全 文 ：广 西 植 物 G u i h a i a 7〔 2 ): J 4 3一 14 5。 卫 9 5 7
利用同工酶酶谱法鉴别侧耳属的种和菌株
汤卫真 郑国扬 毕志树
(广东省微生物研究所 , 广州 )
摘要 本文初步报道醋酶同工酶酶谱对侧耳属各菌株的鉴定与按子实体的形态结构鉴别的结果基 本 一
致 ; 并与菌株间的拮抗反应存在一定的关系 。 探讨了侧耳属的种或菌株的鉴别方法 。
关键词 同工酶 ; 酶谱法 ; 侧耳属 ; 醋酶
1 92 7年 B a ve n d a m m 首次应用酶法于真菌分类上 。 他的方法是将酚加进培养基中使真菌
的多酚氧化酶显色而得以鉴定 。 随后有不少学者以酶法进行分类研究 。 近十多年来 , 利用电泳
方法分离同工酶和可溶性蛋白质鉴别半知菌 、 子囊菌及担子菌的某些菌株报道较多 I 。 ’ 。 ” ’ l 。
酶法在真菌上的分类价值已为很多研究者所肯定 〔。 ’ 皿卫 1 。 这种方法可弥补形态学 分类上的不
足之处 。 然而 , 由于酶法分类涉及遗传基因及生物化学问题 , 存在种 属 特 异 性 , 因此 , 对
各类真菌的种和菌株的酶谱都须分别进行探讨 。
本文应用聚丙烯酞胺凝胶 电泳法测定侧耳属的 18 个菌株菌丝体提取液的醋酶 、 酸性磷酸
酶及过氧化物酶同工酶酶谱 , 以探索酶法在侧耳属菌株鉴别上的可能性 。 并将试验结果与形
态鉴定和拮抗试验进行比较 , 提出该属的初步鉴别方法 。
一 、 材 料 和 方 法
( 一 ) 供试菌株由本所野生真菌驯化组提供 ( 见表 1 ) , 各菌株以废棉为主要原料分别
制成菌砖 。 在 20 一2 ℃ 、 大气湿度 85 一 95 % 、 培养料含水量为 70 一一75 %的条件下 , 经 15 一
20 天培养长出子实体 , 待菌盖充分展开后进行宏观和微观观察 , 并参照邓叔群 ( 1 9 6 3 ) 〔’ ] 、 应
建浙等 ( 1 9 5 2 ) 〔“ 1 、 C o r n e r ( 1 9 8 1 ) 1 4 1 、 M i l l e r ( 1 9 6 9 ) 汇7 ] 、 P e g l e r ( 1 9 7 7 ) [ 。 ] 以及 S i n g e r
( 1 9 7 5 ) [
` ” ]等进行鉴定 。
( 二 ) 菌丝的培养和 电泳样品的制备 : 将保存在 P . D . A . 试管斜面的菌丝分别接入盛有
加毫升培养液的 1 50 毫升三角瓶中 。 培养液配方 : ①马铃薯 2 0 克 , 葡萄糖 20 克 , 磷酸二氢钾
3 克 , 硫酸镁 1 . 5克 , 维生素 B : 10 毫克 , 水 1 0 0 0毫升 。 ②硝酸钠 10 克 , 葡萄糖 、 磷 酸 二 氢
钾 、 硫酸镁 、 维生素及水的用量同①配方 。 ③硫酸馁 10 克 , 葡萄糖 、 磷酸二氢钾 、 硫酸镁 、
维生素及水的用量同①配方 。 ④酵母浸膏 5 克 , 葡萄糖 、 磷酸二氢钾 、 硫酸镁 、 维生素及水
的用量同①配方 。 菌丝体于 24 一 25 oCJ 值温静置培养 6 天 。 菌龄试验分 4 、 6 、 8 天三个处理 。
长好的菌丝分别收集在三角瓶内 , 用蒸馏水冲洗二次 。 捞起菌丝体离心除去水分 。 称重 , 按
1 : 3 ( 克 /毫升 ) 的比例加 T r i s 一 柠檬酸缓冲液 , 在零度以下预冷后磨成匀浆 , 立刻过滤 ,
滤液以 1 2 0 0 O r . p . m /分的速度冷冻离心 , 取上清液保存于冰箱作为 电泳样品 。
本文承蒙陆大京教授审阅 , 龚静波 、 李 崇同志照相 , 李泰辉 、 郑婉玲同志参加部分工作 . 一并致谢 。
14 4 广 西 植 物 , 了卷
表 1 供 试 侧 耳 属 18 个 菌 株
学 名 ! 中 文 名
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e i t r i n o p i l e a t u s
糙皮侧耳
扁柄侧耳
糙皮侧耳
糙皮侧耳
漏斗状侧耳
鲍 鱼 菇
蚝 菇
具形侧耳
真线侧耳
漏斗状侧耳
肺形侧耳
肺形侧耳
短抱真线侧耳
粉红褶侧耳
肺形侧耳
榆 黄 蘑
榆 黄 蘑
榆 黄 蘑
福建三明真菌所
广州腐木上分离
湖北华中农学院
云 南 植 物 所
香 港 中 文 大学
北 京 微 生 物所
北 京 微 生物所
福建三明真菌所
福建三明真菌所
本所遗传育种组
福建三明真菌所
福建三明真菌所
福建三明真菌所
福建三明真菌所
福建三明真菌所
吉 林 生 物 所
吉 林 生 物 所
香 港 中文 大学
( 三 ) 醋酶 、 酸性磷酸酶及过氧化
物酶同工酶的电泳测定 : 按垂直平板聚
丙烯酞胺凝胶 电泳 方 法 进 行 t 3 ] 。 以
T E M E D一过硫酸按为催化系统 。 分离胶
浓度为 10 % , 浓缩胶浓度为 4 % 。 醋酶
电泳需稳定电压是 42 V /厘米 , 电 泳 时
间近二 小时 。 酸性磷酸酶及过氧化物酶
需稳定 1 5V /厘米的电压 , 电泳时间 3一
5 小时 。 各种酶谱的显色方法是 : 醋酶
以醋酸一 a 一 蔡醋为底物 , 快蓝为染料 。
酸性磷酸酶以 a 一蔡酚磷酸钠和固蓝盐 B
为染料 。 过氧化物酶以联苯胺一冰 醋 酸
混合液为染料 。酶带泳 电率按莽克 强 T“ 1
方法计算 。
( 四 ) 菌丝间的拮抗试验 : 在 9 厘
米 P . D . A . 平板上进行 。 每个平板接
上三个不同编号菌株的琼脂块 , 置24 一
2 5℃培养 14 一 15 天检查菌株间是否形成
拮抗线 。
粗勺 护。 护 , , , o , , , 夕 , : 卜, , *。偏 ,尹,。 , 1 ,场 几: 协 、 场物
图 1 18 个侧耳菌株的醋酶同工酶酶谱
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e s t e ar s e
i s o z y也 e o f 1 8 s t r a i n s o f P l e u r o t u s .
2 期 汤卫真等 :利用同工酶酶谱法鉴别侧耳属的种和菌株 145
二 、 试验结果与分析
(一 ) 侧耳属的8 1个菌株菌丝体提取液的醋酶谱带 、 部分菌株的子实休形态如图 1、 图
版 I。 图中表明各菌株的醋酶谱带与其子实体的形态存在一定的关系 。 醋酶同工酶谱带差异
较大 (醋酶带数 、 酶活性及迁移率等差异大 ) 的菌株其子实体的形态不同 , 如 P 。 , 糙 皮 侧
耳 ( P l e u r o t u s o s t r e a t u s ) 、 P : 。 , 漏斗状侧耳 ( P l . s a j o r一 e a j u ) 、 P : 。 , 榆黄蘑 ( P I . e i t r i n -
oP ile at us ) 为不同的种 。 酚酶同工酶谱带差异较小的菌株其子实体的形态相似 , 如 P : , P 。 ( IP .
o s t r e a t u s )与 P : : , P : 3 , 肺形侧耳 ( P I . p u lm o n a r i u s ) ; P , 。 , 真线侧耳 ( P I . e u g r a m m u s )与
P :
。 , 短袍真线侧耳 ( P I . e u g r a m m u s v a r . b r e v i s p o r u s ) 它们各是有亲缘关系的菌株 。 醋
酶谱带基本上不存在差异的菌株 , 其子实体的形态结构 相 同 。 如 P , 。 ( lP . s aj o r 一 。 aj u) 与
P
` 。 7 。漏斗状侧耳 ( P I . s a jo r 一 e a ju ) , P , 。肺形侧耳 ( P I . p u l m o n a r i u s ) 与 P : , ( P I . p u l m o n a 一
r i u s )
,
P Z 。 ( P l
.
e i t r i n o p i l e a t u s )与 P : 7榆黄蘑 ( P l . e i t r i n o p i l e a t u s )各为相同的种 。 醋酶谱
带与拮抗试验结果也存在一定的关系 。 菌株间不存在拮抗线的其醋酶酶谱基本相同 。 如 P : 。
与 P ` 。 7 。 , P , 。与 P : : , P 2 6 与 P Z , 。 存在拮抗线的菌株 , 它们的醋酶酶谱均有不同程度 的 差
异 。 以上结果说明侧耳属的种或菌株用醋酶同工酶酶谱鉴别与形态结构鉴别和拮抗试验结果
相一致 。 醋酶酶谱 既有种的特异性 , 也能反映种间的亲缘关系 。
在一定条件下 , 各菌株的主酶带 ( 指显色较深的带 )泳电率 ( R f) 是墓本 稳定的 (见 表 2 ) 。
表 2 三个侧耳菌株的醋酶同工酶主酶带泳电率 ( fR )
侧 耳 菌 株
主 酶 带 泳
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(漏斗状侧耳考j u )巨三亚…亚砚于画乡硫五。 1 8{。 . 4 5。士。 . 。 1 4{。 . 5。 4士。 . 。。 6P 卫: ( P . f l o r i d a n u s )
(蚝 菇 ) 10
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2 8 8士。 . 。 , 3…。 . 4 4 8士。 . 。。。 {。 . 4。 4士。 . 。 1。。 . 5 4。士。 . 。 1 7 . 7 1 0士 0 . 0 0 8
, 各戈是 6 次电泳的R f值标准差
泳电率标准差在 0 . 0 04 至 0 . 0 2 6之间 。 这表明各菌株酶带的相对位置是一定的 。 所 以每次电泳
对同一菌株来说 , 其酶纹都能重复出现 。
`
( 二 ) 酸性磷酸酶与过氧化物酶同工酶酶谱 : 圈 2 是 几个菌株的酸性磷酸酶和过氧化物
酶同工酶谱 。 它们与醋酶同工酶酶谱有如下关系 : 酷酶同工酶酶谱差异大的菌株其酸性磷酸
酶及过氧化物酶酶谱差异也大 。 如 P , , ( P l . e y s t i d i o s u s ) 与 P , : ( P I . f l o r id a n u s ) 、 P : 。 ( P l .
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a m m su )
, 见图 2 : 1 。 醋酶同工酶酶谱相近或相同的菌株其酸性磷酸酶与过氧化物酶
同工酶酶谱也相近或相同 。 如 P : 。与 P ` 。 7 。 , P Z 。与 P : , , 见图 2 : 2 , 图 2 : 3 。 这表 明三
种同工酶酶谱鉴定的结果是一致的 。
( 三 ) 不同培养基的菌丝体提取液的醋酶同工酶酶谱见图 3 : 图 3 表明同一菌株采用不
146 广 西 植 物
图 2 几个菌株的醋酶 、 酸性磷酸酶及过氧化物
酶的同工酶酶谱 。
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2 E l e e t r o p五o r e t i e p at t e r n o f e st e r ae s
ph o s ph at e a s an d pe r o x i d ae si o z s v me
o f e s ve r al st r ai n o sf P l e u r o t u s
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图 2 , l .a 醋酶 ; .b 酸性磷酸酶
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e y s t i d i o s u 。 ) , P l : ( P I
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图 2 : Z .a 醋酶 ;
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图 3 不同培养基的菌丝醋酶同工酶谱
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3 E l e e t r o p h o r e t i e p a t t e r n o f e s t e r a s e i s o z y m e o f m y -
e e l i: L l e x t r a e t s o n s e v e r a l m e d i a
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. 马铃薯培养基 ; .b 硝酸钠培养基 ;
。 . 硫酸馁培养基 ; d .酵母浸膏培养基 。
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P o t a t o m e d i认 m ; b . N a N o m o d i u m : e . ( N H 一 ) 5 0 一 m e d i u m ;
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翻 l兰旦旦, {里 里 .」. .目 砚甲川 . . , .介 {目 由 口 .一翻…: - 吕r刁 . 口 . .{口. .-
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同培养基培养 , 其菌丝体提取液的醋酶同工酶酶谱在本质上是相同的 , 只是酶带强弱有别 。
马铃薯 、 硫酸按及酵母浸膏为氮源培养的菌丝体 , 其醋酶同工酶酶带活性较强 , 而硝酸钠为
氮源培养的菌丝其醋酶酶带活性较弱 。
( 四 ) 不同培养时间的菌丝体醋酶同工酶酶谱见图 4 : 从图 4 可看到同一菌株不同培养
时 间其菌丝的醋酶同工酶酶纹没有差异 。
2 期 汤卫真等 : 利用同工酶酶谱法鉴别侧耳属的种和菌株
丸 ` . 8 `天,
图 4 不同培养时间培养的菌丝醋酶同工酶酶诺 。
F i g
.
l E l e e t r o p h o r e t i e p a t t e r n o f e s t e r a s e i s o z y m e o f
m y e
e l i a l e x t r a e t s f r o m v a r i o u s s t a g e s o f e u l t u r e
三 、 讨 论
lB ia
c h 工“ ] 认为酶带太简单或太复杂都不宜作为鉴别的酶 。 本文测定的三种酶都不存在
这种情况 , 适作鉴别的酶 。 其中以醋酶尤为适合 , 因为醋酶的测定最易掌握 , 且 酶 带 最 清
晰 、 稳定 。 本试验测定的结果指出 , 用醋酶 、 酸性磷酸酶及过氧化物酶等同工酶酶谱对侧耳
属的种或菌株进行鉴定与拮抗试验或按子实体形态结构鉴定的结果基本一致 。 以同工酶作为
鉴别种或菌株的依据只用培养菌丝就可达到目的 。 采用拮抗反应方法虽然也能在菌丝阶段得
到鉴别 , 但这个方法不能反映菌株间的亲缘关系 。 如 P : 与 P S 、 P , , , P , 。与 P Z 。 等菌株是彼
此 仃亲缘关系的菌株 , 但它们之间都分别存在拮抗线 。 在育种工作中 , 如需选扦亲玫较远的
亲木作为杂交材料时 , 利用同工酶电泳方法进行选择是较可靠的 , 酶带差异越明 只的苗株 ,
其亲缘 又系也越远 。 对于杂交育种后代的鉴定 , 测定同工酶是一种快速方便的鉴定方法 。 例
如漏斗状侧耳 P 4 。 7 。 ( P I . s a j o r 一 c a j u ) 是以 P , 。 ( P I . s a jo r 一 e a j u )为其中一亲木 f自杂交后代 ,
通过上述几种同工酶的鉴定和拮抗试验以及子实休的形态结构鉴定 , 它与 P , 。无论在形态上
或生理上均未见任何差异 。
P
: 。
( P l
.
e i t r i n o p i l e a t u s )与 P : 7 ( P I . e l t r i n o p i l e a t u s )是来自同一地方的 j巧个 一不同编号
的菌株 , 经木试验鉴定 , 两者其实是同一个利 , 。 P Z ( p l . 。 s t r 。 a t u s )与 P 。 ( P I . o s t r c a t u s ) 分
别是未 自福建 灿云南的二个糙皮侧耳 。 它们的子实体形态结构墓木相同 , 酷酶同工酶酶纹相
似 , 祖拮抗试验存在拮抗线 。 一可以认 为它们是同一 个种的变异菌 。 E g e r ( 1 9了9 ) 1 5 1 认为用
宏观 和微观特征对糙皮侧耳 ( IP . o s t r e at u S ) 进行鉴别是 不可靠的 。 在这一点土 , 木文有 相
{`
!
i r`勺见解 。
参 考 文 献
〔 1 〕 邓叔群 , 1 0 6 3 : 中国的真送! 。 5 5 0一 5 8 3 , 科学 { l })胶字i _ 。
〔 2 〕 应建浙等 , 1 9 8 2 : 食用蘑炎 。 7。一82 , 图71 一 7 5 , 科学出版社。
〔 3 〕 莽克强等 , 1 9 7 5 : 聚丙烯酚胺凝胶电泳 。 科学出版社 。
[ 凌〕 C o r n e r , E . 、 J . 气 H . 2 9 8 1 : 1 飞h e A g a r i e G e n e r a L e n t i n t : s , P a n u s , a n d P l e u r o t u “ . J ·
C r a m e r G e r m a n y 1 6 O P p
.
[ 5 〕 E g e r , G . , L i , 5 . F . a n d L e a l一 L a r a , H . 1 9 7 9 : C o n t r i b u t i o n t o t h e d i s e u s s i o n o n t h e
14 8 广 西 植 物 7 卷
S P e e ie, e o n e e p t i n t h e P l e u r o t u s o s t r e a t u s e o m P l e x
.
M y e o l
o g i a 7 1
: 5 7 7一 5 8 8 .
[ 6 ] H a l l
,
R一1 0 6 7 : P r o t e i n a n d 。 a t a l a s e i s o e n z y m e f r o m F u s a r i u m s o x a n i a n d t h e i r
t a x o n o m i e s i g n i f i e a n e
.
A u s t
.
J
.
B i o l
.
S e i
.
2 0 (2 )
: 4 1 9一 4 2 8 .
[ 7 ] M i l l e
r , 0
.
K
.
2 9 6 9 : A n e w s p e e i e s o f P l e u r o t u s w i t h a e o r i e m o i d im p e r f e e t s t a g e
.
M y e o l o g i
a 6 1: 5 5 7一 8 9 3 .
[ 8 ] P e g l e r
,
D
.
N
.
1 9 7 7 : P l e u r o t u s ( A g a
r
i e
a l e s ) i n r
n d i a
,
N e p a l a n d p a k i s t a o
.
K e w B u l l
3 1 : 50 1一 5 1 0 .
[ 9 ] R o l f B l a i
e h
,
1 9 7 6 : E n z v m e s a s a n a i d i n t a x o n o m y o f h i g h e : B a s i d i o m y e e t e s
,
“ T h e S p e e i e s C o n e e p t i n H y m e n o nr y e e t e s
. ” E d i t e d b y H
.
C l e m e n e o n J
.
G r a m e r
G e r m a n y
.
2 1 5一 2 2 5 .
[ 1。] S i n g e a , R . 1 9 7 5 : T h e A g a r i e a l e s i n o o d e r n t a x o n o m y , J . C r a m e r . g i Z p p .
[ 1 1 ] T o y o 皿 a s u T . a n d z e n n y o z i A . 1 9 5 1 : O n t h e a p p l ; e a t i o n o f i s o z y m e e l e e t r o p h o -
r e s i s t o i d e n t i f i e a t i o n o f s t r a i n i n L e n t i n u s e d o d e s
.
M u s h
r o o 也 S e i e n c e , X l
( P a r t Z )
: 6 7 5一 68 4 .
O N T H E AP P L !C A T !ON O F !SO Z Y M E Z YMOG RAM
下E C HN !QU E T O ID E N T IF Y T HE S P EC IE S OR
S T RA IN S O F T HE G E N U S P L E URO T U S
T a n g W
e i一 Z e n Z h e n g G o u 一 y a n g a n d B i z h i一 s h u
( I
n s t i t u t e o f M i
e r o b i o l o g y o f G u a n d o n g P r o v i n e e
,
G u a n g z h o u )
A b s t r a c t T h i s P a p e r r e p o r t s t h e p r e l im i n a r y r e s u l t s o n t il e a p p l i e a t i o n o f e s t e r a s e
z y m o g r a m s t e e h n i q u e t o i d e n t i f y t h e s P e e i e s o r s t r a i n o f P l e u r o t u s
.
I t h a s b e e n f o u o d
t h a t t h e r e s u l t s s h o w e d l i t t l e d i f f e r e n e e f r o m t h a t o f u s i n g m o r p h o l o 只y o f t h e i r f r u i t -
b o d i e s f o r i d e n t i f i e a t i o n a n d t h a t e s t e r a s e z y m o g r a m a r e r e l a t e d t o t h e a n t a g o n i s m
a m o n 号 t h e s t r a i n s . T h e i d e n t i f i e a t i o n o f s p e e i e s o r s t r a i n o f P l e u r o t u s w a s a l s o e v a l -
u a t e d
.
K e y w o r d s I s o e n z y m e s ; Z y m o g r a m s ; P l e u r o t u s ( F
r
.
) K u m m ; E s t e
r a s e
1 4 8 广 西 植 物 7卷
S P e e i e, e o n e e p t i n t h e P l e u r o t u s o s t r e a t u s e o m P l e x
.
M y e o l
o g i a 7 1
: 5 7 7一 5 8 8 .
[ 6 ] H a l l
,
R一1 0 6 7 : P r o t e i n a n d 。 a t a l a s e i s o e n z y m e f r o m F u s a r i u m s o x a n i a n d t h e i r
t a x o n o m i e s i g n i f i e a n e
.
A u s t
.
J
.
B i o l
.
S e i
.
2 0 (2 )
: 4 1 9一 4 2 8 .
[ 7 ] M i l l e
r , 0
.
K
.
2 9 6 9 : A n e w s p e e i e s o f P l e u r o t u s w i t h a e o r i e m o i d im p e r f e e t s t a g e
.
M y e o l o g i
a 6 1: 5 5 7一 8 9 3 .
[ 8 ] P e g l e r
,
D
.
N
.
1 9 7 7 : P l e u r o t u s ( A g a
r
i e
a l e s ) i n r
n d i a
,
N e p a l a n d p a k i s t a o
.
K e w B u l l
3 1 : 50 1一 5 1 0 .
[ 9 ] R o l f B l a i
e h
,
1 9 7 6 : E n z v m e s a s a n a i d i n t a x o n o m y o f h i g h e : B a s i d i o m y e e t e s
,
“ T h e S p e e i e s C o n e e p t i n H y m e n o nr y e e t e s
. ” E d i t e d b y H
.
C l e m e n e o n J
.
G r a m e r
G e r m a n y
.
2 1 5一 2 2 5 .
[ 1。] S i n g e a , R . 1 9 7 5 : T h e A g a r i e a l e s i n o o d e r n t a x o n o m y , J . C r a m e r . g i Z p p .
[ 1 1 ] T o y o 皿 a s u T . a n d z e n n y o z i A . 1 9 5 1 : O n t h e a p p l ; e a t i o n o f i s o z y m e e l e e t r o p h o -
r e s i s t o i d e n t i f i e a t i o n o f s t r a i n i n L e n t i n u s e d o d e s
.
M u s h
r o o 也 S e i e n c e , X l
( P a r t Z )
: 6 7 5一 68 4 .
O N T H E AP P L !C A T !ON O F !SO Z Y M E Z YMOG RAM
下E C HN !QU E T O ID E N T IF Y T HE S P EC IE S OR
S T RA IN S O F T HE G E N U S P L E URO T U S
T a n g W
e i一 Z e n Z h e n g G o u 一 y a n g a n d B i z h i一 s h u
( I
n s t i t u t e o f M i
e r o b i o l o g y o f G u a n d o n g P r o v i n e e
,
G u a n g z h o u )
A b s t r a c t T h i s P a p e r r e p o r t s t h e p r e l im i n a r y r e s u l t s o n t il e a p p l i e a t i o n o f e s t e r a s e
z y m o g r a m s t e e h n i q u e t o i d e n t i f y t h e s P e e i e s o r s t r a i n o f P l e u r o t u s
.
I t h a s b e e n f o u o d
t h a t t h e r e s u l t s s h o w e d l i t t l e d i f f e r e n e e f r o m t h a t o f u s i n g m o r p h o l o 只y o f t h e i r f r u i t -
b o d i e s f o r i d e n t i f i e a t i o n a n d t h a t e s t e r a s e z y m o g r a m a r e r e l a t e d t o t h e a n t a g o n i s m
a m o n 号 t h e s t r a i n s . T h e i d e n t i f i e a t i o n o f s p e e i e s o r s t r a i n o f P l e u r o t u s w a s a l s o e v a l -
u a t e d
.
K e y w o r d s I s o e n z y m e s ; Z y m o g r a m s ; P l e u r o t u s ( F
r
.
) K u m m ; E s t e
r a s e