISSR试验结果表明 ,一般在 25 μL的 ISSR反应体
系中 Taq酶的用量为 1.0 ～ 2.5U[ 14] 。在此基础上
本文设计了 0.5, 1.0 , 1.5 , 2.0, 2.5和 3.0 U等 6
个 Taq酶的用量梯度 。
1.4.3　Mg2+用量
镁离子浓度是影响扩增特异性主要的因子之
一。 Mg2+不仅影响 Taq酶活性 ,还能与反应液中
的 dNTP、引物及模板相结合 ,影响引物与模板的结
合效率 、产物特异性及引物二聚体的形成 [ 15] 。此
外 ,不同的物种具有不同的特性 ,对反应体系中的
Mg2+浓度要求各不相同 ,不同的引物对 Mg2+浓度
要求也各不相同 。因此 ,确定扩增反应的最佳镁离
子的浓度非常重要 。用于 ISSR反应 Mg2+的浓度
一般选择 1.5 ～ 3.0mmol·L-1[ 16] 。本实验设置了
8个 Mg2+浓度梯度以确定合适的 Mg2+浓度 ,即
1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0和 4.5 mmol·L-1。
1.4.4　dNTPs的用量
dNTPs是反应中磷酸根的主要来源 ,其浓度取
决于扩增片段的长度 ,另外其浓度的任何变化都会
影响到 Mg2+的有效浓度 。在 ISSR中 dNTPs的常
用浓度 100 ～ 200 μmol· L-1[ 17] 。本实验在 50 ～
600 μmol· L-1之间设置 8个 dNTP浓度梯度 ,即
50, 100 , 150, 200, 300 , 400, 500和 600 μmol· L-1。
1.4.5　引物浓度
引物浓度会对 ISSR-PCR扩增的带型产生明
显的影响 ,浓度过低没有条带或条带较弱 ,浓度太
高又会产生非特异性条带[ 18] 。引物浓度一般为
0.1 ～ 0.5μmol·L-1[ 19] 。为减少非特异性扩增 ,加
强重复性 ,本实验设置了 0.05, 0.1 , 0.2, 0.3, 0.4
和 0.5 μmol· L-1 6个引物浓度以确定最适宜浓
度。
236 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　　29卷
1.4.6　循环次数
ISSR-PCR的循环次数决定产量 。循环次数太
少 ,产物量极低 ,甚至没有扩增产物;循环次数太
多 ,在进入反应平台期以后 ,增加循环次数不仅不
会使产物明显增加 ,反而导致非特异性扩增。目前
大多数研究者使用 30 ～ 45个循环[ 11] 。本实验在
在优化后的反应体系下进行 ,进行了循环次数分别
为 20 , 25, 30, 35, 40, 45, 50和 55次的一系列 ISSR-
PCR扩增实验以便确定最佳的循环次数。
1.4.7　退火温度
退火温度明显影响扩增谱带式样[ 20] ,它不仅
与引物序列有关 ,还与物种的序列有密切关系 [ 21] 。
因此对于每个物种在进行多样性分析前必须对不
同引物的退火温度进行筛选。本研究采用上述优
化后的反应体系为实验条件 ,对所购买的引物同时
进行退火温度优化和有效引物筛选 。作者根据所
购引物的理论退火温度 ,并参已发表文献设计 3个
梯度的退火温度 ,即 50, 52和 54℃,对所购引物进
行退火度温初选 ,选出条带丰富 、清晰且稳定的引
物并确定其退火温度;对于剩下的引物我们再次设
计了 48, 56, 58和 60℃ 4种退火温度进行筛选 ,弃
去经过再次筛选仍是扩增效果不好的引物。最后
对经过退火温度初选和再选的引物进行有效引物
筛选 ,以形态和地域差异较大的 3份粗壮女贞种质
材料的 DNA为模板 ,筛选能扩增出清晰的 、可重复
性的且多态性较好的引物 。
2　结果与分析
2.1　预备实验
预备实验结果见图 1,引物 UBC-819以三种退
火温度为条件所得的条带均少 ,且有拖尾现象(图
1中 2, 5, 8泳道);引物 UBC-811和 UBC-841在
50 , 52和 54℃时均能扩增出丰富且清晰的条带 ,但
相比之下 ,这两条引物在 54℃时扩增的条带数较
50和 52℃时少 ,而 50和 52℃时所得条带均一致。
为提高扩增的特异性 ,最后选定引物 UBC-811和
UBC-841用于后续的优化实验 ,其相应的退火温度
均为 52℃。
2.2　模板 DNA用量的适宜范围
本实验结果表明 ,模板浓度在 5 ～ 320 ng范围
内 ,所扩增出的带型基本一致 ,条带稳定 、丰富 、清
晰 ,但扩增强度随着 DNA浓度的增加有所增强
(图 2)。可见 ,在本实验所设计的浓度范围内 ,模
板用量对 ISSR-PCR扩增没有明显影响 。这与刘
威生等在杏(Armeniacaspp.)中 [ 13] ,以及刘立军等
在苎麻(BoehmeriamivesL.Guad)中的 [ 11]研究结果
相似 。
图 1　预备实验结果图　泳道 1, 4和 7为引物 UBC-811, 退
火温度分别为 50, 52和 54℃;泳道 2, 5和 8为引物 UBC-819,
退火温度分别为 50, 52和 54℃;泳道 3, 6和 9为引物 UBC-
841, 退火温度分别为 50, 52和 54℃
Fig.1　Resultofexperiment:Lands1, 4and7 wereUBC-811, an-
nealingtemperatureswere50℃, 52℃ and54℃, respectively;Lands
2, 5 and8 wereUBC-819, annealingtemperatureswere50℃, 52℃
and54℃, respectively;Lands3.6 and9 wereUBC-841, annealing
temperatureswere50℃, 52℃ and54℃, respectively
图 2　模板浓度试验　M为 3S100 bpDNAladder;1 ～ 8号泳
道的浓度分别为 5, 10, 20, 40, 80, 160, 240和 320ng
Fig.2　Testingoftemplateconcentration　 LaneMwasmark-
er, Lanes1 to8 were5, 10, 20, 40, 80, 160, 240and320 ng, re-
spectively
2.3　Taq酶的用量对 PCR的影响
对所设置的 6个 Taq酶用量梯度的实验结果
表明:随着 Taq酶用量的增加 , ISSR条带的亮度明
显增强 ,条带的数量也随之有所增多 。当 Taq酶用
量在 0.5U时 ,扩增条带少 ,不清晰且不稳定(图 3
中 1泳道),不利于分析;当用量为 1.0 ～ 1.5 U时 ,
2372期 郑道君等:中国木犀科苦丁茶 ISSR实验条件优化的研究
带型一致 ,条数丰富且清晰(图 3中 2, 3泳道);当
Taq酶用量达到 2.0 U及其以上用量时 ,产生非特
异性产物 ,大片段扩增量增加而使背景加深呈现弥
散状(图 3中 4 ～ 6泳道)。从以上结果可见 ,本实
验 ISSR扩增的适宜 Taq酶用量为 1.0 ～ 1.5 U。
图 3　Taq酶浓度试验　M为 3S100 bpDNAladder;1 ～ 6
号泳道的浓度分别为 0.5, 1.0, 15, 2.0, 2.5和 3.0U
Fig.3　TestingofTaqconcentration　LaneMwasmark-
er, Lanes1 to6 werewere0.5, 1.0, 15, 2.0, 2.5 and3.0
U, respectively
2.4　Mg2 +浓度对 PCR结果的影响
对 Mg2+浓度梯度实验结果表明(图 4):Mg2+
浓度的变化对 ISSR条带的数量和强弱影响较大。
当 Mg2+为 1.0 mmol· L-1时 ,不能扩增出条带(图 4
中 1泳道)。这说明 1.0 mmol· L-1浓度的 Mg2+不
能有效地激活 Taq酶活性 。这可能是由于模板 、引
物 、dNTPs竞争与 Mg2+结合 ,导致激活 Taq酶所需
的自由 Mg2+不足 ,造成酶活力显著降低 ,扩增反应
失败 。随着 Mg2+浓度的提高 ,扩增条带数及条带的
亮度相应增加。当浓度为 1.5 mmol·L-1时 ,有扩
增产物 ,但条带少且不稳定(图 4中 2泳道),这说
明 Mg2+浓度仍较低 。当 Mg2+浓度达到 2.0 ～ 3.0
mmol·L-1时 ,扩增条型一致 ,条带丰富且清晰(图 4
中 3 ～ 5泳道)。当 Mg2+浓度提高到 3.5mmol·L-1
或大于 3.5 mmol· L-1时 ,大片段带的扩增强度及
扩增数量均明显增加 ,导致胶的背景加深并呈现有
弥散现象(图 4中 6 ～ 8泳道)。由此可见 ,在本实
验中 ,高于 3.0 mmol·L-1的 Mg2+浓度会使反应出
现非特异性扩增 。综上所述 ,用于本实验 ISSR分析
的适宜 Mg2+浓度为 2.0 ～ 3.0mmol·L-1。
2.5　dNTPs浓度对 PCR结果的影响
对设置的 8个 dNTPs浓度的扩增结果进行比
较即可发现(图 5),在浓度为 50 ～ 500 μmol· L-1
之间均能扩增出条带 ,但当浓度为 100 μmol· L-1
及其以下浓度时条带不甚清晰 ,且大片段条带缺失
(图 5中 1 , 2泳道)。这说明在此浓度范围下
dNTPs浓度偏低 ,扩增量不足。当浓度在 150 ～ 300
μmol· L-1时 ,扩增出的带型一致 ,条带多而清晰
(图 5中 3 ～ 6泳道);而当浓度达到 400以上时 ,虽
然也能得到较清晰的条带 ,但较大的扩增带表现出
不能进行有效的扩增 ,甚至缺失的趋势 。这说明 ,
高浓度的 dNTPs会抑制分子质量相对较大的条带
扩增 —这与杨志玲等 [ 22]在红花石蒜(Lycorisradia-
taHerb.)中的研究结果相似。作者认为这可能是
由于 dNTPs浓度过高 ,降低了 Mg2+的有效浓度从而
抑制聚合酶的活性所致。从以上结果可见 ,本实验中
dNTPs浓度的适宜范围较广 ,为 150 ～ 300μmol·L-1。
2.6　引物浓度对 PCR结果的影响
实验结果表明 ,在本实验所设计的浓度范围内
均能扩增出条带 ,但在 0.05μmol· L-1时仅能扩增
出一条大片段带(图 6中 1泳道)。之后 ,随着引
物浓度的增加 ,大片段条带基本保持不变 ,而小片
断的数目随之而增加 ,这与佟汉文等人 [ 23]在乌拉
尔甘草 (GlycyrrhizauralemsisFisch.)以及刘威生
等人 [ 13]在杏中的研究结果是一致的。当浓度达
0.4 ～ 0.5 μmol·L-1时 ,扩增条带达到最多 ,且稳
定清晰 ,并没有出现弥散现象(图 6中 5, 6泳道)。
因此确定 0.4 ～ 0.5 μmol· L-1为本实验中 ISSR-
PCR实验体系中引物的适宜浓度范围 。
图 4　Mg2 +浓度试验　M为 3 S100 bpDNAladder;1
～ 8号泳道的浓度分别为 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5,
4.0和 4.5 mmol·L-1
Fig.4　 TestingofMg2 + concentration　LaneM was
marker, Lanes1 to8 were1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5,
4.0 and4.5 mmol· L-1 , respectively
238 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　　29卷
图 5　dNTPs浓度试验　M为 3 S100 bpDNAlad-
der;1 ～ 8号泳道的浓度分别为 50, 100, 150, 200,
250, 300, 400和 500 μmol· L-1
Fig.5　TestingofdNTPsconcentration　dNTPscon-
centrationswere50, 100, 150, 200, 250, 300, 400 and500
μmol·L-1 , respectively
图 6　引物浓度试验:M为 3 S100 bpDNA
ladder;1 ～ 8号泳道的浓度分别为 0.05, 0.1,
0.2, 0.3, 0.4和 0.5μmol· L-1
Fig.6　Testingofprimerconcentration:primer
concentrationswere0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4
and0.5μmol· L-1 , respectively
2.7　反应循环次数对 PCR结果的影响
不同循环数扩增实验结果表明 ,当循环次数为
20和 25时不能检测到扩增产物(图 7中 1, 2泳
道);而在 30时扩增产物量仍很少 ,有些带没有检
测到(图 7中 3泳道);当循环次数达到≥35时 ,扩
增结果一致 ,均能得到清晰稳定且丰富的条带(图
7中 4 ～ 8泳道)。但是在可检测到扩增片段的条
件下 ,循环次数越少越好;因过多的循环次数可导
致一些非特异性产物的干扰 ,而且发生错误的比例
图 7　循环次数试验　M为 3 S100bpDNAladder:1～
8号循环次数分别为 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50和 55
Fig.7　Testingofcycles　cycleswere20, 25, 30, 35,
40, 45, 50 and55, respectively
也上升[ 11] 。基于这一原因 ,同时也考虑到实验过
程中省时的问题 ,故本研究中选定 35个循环为 IS-
SR-PCR实验体系的反应循环次数。
2.8　不同引物退火温度的确定及引物筛选
实验结果表明 ,在所购的引物中大部分在 50,
52和 54℃梯度下均能够扩增出丰富 、清晰且稳定
的条带;初选剩下的引物经 48, 56, 58和 60℃梯度
再筛选 ,基本上均不能扩增出效果好的带型。 ISSR
分析中在确定退火温度时 ,在扩增结果相近条件
下 ,宜选择较高退火温度 ,以提高反应的特异性 。
本实验中关于退火温度及引物筛选的试验结果详
见表 2和图 8。
表 2　所筛选出的引物及其相应的退火温度
Table2　TheselectedISSRprimersalongwiththeirsequence
andannealingtemperature
引物编号
Primers
序列
Sequence(5′to3′)
退火温度
Annealingtemperature
ISSR-03 GACAGACAGACAGACA 52℃
UBC-811 GAGAGAGAGAGAGAGAC 52℃
UBC-814 CTCTCTCTCTCTCTCTA 54℃
UBC-815 CTCTCTCTCTCTCTCTG 50℃
UBC-823 TCTCTCTCTCTCTCTCC 54℃
UBC-825 ACACACACACACACACT 54℃
UBC-841 GAGAGAGAGAGAGAGAYC 52℃
UBC-842 GAGAGAGAGAGAGAGAYG 54℃
UBC-844 CTCTCTCTCTCTCTCTRC 54℃
UBC-845 CTCTCTCTCTCTCTCTRG 54℃
2392期 郑道君等:中国木犀科苦丁茶 ISSR实验条件优化的研究
3　木犀科苦丁茶 ISSR反应体系的确立
从以上分析可看出以粗壮女贞为代表的中国
木犀科苦丁茶的 ISSR分析较适宜的扩增条件如
下:反应体系组成为:10×反应 bufer2.5μL, 2.0 ～
3.0 mmol·L-1 MgCl2 , 150 ～ 300 μmol· L-1 dNTPs,
Taq酶 1.0 ～ 1.5U,引物 0.4 ～ 0.5μmol·L-1 , DNA
模板 5 ～ 320 ng,最后用无菌超纯水补足至 25 μL。
PCR扩增程序为:94℃预变性 4 min,然后按 94℃
变性 40 s, 50 ～ 54℃退火 45s, 72℃延伸 120 s,进行
35个循环 ,最后 72℃延伸 8 min。
图 8　退火温度筛选图　泳道 1～ 3引物 ISSR-01;泳道 4 ～ 6引物为 ISSR-02, 泳道 7～ 9引物为ISSR-03;泳道 10～
12引物为 811;泳道 13～ 15引物为 814;泳道 16～ 18引物为 815;泳道 19 ～ 21引物为 819;22～ 24引物为 823.各引物
的退火温度均分别为 50, 52和 54℃
Fig.8　Efectofannealingtemperature　Lanes1 to3 wereISSR-01;Lanes4to6wereISSR-02;Lanes7to9wereISSR-
03;Lanes10 to12 wereUBC-811;Lanes13 to15 wereUBC-814;Lanes16to18 wereUBC-815;Lanes19 to21 wereUBC-
819;Lanes22 to24 wereUBC-823, annealingtemperatureforeachprimerwere50℃, 52℃ and54℃, respectively
图 9　引物为 ISSR-03的 ISSR扩增结果　M为 Markers(3S100 bpDNAladder);序号同表 1
Fig.9　ResultofPCRamplificationusingprimerISSR-03　Mwasmarkers(3S100bpDNAladder);TheNo.werethesame
asthatshowedintable1
4　ISSR-PCR优化体系的应用
应用以上所述的 DNA提取方法提取中国木犀
科苦丁茶八个物种共 21份种质材料的总 DNA(表
1)。从前面所筛选出的 10个引物中随机挑选编
号为 UB-841的引物对中国木犀科苦丁茶八个物
种共 21份种质材料进行扩增应用 , 以检测优化确
立的中国木犀科苦丁茶 ISSR-PCR反应体系的效
果 。结果如图 9,所选引物能在中国木犀科苦丁茶
8个物种共 21份种质材料上扩增出清晰 、重复性
好 、多态性丰富的条带。这表明优化确立的 ISSR-
PCR反应体系稳定可靠 ,多态性高 ,可应用于中国
木犀科苦丁茶遗传多样性分析等研究。
5　讨论
ISSR分析由于其引物较长(15 ～ 24个碱基序
列)和锚定碱基的耙定作用 ,退火温度较高 (在
52℃左右),保证了扩增实验的可重复性和具有较
高的专一性。但它也是基于 PCR的一种标记 ,所
以反应体系和程序不同也会产生不同的结果 。为
240 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　　29卷
了能确保 ISSR分析结果的可靠性和可重复性 ,有
必要对 ISSR-PCR反应体系进行优化。在对各影
响因子进行优化后发现 ,模板的用量范围较大 ,在
所设置的浓度中均能得到一致的结果 。一般来说 ,
模板含量对 ISSR-PCR反应影响并不大 ,扩增效果
主要取决于模板的纯度 [ 16] 。引物浓度会对 PCR
扩增的带型产生明显的影响 ,作者在对木犀科苦丁
茶 ISSR反应体系的优化试验中 ,观察到 ,引物浓度
不同时 ,扩增片段大小有比较明显的差异;引物浓
度越高 ,扩增出的小片段越多。佟汉文等人认为这
可能是引物浓度高时 ,引物与模板 DNA结合位点
多而导致片段变短[ 23] 。因此 ,具体的原因尚待进
一步用实验证实 。
参　考　文　献
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