全 文 ：第 33卷第 6期
20 1 0年1 1月
河 北 农 业 大 学 学 报
JOURNA L OF AGRICULT URAL UNIVERS IT Y OF HEBEI
　 　 Vol.33 No.6
Nov .2 0 1 0
文章编号:1000-1573(2010)06-0031-05
17种木犀科植物的 AFLP 指纹分析
王　洋1 , 　赵书岗1 , 　赵　锦1 , 2 , 　刘孟军2
＊ (1.河北农业大学 生命科学学院 , 河北 保定 071001;2.河北农业大学 中国枣研究中心 , 河北 保定 071001)
摘要:应用 AFLP技术对木犀科 17 种植物的亲缘关系进行了分析 , 利用从 16 对引物中筛选出的多态性好的
5对引物 ,共扩增出条带 553 条 , 其中多态性条带 451 条 ,多态性比率 81.6%;不同属之间 , 白蜡属的多态性比率
最低;采用 UPGMA 法进行了聚类分析 , 初步证明丁香属和女贞属之间亲缘关系最近 ,连翘属和素馨属亲缘关
系较近;筛选出了 15 种木犀科植物的特征性 AFLP标记 ,为分子水平开展木犀科植物的分类研究提供了有益
参考。
关　键　词:木犀科;AFLP;亲缘关系;UPGM A法;聚类分析
中图分类号:Q 949.776.2 文献标志码:A
AFLP analysis on 17 species of Oleaceae family
WANG Yang1 , ZHAO Shu-gang1 , ZHAO Jin1 , 2 , LIUMeng-jun2
(1.Colleg e of L ife Science , Agricultural Univer sity of Hebei , Baoding 071001 , China;
2.Resea rch Center of Chinese Jujube , Agricultural Univer sity o f Hebei , Baoding 071001 , China)
Abstract:Plants of Oleaceae family are very important landscaping plants.The relat ionship of
17 species of Oleaceae family w as analyzed by using AFLP .Only 5 out of 16 pai r primers w ere
screened fo r AFLP analysis and 451 polymorphic bands we re amplified f rom 553 bands in to tal.
The rate of po lymo rphism w as 81.6 %.Using UPGMA me thod , the cluster analy sis of AFLP
show ed that ①the F rax inus L .had the lowe st polymorphism;②the S yringa L.had the clo-
sest relat ionship wi th Ligustrum L.and Forsy thia Vahl had the closer relat ionship w ith Jas-
minum L .At the same time , AFLP markers of 15 species were obtained.These results could
provide beneficial reference for identifying plants of Oleaceae family at the molecular level.
Key words:Oleaceae;AFLP ;phy log enetic relationship;UPGMA;cluster analy sis
　　扩增的限制性内切酶片段长度的多态性标记
(AFLP)是 20世纪 90年代发展起来的一种分子标
记技术[ 1] ,具有方便 、快捷 、稳定而可靠 ,而且 DNA
的用量少 ,多态性丰富。这项技术已在许多领域中
广泛应用[ 2-4] ,其中在植物研究中 ,AFLP 用于构建
植物遗传图谱 、遗传多态性研究 、种质资源鉴定 、作
物育种辅助选择等众多领域[ 5-12] ,有着其他分子标
记技术不可比拟的优势 。
木犀科植物 ,从温带至热带 ,从低纬度到高纬度 ,
广泛分布于除南极大陆之外的各个大陆[ 11] 。木犀科
植物具有重要的经济价值 ,如橄榄 、白蜡为重要的经
济林木 ,素馨属 、连翘属 、丁香属 、女贞属植物为重要
＊收稿日期:2010-09-09
基金项目:河北省自然科学基金(C2009000534、08D020)和河北省杰出青年基金(C2010000679)资助.
作者简介:王　洋(1986-),男 , 在读硕士生 , 主要从事植物资源研究.E-mail:tzjzw angy@163.com
通讯作者:刘孟军(1963-),教授 , 主要从事干果种质资源研究.E-mail:kjliu@hebau.edu.cn
赵　锦(1977-),教授 , 主要从事植物资源与抗病育种研究.E-mail:zhao jind@yahoo.com
　　　　　 河 北 农 业 大 学 学 报 第 33卷
的观赏树种[ 14] 。木犀科植物多为乔木 、灌木或木质
藤本 ,单叶或复叶对生 ,无托叶 ,花两性辐射对称 ,花
萼 、花冠常 4裂 ,雄蕊 2枚 ,子房上位 ,心皮 2 ,果实为
蒴果 、翅果 、核果或浆果[ 13, 15] 。但木犀科一些植物形
态学性状极为相近 ,如白丁香和紫丁香 、北京丁香和
暴马丁香等 ,故本试验利用 AFLP 技术对 5个属 17
种木犀科植物进行了分析 ,拟探讨它们在分子水平的
差异与形态学之间的关系 ,为更加深入 、精确的进行
植物鉴定及分类提供合理的方法及理论依据。
1　材料和方法
1.1　材料
供试的 17个木犀科植物和 3 个蔷薇科植物均
采自河北农业大学校园 ,具体见表 1。采集部位为
树冠外围新梢健康嫩叶 ,单株采样 ,取样后装入封口
袋并作标记 ,立即放入冰盒中带回实验室 , -20 ℃
保存备用。
表 1　供试材料
Table1　Material tested in this experiment
编号
No.
植物名称
Name
属
Genera
编号
No.
植物名称
Name
属
Genera
1
白丁香
S y ringa oblate var.alba
丁香属
Sy ringa L. 11
女贞
L igustrum luci dum
女贞属
L igustrum L.
2
紫丁香
S y ringa oblate
丁香属
Sy ringa L. 12
小叶梣(小叶白蜡)
Frax inus bungeana
白蜡属
Frax inus L.
3
红丁香
Sy ringa villosa
丁香属
Sy ringa L. 13
花曲柳(大叶白蜡树)
Fraxinus rhynchophy lla
白蜡属
Frax inus L.
4
华丁香
S y ringa protolaciniata
丁香属
Sy ringa L. 14
迎春花
Jasminum nudi f lorum
素馨属
Jasminum L.
5
暴马丁香
Sy ringa reticulate va r.amurensis
丁香属
Sy ringa L. 15
连翘
Forsy thia suspensa
连翘属
Forsy thia Vahl.
6
北京丁香
S y ringa pekinensis
丁香属
Sy ringa L. 16
金钟花
Forsy thia viridissima
连翘属
Forsy thia Vahl.
7
辽东水蜡树
L igustrum obtusi f olium
女贞属
L igustrum L. 17
有毛连翘＊
Forsy thia suspensa
连翘属
Forsy thia Vahl.
8
金叶女贞
Li gustrum×vicary i
女贞属
L igustrum L. 18
白花重瓣玫瑰
Rosa rugosa f.albo-plena
蔷薇属
Rosa L.
9
小叶女贞
L igustrum quihoui
女贞属
L igustrum L. 19
粉红单瓣玫瑰
Rosa rugosa f .rosea
蔷薇属
Rosa L.
10
金边女贞
Li gustrum ovali f olium var.
aur-eo-marginatum
女贞属
L igustrum L. 20
玫瑰
Rosa rugosa
蔷薇属
Rosa L.
　　注:有毛连翘为连翘种群中小枝及叶片有毛类型.
1.2　方法
1.2.1 　DNA 的提取纯化 　DNA 的提取参照
CTAB法并略做改动。具体步骤:称量 0.1 g 植物
叶片 ,加入液氮迅速研磨成粉末 ,转入 1.5 mL 离心
管中 ,每管加入 1.4 mL 65 ℃预热 30 min的提取
液 ,充分混匀 , 65 ℃水浴 30 min , 其间不断混匀;
4 ℃,10 000 r/min离心 10 min ,吸取上清 750 μL ,
加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),混匀静
置 10 min;4 ℃,10 000 r/min 离心 10 min ,吸取上
清 500 μL ,加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1),混匀
静置 10 min;4 ℃,10 000 r/min离心 10 min ,吸取
上清 300 μL ,加入 200 μL 冰冻异丙醇 ,混匀-20 ℃
静置 1 h;4 ℃,10 000 r/min离心 10 min ,弃上清用
70%乙醇洗沉淀 2 次 ,自然风干;用 500 μL ddH 2O
溶解 ,加入 3 μL RNaseA (10 mg/mL)37 ℃水浴
30 min;加 500μL 酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),
混匀 ,4 ℃, 10 000 r/min离心 10 min;取上清加等
体积氯仿∶异戊醇(24∶1),混匀 , 4 ℃, 10 000 r/
min离心 10 min ,吸取上清 300 μL ,加入 600 μL 冰
冻无水乙醇混匀 , -20 ℃静置 1 h;4 ℃, 10 000 r/
min 离心 10 min ,弃上清用 70%乙醇洗沉淀 2 次 ,
无水乙醇洗沉淀 1次 ,自然风干后用 50 μL ddH 2O
溶解过夜待用。
1.2.2　AFLP 分析　酶切 20 μL 体系中 NEBuffer
2.2μL ,BSA 0.2μL ,MseⅠ(10 U)0.3μL , EcoR Ⅰ
(20 U)0.15 μL , DNA 100 ng ,ddH 2O补足 20 μL。
混匀 ,37 ℃,3 h , 65 ℃,20 m in使酶失活 。
32
　第 6期　　　 王　洋等:17种木犀科植物的 AFLP 指纹分析
连接 　将 5 μL 体系(Ligase buffer 0.5 μL ,
EcoR Ⅰ adapter 1.0 μL , Mse Ⅰ adapter 1.0 μL , T 4
Ligase(5 U)0.5 μL , ddH 2O 2 μL)加入 20 μL 的
酶切产物中。混匀 , 16 ℃过夜连接 ,然后 70 ℃灭
活 10 min。
预扩增　优化后的预扩体系为 25μL ,循环条件:
94 ℃2 min;23个循环(94 ℃30 s;56 ℃30 s ;72 ℃
1 min);72 ℃10 min;4 ℃保温。连接产物不稀释。
选择性扩增　预扩产物稀释 20倍作为选扩模
板 ,优化后的选扩体系为 20 μL , 循环条件:94 ℃
2 min;13个循环(94 ℃30 s;65 ℃30 s , -0.7 ℃/
cycles;72 ℃1 min);25个循环(94 ℃ 30 s ;56 ℃
30 s ;72 ℃1 min);72 ℃5 min;4 ℃保温。上样前
加入 10 μL loading buffer ,95 ℃变性 10 min 。选用
引物为:E-AGA 、E-A TA 、E-ACC 、E-ACT 和 M-
CCA 、M-CA T 、M-CCT 、M-CGC ,两两组合。
电泳和染色　电泳时 ,先在 80 W 恒功率条件
下预电泳 30 min ,然后点样 ,80 W 恒功率电泳 2 h 。
染色方式采用银染。
1.2.3　数据处理和分析　不同植物种类的 AFLP
特征性标记 。通过对 PAGE 板条带的标记观察 ,筛
选出特定植物特有的条带 ,从而用此专一性条带(指
纹)指示特定的植物种类。
聚类分析以 1和 0的方式记录电泳结果图版中
条带位置。对清晰的条带 ,进行计数 ,在相同的电泳
迁移位置上有带的记为 1 ,无带的记为 0 ,将条带信
息转换成原始矩阵 。数据录入 NTedi t1.2 后获得
数据文件 ,以 Jaccard遗传相似系数为基础计算植
物种类间的遗传距离 ,采用 UPGMA 对数据进行聚
类分析 。
2　结果与分析
2.1　木犀科各属内多态性分析
本试验从 16对 AFLP 引物中筛选扩增条带数
目多 、带型整齐清晰的引物 ,其中引物 E-ACC/M-
CCA的多态性最高(图 1),对其中 5对引物的扩增
结果进行了统计和分析 ,这 5对引物共扩增出 553
条清晰条带 ,结果如表 2 。
M :Maker;1:白丁香;2:紫丁香;3:红丁香;4:华丁香;5:暴马丁香;6:北京丁香;7:辽东水蜡树;8:金叶女贞;9:小叶女贞;10:金边女贞;11:女
贞;12:小叶梣;13:花曲柳;14:迎春花;15:连翘;16:金钟花;17:有毛连翘;18:白花重瓣玫瑰;19:粉红单瓣玫瑰;20:玫瑰(箭头所指是部分品种
的指纹标记)
图 1　17 种木犀科植物和 3 种蔷薇科植物的 AFLP分析
Fig.1　AFLP analysis of 17 species of Oleaceae and 3 species of Rosaceae
表 2　5 对 AFLP选择性扩增引物的多态性条带分析
Table 2　Polymorphism bands amplificated by using the 5 pairs AFLP-primer
引物组合 E/M
Prime r
combination
总扩增条带
To tal bands
o f amplified
多态性条带
Bands o f
po lymorphism
多态性比率/ %
Ratio o f po ly
mo rp hism
引物组合 E/M
Prime r
combina tion
总扩增条带
To tal bands
of amplified
多态性条带
Bands of
polymo rphism
多态性比率/ %
Ratio o f poly
mo rp hism
丁香属 女贞属
AGA/ CCA 88 82 93.2 AGA/ CCA 81 78 96.3
ATA/CCT 52 49 94.2 ATA/CCT 33 27 81.8
A TA/ CAT 103 97 94.2 ATA/ CAT 69 47 68.1
ACT/ CC T 56 51 91.2 ACT/ CC T 50 36 72.0
ACC/CCA 86 80 93.0 ACC/CCA 78 66 85.0
总计 385 359 93.2 总计 311 254 81.2
白蜡属 连翘属
AGA/ CCA 41 7 17.1 AGA/ CCA 87 74 85.6
ATA/CCT 25 11 44.0 ATA/CCT 37 36 97.3
A TA/ CAT 61 22 36.1 ATA/ CAT 76 71 93.4
ACT/ CC T 48 29 60.4 ACT/ CC T 53 50 94.3
ACC/CCA 56 20 36.3 ACC/CCA 68 60 88.0
总计 231 89 38.8 总计 321 291 91.1
33
　　　　　 河 北 农 业 大 学 学 报 第 33卷
　　表 2表明 ,多态性条带 451 条 ,多态性比率为
81.6%,不同属之间 ,白蜡属的多态性比率最低;丁
香属 、连翘属及女贞属之间多态性较高 ,其亲缘关系
较远;白蜡属供试植物间多态性较低 ,其亲缘关系
较近 。
2.2　17种木犀科植物的聚类分析
利用筛选出的 5对引物对供试 17种植物品种
进行了 AFLP 分析 ,统计其清晰有效的条带 ,根据
统计的 DNA 指纹数据 ,应用 N T2SYS-PC 软件中
的 UPGMA 聚类法构建了 17种木犀科植物和 3种
蔷薇科植物的聚类树状图(图 2)。
图 2　17 种木犀科植物和 3 种蔷薇科植物的 AFLP 分析聚类图
Fig.2　AFLP cluster analysis of 17 species of Oleaceae and 3 species of Rosaceae
　　由图 2的聚类分析结果可以看出 ,本试验采用
的木犀科 17 个种或变种间相似系数最大的为
0.93 ,最小的为 0.64。在相似系数 0.685 处 , 可以
将 17个木犀科植物分为 6类。第 1类包括 3 个种
或变种 ,为白丁香 、紫丁香 、红丁香;第 2类包括 4个
种或变种 ,分别为辽东水蜡树 、金叶女贞 、小叶女贞 、
金边女贞;第 3类包括 3个种 ,为华丁香 、暴马丁香 、
北京丁香;第 4类包括女贞 、小叶梣 、花曲柳;第 5类
为迎春花;第 6类包括连翘 、金钟花 、有毛连翘。作
为外对照的 3种蔷薇科植物与木犀科植物也完全区
别开 。
本试验中金叶女贞和小叶女贞相似系数最大 ,
在 0.93 处聚在一起 ,仅有极个别条带出现差异 ,说
明其存在着非常近的亲缘关系;6 种丁香品种虽同
属丁香属 ,但白丁香 、紫丁香和红丁香与华丁香 、北
京丁香和暴马丁香之间差异较大 ,可能其亲缘关系
较远;迎春花为素馨属植物 ,与 3种连翘之间有明显
差异。
2.3　AFLP指纹标记筛选
根据不同引物对获得的 AFLP 图谱 ,在供试的
17种木犀科植物范围内筛选出了 15个木犀科植物
的特有多态性条带 ,即 AFLP 指纹标记(表 3)。其
中最短的标记片段 110 bp;最长的标记片段 600
bp ,仅在 2个亲缘关系最近的金边女贞和小叶女贞
未找到标记 ,也进一步说明了二者非常近的亲缘关
系 ,和形态学特征一致 。
表 3　15 种木犀科植物的指纹标记
Table 3　Fingerprint of the 15 species of Oleaceae family
植物名称
Name
引物(E/M)
Primer
大小/ bp
Leng th
植物名称
Name
引物(E/M)
Primer
大小/ bp
Leng th
白丁香　 AC T/ CCT 220 女贞　　 ACT/ CCT 185
紫丁香　 ATA/ CCT 215 小叶白蜡 ACT/ CCT 500
红丁香　 AC T/ CCT 600 大叶白蜡 ACC/ CCA 300
华丁香　 ACC/CCA 180 迎春花　 ACC/ CCA 280
暴马丁香 AGA/CCA 190 连翘　　 AGA/CCA 100
北京丁香 ACC/CCA 250 狭叶连翘 ACT/ CCT 115
辽东水蜡 ACC/CCA 400 有毛连翘 ACT/ CCT 110
金叶女贞 ATA/ CCT 110
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　第 6期　　　 王　洋等:17种木犀科植物的 AFLP 指纹分析
3　讨论与结论
本试验将 17种木犀科植物分为 6类 ,其结果与
传统的形态学分类是基本一致的。在本试验分析的
木犀科 5个属中 ,丁香属多态性最高 ,说明丁香属植
物之间亲缘关系较远 ,对应的在丁香属植物的形态
上也有很明显的差异;白蜡属多态性较低 ,即供试的
2种白蜡植物亲缘关系较近 ,形态上看 2种植物也
有很高的相似性。17 种木犀科植物种间相似系数
最大的为 0.93 ,即金叶女贞和小叶女贞 ,仅有个别
条带的差异 ,说明二者存在非常近的亲缘关系 ,有可
能是只是个别基因突变的结果;相似系数最小的为
0.64 ,表明迎春花和连翘属植物与木犀科其它属植
物亲缘关系较远 ,迎春花和连翘属植物形态上虽有
相近之处 ,但从分子水平上看 ,却表现很大差异;丁
香属植物中 ,白丁香是紫丁香的变种 ,仅在所开花的
颜色有差异 ,但在 AFLP 分析中出现了明显的差异
条带 ,这些差异条带很可能是与控制花色发育的基
因相关 ,可进行深入研究;北京丁香和暴马丁香形态
学特征非常相似 ,但分子水平也是出现了差异 ,侧面
表明了 AFLP 技术的高效性与准确性;特别是本试
验中采集的有毛连翘 ,与连翘相比其植株幼叶表面
及小枝具有白色柔毛 ,AFLP 分析表明 ,此二者的亲
缘关系较连翘与金钟花更远 ,所以有毛连翘是否是
连翘发生了可遗传的变异尚需深入研究 。
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(编辑:张月清)
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