全 文 ： cf，
广 西 植 物 Gnihaia 1d(3)：舶0—26 d．199g
愈伤组织继代接种量、继代周期和年龄
对软紫草原生质体脱壁的影响
— 塾 张治国
(斯讧省医学科学院，杭州 310013)
?’
摘要 本文的实验结果表明：软紫草愈伤组织脱壁所需的适宜酶浓度为：0．1 果胶酶+0．25 纤
维素酶；酶解处理的适宜时间与愈伤组织年龄有关；愈伤组织的适宜年龄随其继代周 期、愈 伤 姐 ，
纲继代接种量而有变化。当接种量．1克／瓶，转代后 7天进行原生质体分离；接种量3克／瓶．
酶解材料则以培养 5天愈防组织为宜。继代周期13天和l5天的比l5天和15天的，适宜脱壁的 农伤
组织当代培养天数要提前 1天
关键词 软萦草；愈伤组织；原生质体；脱壁；年龄；继代周期 ’
EFFECTS OF SUBCULTURE INOCULUM QUANTITY，
SUBCULTURE TIME AND AGE OF CALLUS
0N PR0T0PLAST ISOLATION OF
ARNEBIA EUCHROMA
W ang Li avd Zhang Zhiguo
(Zhejlang Academy of Medical Sclences，Hangz~os 310013)
W ang Ping and Liang Haiman
(Department of Biology，H~ngzhou University)
Ab st ract The result showed： 0．1 Pectinase+0．25 Onozuka R一10 was of benefit to
isolate calli of ．euchromo；the approriate time of enzyme treatment WaS related to
callus age． Callus age would vary if either subculture time or ea llua inocnlnm quan—
tity was changed．The experiment material of isolating protoplast was 7-day callus
when inoculum quantity was 1 g／flaskI but 5-day callus when inoculum quantity was
3 g／flask．As the suitable material of enzyme treatment，callus of 15一day and 15一day
subculture period m ight be cultured a little ionger than that of 13一day and 15 day
subculture period．
Key words Arnebla enchroma；callus ：protoplast isolation；Age；Subculture time
在植物细胞大量培养生产次生代谢产物中，筛选高产细胞株和建立合理的培养程序、培
-浙江省科委重点课题
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3期 芏黎等：愈惦组织继代接种量、继代周期和年龄对软紫草原生质体脱壁的彩响 2e1
养条件是两个极为重要的方面。Fujita等 ¨报
告，通过原生质体培养从紫草细胞悬 浮培 养 物
中，筛选出15个高产细胞系。因此，原生质体培
养能为紫草单细胞筛选提供了有效的途径。我们
通过愈伤组织进行紫草细胞株筛选时效率不高，
为此开展紫草的顾生质体培养以期提 高细胞 株
筛选率效。由于紫草原生 质 体培 养 的报 告不
多 ““]，且均为悬浮细胞脱壁。鉴于不同 材 料
的脱壁条件不尽相同，我们就软紫草愈伤组织继
代接种量、继代周期、年龄、酶液组成、酶解时
间等对原生质体得率的影响进行了研究，现将结
果报道如下。
l 材料和方法
1．1 实验材料
供试材料为继代培养多年的软紫草(Arnebia
eUchroma)根愈伤组织。
1．2 禽伤组飙培养
根愈伤组织继代培养于 Ls附加 O．5mg／L
IAA，1 mg／L KT, 3 蔗糖，0．8％ 琼脂培养
其中，25±1℃，暗培养。继代周期1 3或15天。
1．8 原生质体分离和培养
0．1％，0．25 果胶酶(Pectinase)和0．05 ，
0．1 ，0．25 的纤维素酶 (Onozuka R一1 0)
按不同组台溶于5 mI介质(Ls基本培养基加 3％
蔗糖，0．5M甘露醇，PII5．8)，过滤灭菌。1克
鲜重愈伤组织，经切碎后置于混合酶液中，25℃
条件下处理 2-I 2小时。分离的原生质体按常规
方法收集 原生质体在25±1℃黑暗条件下浅层
液体培养。24小时后，统计存活率，并用0．01
FDA染色观察复壁情况。
2 实验结果
2．1 醇浓度对原生质体傅串的影响
按不同酶浓度组合，将愈伤组织 酶 解4 h，
慢集原生质体。荧光增自剂染色、镜检表明，圆
球形细胞即为已脱壁的原生质体。用血球板计数
显示(表1)，在不同酶浓度组合中以0．1 果
I ’
图1 酶解时间对原生质体得率的影响
(盘捞组织为 7天龄 )
Fig．1 Effects of time of enzyme
treatment on protoplaat yield of
． c^ro坩口 (Callus age,7 days)
⋯ 一 · 0．1 P ~cti~as~+O．25
Onoznka R·10
×一 x一 × O．1 Pectlnas~+0．25
OBOznkB R一1O+P~otectlve
additive
△一 △一 A 0．25 Pecti~as~+O．1
Onozuka R·10
▲一 ▲一 ▲ O．25 Pectinase+0．1
Onozldka R一1O+Protective
additive
Protectlye additlve I BSA
A$C0rbic acid．Glatathloae
表1不同酶浓度组台对原生质体得率的影响
Table 1 Effects of different comblna—
tion of enzyme concent ration on
grstogM st yield of ．e¨ chro打td
愈伤组织年龄； g天
CslIns age I 9 d j
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广 西 植 物 14卷
图 2 酶解时间对原生质体得率
的影响
(]敷伤组织为 5天龄 )
Fig． 2．Effects of time of
enzym e treatm ent on protoplast
yield of ． euchroma．
(Callus age：5 da”)
胶酶加0．25 纤维素酶，0．25
果胶酶加O．1 纤维素酶具 有 相
对较高的原生质体得率，分别为
3．1×10 个／克鲜重及2．3×10
个／克鲜重。为了了解 单 独使
用果胶酶，能否获得密度 较 高
的游离细胞悬液，进行了果胶酶
离析愈伤组织试验。结果如表2
所示，果胶酶处理下的单细胞得
率为0．08×10 个／克 鲜 重，仅
为对照组 (O．042×10 个／克鲜
重 )的一倍，而从标准误差看，
两者差异不显著。因此，不进行
细胞脱壁，从紫草愈伤组织难以
获得高密度单细胞悬液。
2．2膏解时阃对原生质体得宰的
影响
从图 1可以看出，酶解处理
时间长短显著影响原生 质 体 得
率。值得注意的是不同组合的酶
液的最适处理时问均为 8小时左
右，即使在酶液中添加有小牛血
表2 果胶酶对愈伤组织分离单
细胞的影响
Table 2 Effects of Pectinase
on isolating single cell from
callus of ．e~chromG
果 胶 尊 单鲴胞得率
Pectlnase Single cell yleld
(蛳 x10‘ W ‘。
0．080±0．046
0．042±0．023
愈捞糖织年膏争· 0灭
Callas age：9 days
表3 接种量为19克／瓶时，愈伤组织年龄对愿生质体得率的影响
Table．3． Effects of callus age on protoplast yield
Of ．e~ohroma when inoculum quantity
was 1 g／flask
0．1 Pectlnase+0．25
OZIOZnkB R一10
0．1％ Pectlnase+0．25
OZIOZuka R-10 4-
Prolectlve additlve
继代周期t 15天
Subculture time：15 days
表4 愈伤组缎年龄对原生质体存活率影响
Table 4． Effects of callus age on protoplast
survival of ．euc~roma
原生质体存话率
酶 组 合 Percentage of protoplast survival
Enzyme comblnstlon ( )
愈伤组织培养时间
Call~s cultare time fdays)
4d 5d 6d
愈伤组织继心届期l 15天 Subculture tlme}15 days
i
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3期 主 黎等：愈伤组织继代接种量、继代周期和年龄对软紫草曩生质体脱壁的蟛响 26§
1 I
图3 接种量为3克／瓶时，愈伤组织年龄
对原生质体得率的影响
(继代周期·l5 )
Fig． 3． Effects of callus age OU
protoplast yield of ．euchroma when
inoculum quantity was 3 g／flask．
(SubcuIture time： 15 days)
清白蛋白、维生素C和谷脱甘肽作为保护剂时亦如
此。这一结果表明在紫草根愈伤组织的原生质体脱
擘进程是相对稳定的。本实验中没能获得保护剂提
高原生质休得率的结果，可能是由于剂量不适所致。
考虑蓟愈伤组织年龄可能会影响酶解进程，在
图4 继代周期不同的愈伤组织年龄对原
生臻体得率的影响
(⋯ 一 ·翦二次鳢代周期依次为l3天
和15天J▲ —一▲ —一▲前二次继代周期为15
天和I5天l接种量a克／瓶 )
Fig．4． Effects of callus age with
different subculture tlme 011 protO-
plast yleld of ．euchroma
，·⋯ ·Ccnsecutice times sub-
culture time were 13 and 15 days．
▲ 一一▲ 一 ▲ Consecutive 2 times
subcuI!nfe tin!e efe 15 and 15 days．
1uoculum quantity was 3 g／IIast-)
上一实验基础上，又取5天龄的愈伤组织进行酶解实验 (图2)，结果5天龄愈伤组织的酶
解适宜时间延长为1O小时左右，这一事实表明酶解适宜时间还随愈伤组织的年龄而异，提示
了进行原生质休培养时，不宜随意变动供体材料的培养天数。本实验事实还提示了应该重视
愈伤组织年龄和原生质体得率问的关系。
2．0愈佑组织年龄和愈佑组织缝代臻种量对恿生质体得率趵影响
当代愈伤组织培养天数和愈伤组织继代接种量均显著影响原生质体得率。当继代周期为
15天，接种量为l克／瓶时，在 5— 9龄的愈伤组织中，原生质体得率以7天龄的最高 (见
表8)。当继代周期仍为15天而接种量为 3克／瓶时，则在2— 7天龄的愈伤组织中，以6
天龄的材料原生质体得率最高，且含液泡的原生质体的百分率也较低 (图8)。
2．4缝代周期对童佑组织分离屎生质体趵影响
从图4可以看出，接种量均为8克／瓶，而前二代愈伤组织的继代周期依次为13天和15
天的，在 8—6夭龄的愈伤愈伤组织材料中，原生质体得率还以4天龄左右为宜，可比继代
周期15天和15天的提前一天。
2．5愈佑组织年糖对恿生质体的存活率，复壁率的影响
从4— 6天龄愈伤组织分离的原生质体，进入培养24小时后，观察并计算其存活率 (见
表4)。结果表明，5天龄的原生质体存活率最高。原生质体24h存活率最高的愈伤组织年
龄和适宜酶解的愈伤组织年龄是一致的。实验结果还显示加入保护剂虽然不能明显提高原生
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糖
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广 西 植 物 id卷
质体得率但可明显提高原生质体24h的存活率，由71 提高到9s％。可以在原生质体培养中
添加适宜的保护剂还是必要的。
3 讨 论
Akiyama等[2 指出细胞对果胶酶，纤维素酶的敏感性随培养基的氮源组成和浓度，随
细胞的同步化程度而异。Fukunsga和King 报告，细胞生长很好的悬浮培养物，原生质
体得率反而较低。这些报告表明营养状况和细胞增长时期会明显影 响原 生质 体 释 出量。
Toriyama和 Hinat~ 报告，水稻细胞悬浮培养物，继代周期14天，转代后4— 7天期间
进行原生质体分离。赵桂兰” 报告，红豆草悬浮细胞培养物，继代周期 7天，转 代 后8天
进行原生质体分离。Wang等” 报告，籼稻悬浮培养物，继代周期5— 7天，转代后2一＆
天进行原生质体分离。Gill和Eapen_j 报告，乌头叶菜豆愈伤组织脱壁的适宜年龄为4— 5
天。以上报告提示：适宜于进行原生质体脱壁的悬浮培养物的培养天数与继代周期的天数有
关。看来适宜于脱壁的是处于指数增长期上半期的悬浮培养物。本文实验结果显示，当代7
天龄的愈伤组织较 9天龄的易于脱壁。继代周期13天和15天的比15天和15天的，适宜脱壁的
愈伤组织当代培养天数要减少1天。培养当代的愈伤组织接种量也会显著影响适宜脱壁的当
代愈伤组织年龄，接种量大的，用于脱壁的愈伤组织年龄应小些。这些结果表明继代培养物
的生长状况显著影响原生质体脱壁效率。进入指数增长期不久的愈伤组织有较好的原生质体
得率。镜检表明。原生质休得率高的，具大液泡原生质休 明显较低。愈伤组织年龄适宜时
所分离的原生质体体积较小，质浓、液泡小。这些观察所得与上述结果是一致的。本文实验
结果与上述BI文也是一致的。因此，在从软紫草 A．e~fchromfl愈伤组织分离原生质体时应
注意筛选出适宜的继代周期天数、当代培养天数和适宜的接种量，而且，一经确定后，还应
保持以上诸参数的稳定才能获得较高、稳定的原生质体得率。
参 考 文 献
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8 Toriyama K．Hinata K．ceII suspension and protoplast culture in rice． Plant Sci．．1993．41门)I
1聃 一 l83
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