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广 西 植 物 Guihaia 14(1)：74—80 1994
植物原生质体培养及有关生理基础问题
PLANT PR0T0PLAST CULTURE AND SOME BASIC
PHYSf0L0GICAL PR0BLEMS
Zha。 Ying ∞ d Liang HeSma~a
(Department ol Biology，Ha~gzhou Univ ersity，Han~zhou 310012)
原生质体培养是植物组织培养的 一个重要方面。自1960年采用酶法制各大量植物原生质
体首次获得成功以来，这方面的研究发展迅速。但是一些重要农作物原生质体培养的效率还
不高，叶肉原生质体培养至今未得到再生植椿。因此，必须进一步摸索，掌握原生质体培养
的规律，提高再生植株的频率。
原生质体培养的基本步骤是；
外植体一脱壁一原生质体一原生质体复壁一分裂一愈生组织一分化一再生植株
t
}—÷胚状体—— ——⋯
已有的经验表明，除培养基、培养条件外，外植体的生理生化性状、脱壁胁迫等都会显著影
响原生质体培养效率。因此，对原生质体培养的生理基础进行了解是十分必要的。
1 外植体
现在除禾谷类叶肉原生质体不能成苗外，来自其它种类外植体的原生质体大都能成苗，
但是成苗的效率则随外植体的品种、部位、年龄、育苗条件等而差异甚大。
如马铃薯叶肉原生质体成苗，不同品种对添加 NAA的反应不同。蕃茄的8个品种，植
板率从0．1—87％，差异很大。向日葵叶肉、茎、子叶、胚轴的原生质体中仅胚轴原生 质 体
能获得较高分裂频率。烟草叶肉原生质体培养分别取叶位 1、8、5、7、9的叶片，原生
质体存活率最高43．1 ，最低仅7．0 。Lotus tennis的叶片，子叶，根的原生质体培养仅
子叶、根的原生质体可以分裂。大豆胚轴原生质体培养 取 5天苗龄的为最好，松树 Pinus
pinasla 的子叶原生质体培养，不同苗龄，原生质体得率、分裂次数都差异很大。禾谷类材
料年龄影响极大。小麦叶肉原生质体培养以8天苗最好，大麦叶肉原生质体得率也与年龄密
切相关。苜蓿子叶原生质体培养，绿色子叶培养效率大大优于黄色子叶。蕃茄叶肉原生质体
培养，供体材料25℃，暗培养18hr，再在4℃培养6hr，原生鹰体得率最高。各种处理与原 生
质体分裂培养效率之间也有明显关系，向F1蒌无菌苗用红光(1klx．16hr／d)照射，明显提高
浙江省自熟科学基金资助项日

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下胚轴原生质体再生能力，大麦叶肉原生质体叶片去除下表皮后，在山梨醇0．5M+GaOl2
1ram+MES 5m5I pit6．0的溶液中真空渗入2min，再脱壁，原生质体培养效果好。海岸橙
幼苗的根经山梨醇O．7M+半胱氨酸30mM处理lhr，原生质体得率提高8倍，芥菜子 叶 与胚
轴原生质休，无菌苗经低温处理2hr可显著提高分裂频率。水稻叶肉原生质体材料经多效唑
2．5rag／1处理，提高原生质体得率与活力。情况提示，进行原生质体培养时，供体的品种、
取材部位．年龄、育苗条件等都有显著影响，应该重视这些因素的筛选工作。
2 原生质体脱壁和脱壁过程中产生的问题
细胞脱壁过程中由于脱壁损伤和高渗介质会引起原生质体生理状况的改变。因此，从细
胞开始脱壁至原生质体再生壁以前的阶段是原生质体极易受外界因素影响的时期，因而也是
采取适当调控措施的有利时机。禾谷类叶肉原生质体培养24hr后往往大量自溶与脱壁过程 中
过氧化物酶及过氧化氢酶活性下降有关，需添加适当的保护剂来抑制这种影响。大麦小麦叶
肉原生质休分离时添加抗坏血酸 2ram可使原生质体得率，存活率显著提高。燕麦原生质体
培养添加0．1-1．0mM精胺可抑制RNase形成。酶渡中离子 调配合问题也直接影响原生质
体得率和存活率。萱草叶片原生质体脱壁时，供给KG1 0．1 9 M+GaG1 z0．1 4M存活率可达
73．53 ，而仅使用KG1 0．39M存活率为2．87 。Digitalis 0如0“r0叶肉原生质体培养添加
钙 12mM可使原生质体活力提高。此外，酶处理时会产生自由基，常采用备胱甘肤作保 护
剂。翅豆悬浮培养细胞，酶液中添加 2-琉基乙醇保护原生质体，抑制 RNA 酶的活性，也
有添加葡聚糖硫酸钾增加原生质体稳定性。由于脱壁时 lhr的高渗酶液就可使原生质体分裂
失败，引起 ABA上升，产生渗透胁迫蛋白。而原生质体难以分裂的原因之一是由高渗引起
的 ABA上升。因此，解决高渗引起的一系列生理变化是保持原生质体活力的重要方面。
3 值物原生质体分离和培养中的渗透胁迫问题和渗透值需求
s．1高渗时的质胰逸性和细胞骨架变化
高渗处理可导致胞质收缩，微丝结构的变化，从而影响到质膜稳定，对细胞骨架 微管
结构产生干扰。烟草4天幼叶分离的原生质体，当甘露醇为0．57M和0．30M时，质膜表面电
荷分别为+12ram，和+26ram，影响某些离子的进出。小麦根的质膜 囊 泡，当 环境 中供
给蔗糖由1100mM降至250mM，磷的释放量由20ram增至100ram。胡萝 圆片，提高外界甘
露醇浓度，促进外界环境中 K 内流。在蔗糖浓度与离子活性的关系实验中发现，添加5％
蔗糖，会使 NaG1、GaG1：等离子活性下降。这些说明，环境中渗透值的高低不仅影响膜 电
位，而且还影响离子活性的关系。实验中发现，添加5 蔗糖会使NaCA，GaG1 等离子活性下
降。这些说明，环境中渗透值的高低不仅影响膜电位，而且还影响离子活性和离子的进出。
s．2高渗时的氨基酸代谢和多胺状况
蕃茄细胞的悬浮培养物，在PEG 6000 25 时，会使脯氨酸库扩大300倍，使脯氨酸合
成扩大10倍。玉米胚根愈伤组织，甘露醇达No．33M，会使脯氨酸积累4．5倍。由此 可 见，
高渗会影响氨基酸代谢，从而影响蛋白质合成。在高渗环境下会使腐胺亚精胺、ADG活 性
增加。燕麦叶肉细胞和原生质休，在山梨醇O．4—0．6M下 6hr会使腐胺含量增加6O倍，ADO
活性也相应升高。大麦叶片切段，在渗透胁追条件下，腐胺积累8—4倍，而外源磷存在
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下，腐胺积累可增加 7倍。高活力的原生质体应是腐胺／(精胺+亚精胺 )比值相对较低。
丽高渗易使精胺、亚精胺合成抑制，导致腐胺积累。因此，在培养过程中应采用合适的渗透
值和注意必要时的外源多胺供应。
8．8高渗下的激素状况
高渗会导致ZAA ABA、乙烯等激素状况的变化，0．5M甘露醇处理燕麦芽鞘10rain，
会影响 ZAA与膜上受体的结台。苍耳叶片处于高渗环境会使内源 ABA由细胞质进入质外
体，使胞内ABA下降，但大麦叶片在高渗脱壁时引起的叶肉细胞内ABA的积累，并 不 能
在脱壁后的原生质体中降解。因此，高渗下内源 ABA 的变化比较复杂，但多数报告 ABA
在高渗下积累，对离体玉米根，供给 PEG-6000，可使细胞内 ABA水平提高4倍。苍耳叶
内细胞 高pⅡ喧促使内源ABA外流。这提示我们在培养过程中如何通过改变环境条件来减
少 ABA的积累。高渗也会影响乙烯的产生。石竹花瓣，糖舶供应抑制乙烯合成酶活性从而
使乙烯合成受阻，但着茄果实原生质使用真空渗人法加入半乳锖400 g／g．Fw 却能使乙烯
产生。一般说来，脱壁会 l起乙烯增加。
8．4商渗下曲晴迫蛋白
一 般认为，高渗下会产生渗透胁迫蛋白，如烟草叶肉原生质体的2一磷～核酮糖脱羧酶在
高渗脱壁时会缺失 2个亚单位，同时产生一些新的渗透胁迫蛋白。但玉米幼苗中胚轴在PEG
供应下，仅引起蛋白质的变化，而未发现有特殊类型的蛋白质。因而对于渗透胁迫是否会产
生特异蛋自还有异议。
3．5高渗下的一活性变化
豌豆胚轴，渗压剂为蔗糖或其它糖类时，均使口一淀粉酶活性下降25％～47％，烟草叶肉
原生质体，当蔗糖从0．2M升至0．7M或甘露醇从0．4M升至0．71vl,均使RNA酶活性务别提
高2．2倍和9．5倍。大麦叶片缺永，a一淀粉酶同乙酶谱由原来的 1条变为 2条带，且 活性 加
强。因此，高渗会引起植物体内某些酶恬性的改变。
3．B介质渗邂值和细胞的分裂、生长、分化
介质渗透值会影响细胞的分裂、生长和分化，蚕豆幼苗PEG6000 2O％处理，细胞分裂
指数始终比对照低5O 以上，而小麦胚16％的 PEG处理却有利于提高细胞分裂指数。一般
说来，细胞分裂的最适渗透值不等于细胞生长的最适浓度，如十 蕊 商 陆，在 蔗糖 浓度为
234mM时分裂最旺盛。在58mR{时，生长最旺盛 通常渗透值离有利于分裂，渗透值低有利
于生长。水稻成熟胚的愈伤组织，如果供给2 蔗糖，分化能力维持100天，如果 供 给2
蔗糖 +8 山梨醇，分化能力可维持1 500天。可见，渗透值对愈伤组织分化能力的维持作用
极大，豌豆幼叶愈伤组织以5 蔗糖浓度时细胞分裂好。因此，我们在原生质体培养时要根
据目标和材料选择合适的渗透值。
3．T介质渗遗值和胚眙发生
芥菜无菌苗的胚轴切段培养，蔗糖浓度为2 8、4 时，胚状体发生率分别为31 ，
9．1％和 0，小麦花药培养的胚状体发生，分别用0．175M蔗糖、麦芽糖、蜜二糖时，胚状体
发生率为5．25％、24 和0．5 ，向日葵幼胚培养胚状休发生，用12 的蔗糖，体细胞 胚 发
生，再转入低浓度蔗糖时，则胚状体成长并萌发。大麦花药培养产生的胚状 体，供 给 蜜 二
糖，可获大量的胚状体，并可获得绿苗。由此看来，胚胎发生的启动、成长和萌发随糖的种
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类、浓度及其变化而明冠不同。
4 原生质体的若干生理状况
4．1细胞璧的影响
细胞壁有很强的氧化还原能力。细胞壁上有很多过氧化物酶，可引起很强的氧化作用。
躁生质体出于细胞壁的丧失，致使某些有害物质不能降解，燕麦叶片原生质体，多胺氧化酶
活性99％存在于细胞壁中，去除细胞壁，多胺氧化酶缺失，会影响正常的多胺代谢平衡。又
如太白菜悬浮细胞与大白菜悬浮细胞的原生质体，用电击法外源导入，导入细胞的比例分别
为1O ，77 若用抑翱剂抑制原生质体的细胞壁再生，则也抑测原生质体的分裂 且由于
细胞壁的丧失，原生质体易受损伤，因此，必须十分注意原生质体的介质环境。
●．2递性 ·
由于细胞壁的去除，导致膜去极化，从而在离子吸收上产生差异。胡萝 原生质体外源
供给肌醇磷酸酯 20p．m，4mil内可使 Ga 减少l7 ，丽 10mixt后，又有 Ga ’的再吸收。
胡萝 悬浮培养细胞，脱壁后 K 的运输活性降低5O％，烟草叶肉细胞去壁前后，对 Rb吸
收相差1O倍。萤光显微技术也证实了细胞与原生质体对物质吸收的差异。胡萝 细胞 与 原
生质体，通过萤光吸收观察两者物质吸收情况发现，前者能进行内吞作用，后者作用很弱。
因此，原生质体对大分子物质的透性可能反而不如细胞。电穿孔可促进原生质体对太分子的
吸收也是旁证。因此，促进原生质体向环境中吸收可能提高原生质体再生频率。此外，细胞
壁存在与否，还会引起某些细胞器发育上的变化，水稻叶肉细胞的原生质体与叶 肉细 胞相
比，两者曲叶绿体结构上就存在某些差别。
4．3呼吸代谢与合成代谢
大麦幼苗分生组织的原生质体，ABA抑制线粒体吸收，丽这种抑制与Ca“、CaM存在
有关。用“a标记观察发现叶肉原生质体合成蔗糖的速率与来脱壁组织是相同的。矢车菊的
完整细胞与原生质体，用 P标记观察 RNA合成，发现在脱壁后 24hr内两者台成的 P0ly
(A)。RNA量有区别的。这说明，原生质体与完整细胞在代谢上或多或少存在某些差异。
4．4激素
原生质体和细胞对激素的吸收是不同的。油茶叶片原生质体与叶片切块相比，外源供给
ZAA 10mM，可促进质子外排，丽叶片切块则否。大麦叶肉细胞在高渗脱壁后，内源ABA
含量显著上升，作者指出，原生质体中ABA含量高是由于叶肉原生质体不能降解脱壁前叶
肉细胞所台成的ABA。 因此，细胞和原生质体的内源激素存在状况及其作用是有区别的
5 培养原生质体的细胞壁再生
细胞壁再生是原生质体分裂的前提条件，在愿生质体培养过程中，多数细胞能再生壁，
但不同材料复壁的滞缓期差异很大，蚕豆10rain就开始复壁，烟草 8—1O 复壁，水稻24hr
复壁，小麦则在6—18hT复壁。哪些因素会影响细胞壁的再生呢?
5．1影响细胞壁再生的因素
5．1．1接种密度 就烟草原生质体来说，培养细胞密度分别为 5×1O。，1．3×1O 和4~2×10 s
时，6天内细胞复壁率依次为26．3 、60。0 、38。6 。可见，要使细胞壁尽快恢复，需要
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一 个 台适的接种密度
5．1．2碳源 对于细胞壁 的再生，碳源供应是必要的，但不同的碳源效果不同，如供给相同
浓度的糖，供给蔗糖时复壁率为50．O％，而葡萄糖仅35．7％。因此，糖种类的选择是重要的。
5．1．3激素 烟草叶肉原生质体，单纯供给 2，4一D 2rag／1复壁率仅为0．8 ，供给 2，4一D
2rag／1+KT0．25rag／1，则复壁率可达95 ，因此，激素的适当配合是重要的。
5．2再生璧与正常璧的比较
长春花原生质体在悬浮培养条件下，再生壁成分与正常壁不问，壁中糖成分占优势的是
葡萄糖，如果在琼脂上培养，则再生壁与正常壁接近。表明物理环境对细胞壁多糖的沉积是
有影响的，这就提示我们在进行培养时，不仅要考虑蔗糖的种类、浓度、激素的供应，还要
考虑培养的物理环境。
6 原生质体复蹙后的细胞分裂
6．1滞曩期
胡萝 悬浮细胞的原生质体，第2天开始出现细胞分裂，油菜胚轴细胞的为 8— 5天，
而花生幼叶的则为1 5天。从老愈伤组织与幼愈伤组织分离的原生质体，其滞缓期也不同，因
此，制备原生质体时要注意选择合适的年龄、部位 以尽量缩短其滞缓期。
6．2细胞密度
原生质体要进行细胞分裂，必须要有合适的细胞密度，如烟草原生质体的合 适密 度 为
8—8 x 10‘。欧洲酸樱桃根的为2．5×10 ，野生马铃薯叶片的为 1—2 x 10 4，水稻愈伤组
织的为1O ，’ 般说来，双子叶植物原生质体接种密度低一些，单子叶要高一些。
6．3外擅体
细胞分裂频率还取决于外植体本身的生理状况。外植体的取材部位、年龄，是否脱分化
培养物等都是影响细胞分裂的重要因素，向日葵叶肉，胚轴，叶柄的原生质体中，以叶柄原
生质体分裂频率最高，叶肉原生质体分裂频率最低。又如 L peruvianum的 2— 8天叶和4—
5天叶分离的原生质体的分裂频率分别为11．8 和7．1 。烟草幼苗的原生质体，不同苗龄也
差异很大，大麦叶肉原生质体仅形成10个细胞的小细胞团，而愈伤组织分离的原生质体可形
成细胞群落，油菜茎与叶肉的原生质体培养3— 5天开始分裂，而由茎、时、愈伤组织分离
的原生质体24hr后就出现细胞分裂。因此，原生质体的来源是需要仔细考虑并经过筛选的。
6．4脱肇时辟的种类
脱壁时用的酶种类不仅影响脱壁效率，也影响培养效果。如 蕃 茄 叶 肉 细 胞 脱 壁，用
Meice]a~e P 代替 Drice]aso cellulysin植板率显著提高。因此，脱壁时酶的选择不仅考虑
原生质体得率还要顾及 以后的培养效率。
6．5无机盐
进行原生质体培养，必须选择合适的培养基，其中，总盐浓度及各种盐的适当搭配对愈
伤组织形成有重要影响，如茄子胚轴原生质体在 1／2M8基础上添加 NH NO。200mg／]培养
效果好，莴苣子叶原生质体在 z／2~s基础上添加 NH NO。80rag／1对培养有利。紫宛叶肉
原生质休 NH, 的存在不利。菊花子叶原生质体培养有NH 存在只能分裂3—4次，但善
茄原生质体培养，需供给NHtNO 5ram，才有利于培养。总的说来，原生质体培养中，无
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i 赵 颖 荨：植物原生质 体培养及响关生理基础 题
机盐供应，尤其是NH 的供应应予以仔细考虑。
6．6有机氯
为了满足细胞生长，分裂对氮的需求除无机氮外常常需要添加各种 有 机 氮，如 Arg，
Gly、CH、Glu、Gln等。如芦芦的原生质体培 养 不 供 给 Gin时 植 板 率 为 0．2 ，供给
1000raMGln时，植板率可提高到7．2 。向日葵胚轴的原生质体低密度培养时，用谷酰胺
作唯一氮源时效果好。
6．T棒酸类
供给桉苷可以提高植板率，蕃拍 味生质体培养 ，供给D一核酸有利于细胞分裂和植板率，
但有关核酸供应的文献还不多。
6．0多胺
添加多胺对原生质体的培养有时有 良好影响，如燕麦叶肉原生质体供给精胺与亚精胺可
衰老，供给亚精胺 lmM，细胞分裂频率可由 0．2 上升至2．2 。Pious子叶的原生质体供
给亚精胺40mM，可明显提高细胞分裂的百分频率。杏悬浮培养物的 原 生 质 体 供 给 腐 胺
0．05mM，可促使细胞分裂，供给精胺 1_一10mM，则30天才出现细胞分裂。桤术叶肉原 生
质体供给腐胺 0．05ram可促进细胞分裂和群落形成，供给亚精胺 0．025ram 微有促进作用，
提高浓度，则反而抑制，因此多胺的供应必须经过充分试验。
6．9碳源
培养基中糖的供应一方面起到碳源作用，另一方面又起刭渗压剂作用。不同的糖作用也
不同，最常见的是蔗糖和葡萄糖， 一般说来，作为渗压剂葡萄糖比蔗糖好，比较稳定，因为
蔗糖在细胞中会降解成单糖从而引起渗透值的上下波动。材料不同所用的糖的最适浓度也相
差很大。蕃茄叶肉原生质体培养供给蔗糖1．5 最好，因此，在原生质体培养时要注意糖浓度
的选择，一般说米，逐步降低糖浓度有利于原生质体形成愈伤组织，猕猴桃叶片愈伤组织的
原生贯体进行培养时逐步降低糖浓度才能形成愈伤组织，这表明糖浓度要求并非固定不变。
6．1D激素
在原生质体培养中，经常使用的激素是生长素和细胞分裂素。
6．1O．1 生长素 生长素主要是先进行分裂启动，并诱导持续分裂。烟草叶肉原生质体不供
给2．4一D细胞不能持续分裂。蕃茄叶肉原生质体供给 ZAA 0．5mg／i，2，4-D 1．0rag／1，BA
0．5mg／l的基础上用 8E培养基时，植板率为 25％，用 MS培养基时植板率仅2 ，可见无
机盐供应状况显著影响激素的效应。白菜原生质体供应 NAA，细胞生长快但形成的愈伤 组
织质地松软，供应 2，4一D O．5rag／1时愈伤组织质地致密。因此，不同的生长索还会影响愈
伤组织的质地 一般说来，单独供给一种生长素就可促进分裂，但要注意配合条件，如pH值
接种密度、培养基种类等等o
6．10．2 细胞分裂素 细胞分裂素的作用是影响生长、促进细胞分裂，抑制衰老。但单独供
给细胞劳裂素往往不能诱导细胞分裂。如紫羊茅的原生质体培养供给KT BA，玉米索都不
能诱导分裂，小Ⅱ 旱烟茎的愈伤组织的原生质体，单独供给KT不能诱导分裂，因此在分裂
启动时，2，4一D、ZAA是必要的，在此基础上添加细胞分裂素则有利，如马铃薯原生质体培养
时，添加 BA可得到较高植板率。但也有报告柑牿原生质体培养时供应 NAA或2，4-D时添加
KT0．1ing／1反而使植板率下降，因此，在原生质体培养过程中要注意激素的供应和搭配。几乎
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所有单子叶植物的原生质体培养开始时都有2．4-D，2，4一1)与细胞分裂素的组台是最常见的。
6．10．3 ABA 在原生质体培养过程中，细胞分裂困难的原因之一往往在于高渗下内源ABA
上升。在培养初期，细胞内源 ABA 较高，ABA 抑制了细胞分裂，但玉米悬浮培养物的原
生质体形成愈伤组织以后，加入 ABA 0．2mg／]，2，4一D 0．1mg／I，可提高愈伤组织质量，
有利于组织的胚胎发生。柱形苹果在质壁分离的高渗溶液处理时只有经过 0．]mM ABA 处
理的愈伤组织才能分化成苗，则 ABA 又对愈伤组级的分化起了重要作用。
6．11 维生素
一 般，B e的供应可能不利于细胞分裂，如蔷茄叶肉原生质体，去除B 可提高植板率，
肌醇的供给往往对培养有利，肌醇园与细胞壁形成有关而有利于分裂。龙葵叶肉原生质体不供
给肌醇时细胞不分裂，供给 250mg／]肌醇，则细胞分裂数明显增加。此外，善茄叶肉原生质
体在脱壁时供给肌醇，可H玎显提高原生质体植板率。
6．12 其它附加成分
在原生质体培养中，为了使原生质体保持稳定性，并能积极分裂，往往加入一些附加成
分，常见的有 DMSO，BSA、MES PVP等。DMSO能促进某些物质的积累，从而加速组
织形成。紫羊茅悬浮培养物的原生质体在培养基中添加 DMSO 2 可促进细胞分裂和愈伤
组织的形成。MES主要起稳定剂作用，葡萄叶片原生质体脱壁时，MES加入酶液中是必要
的，以维持 pH值 稳定，保护脱壁环境。此外 ，在原生质体培养中，常常会出现褐化现象，如
魔芋叶柄的原生质体加入 PVP，可防止褐化 在细胞脱壁以后， 随着培养的天数的增加，
往往 RNase酶活性异常升 高，导致原生质体解体死亡。加入 BSA， 可有效降低 KNaso酶
活性，从而保证原生质体的活力，如香石竹叶片愈伤组织原生质体，加入 BSA 0．1 可提
高原生质体活力。此外，还有活性炭、香豆素、葡聚糖、硫酸钾等物质的添加也可能耐培养
有利，要根据材料丽决定。
e．1a 环境因子
原生质体培养不仅受培养基的各种物质的影响，还受环境闳子的影响，其中渗透值不仅
影响原生质体的活力，还影响植板率。如烟草叶肉原生质体培养植板率为8 9‰ 添加甘露醇
则植板率可达99 。水稻愈伤组织的原生质体渗透值_剌形成群落是至关重要的。pH值的影响
也很大，水飞蓟愈伤组织的原生质体，pH值下降使群落的持续生长停止。pH值不仅影响细胞
的分裂和群落形成，还影响某些物质的运输，小麦叶肉原生质体，随 pH值 上升 而磷吸收下
降。此外，氧气的供应对培养效果影响也很大，一般采用振荡培养，以促进氧气溶解进入培
养基。棉花愈伤组织原生质体，转速为 40rpm时溶氧率最高。目前，经常采用 Ficoll漂浮
培养，使培养物漂浮在液面，扩大氧气的吸收面积，冬油菜原生质体用 2~Fieoll漂 浮 培
养时，分裂频率最好。也有的采用薄层培养，目的之一是扩大气体交换。此外，温度和光照
也是重要的环境因子，应根据不同材料，不同器官进行试验。
综上所述，原生质体复壁后能否进行分裂，及能否进行持续分裂是原生质体培养的首要
关键，禾谷类 叶肉原生质体培养至今不能再生植株的关键在于细胞不能持续分裂，因此，在
进行原生质体培养时，参考有关文献提供的线索时，要充分考虑各种因素的影响，力求为原
生质体复壁后细胞持续分裂、生长提供最佳条件。
(参考文献略 )
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