全 文 ：中国农业科学 2008,41(12):4164-4172
Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2008.12.029

收稿日期：2007-11-13；接受日期：2008-06-30
基金项目：国家自然科学基金资助项目（39860048）；贵州省自然科学基金资助项目（黔科合 J 字[2005]2033 号）
作者简介：郑道君（1979－），男，海南海口人，硕士，研究方向为植物种质资源。Tel：13648655228；E-mail：daojunzh@yahoo.com.cn。通讯作者
刘国民（1955－），男，湖南祁东人，教授，博士，研究方向为植物种质资源与植物组织培养。Tel：0898-66276711；E-mail：kudingcha_no1
@yahoo.com.cn


木犀科苦丁茶种质资源的 RAPD 分析
郑道君 1,2，梁远发 3，刘国民 1,2，鄢东海 3，令狐昌弟 3，田永辉 3
（1 海南大学热带生物资源教育部重点实验室，海口 570228；2 海南大学苦丁茶研究所，海口 570228；3 贵州省茶叶科学研究所，贵州湄潭 564100）

摘要：【目的】从分子水平上揭示木犀科苦丁茶植物物种间的遗传差异、亲缘关系，为木犀科苦丁茶的物种
分类、鉴定和遗传育种提供依据。【方法】利用 RAPD 分子标记技术对木犀科苦丁茶 8 个物种，包括粗壮女贞
[Ligustrum robustum（Roxb.）Blume]、丽叶女贞（L.henryi Hemsl.）、日本女贞（L.japonicum Thunb.）、日本
毛女贞（L.japonicum Thunb. var. pubscens Koidz）、女贞（L.lucidum Ait.）、序梗女贞（L.pedunculare Rehd）、
牛矢果（Osmanthus masumuranus Hayata）和川滇蜡树（L.delavayanm Hariot），共 21 份种质材料进行亲缘关系
和遗传多样性分析，计算不同种质材料间的 Jaccard 遗传相似性系数，并采用 UPGMA 方法进行聚类分析。【结果】
20 个引物共获得 427 条谱带，多态性百分率（PPB）为 97.7%，个体间遗传相似系数在 0.1522～0.8322，平均遗
传相似系数为 0.5466，木犀科苦丁茶各物种间存在着较大的遗传差异；基于 RAPD 遗传相似系数的 UPGMA 聚类分
析图可把供试材料完全分开并表明它们之间的亲缘关系。【结论】RAPD 分子标记技术可有效地应用于木犀科苦丁
茶种质资源的遗传多样性分析、亲缘关系及分类地位研究；日本毛女贞与序梗女贞的亲缘关系在所有的供试物种
中最近，而与日本女贞的关系较远。作者据此认为，日本毛女贞是否应该划分为日本女贞种下一变种或是可以独
立划分为一个种的问题尚需进一步研究；RAPD 的分析结果支持紫茎女贞（L.pururascens Y.C.Yang）归并为粗壮
女贞。
关键词：木犀科；苦丁茶；种质资源；亲缘关系；遗传多样性；RAPD

RAPD Analysis of Germplasm Resources of Kudingcha in Oleaceae
ZHENG Dao-jun1,2, LIANG Yuan-fa3, LIU Guo-min1,2, YAN Dong-hai3, LINGHU Chang-di3, TIAN Yong-hui3
(1Key Laboratory of Tropical Biological Researches, Ministry of Education, Hainan University, Haikou 570228; 2Kudingcha
Research Institute of Hainan University, Haikou 570228; 3Tea Research Institute of Guizhou Province, Meitan 564100, Guizhou)

Abstract: 【Objective】The genetic difference and relationship among germplasm resources of Kudingcha in Oleaceae were
revealed at molecular levels on this study, which could be considered as the significant reference bases for the classification and
identification and breeding of Kudingcha species in Oleaceae.【Method】The random amplified polymorphic DNA marker(RAPD)
was applied to detect the genetic relationships and diversity among 21 germplasm materials of Kudingcha in Oleaceae, which
involved in 8 species, i.e. Ligustrum robustum (Roxb.) Blume, L. henryi Hemsl., L. japonicum Thunb., L. japonicum Thunb. var.
pubscens Koidz, L. lucidum Ait., L. pedunculare Rehd, Osmanthus masumuranus Hayata, L. delavayanm Hariot. The Jaccard
similarity coefficient of 21 germplasm materials was calculated, and the UPGMA was used for cluster analysis.【Result】20 RAPD
primers selected were applied for the amplification on the 21 germplasm materials mentioned above. 427 bands were obtained, and
the percentage of polymorphic bands (PPB) was 97.7%. The genetic similarity coefficients (GS) ranged from 0.1522 to 0.8322 with
an average of 0.5466. There were significant genetic difference among germplasm materials of Kudingcha species in Oleaceae, and
UPGMA cluster based on GS of RAPD could distinguish all test germplasm materials clearly and indicated relationship of 8 species
mentioned above. 【Conclusion】RAPD markers could be used for the studies of genetic diversity and relationship and classification
of germplasm resources of Kudingcha in Oleaceae. Analysis results of RAPD showed that L. japonicum Thunb. var. pubscens
12 期 郑道君等：木犀科苦丁茶种质资源的 RAPD 分析 4165
Koidz has closer genetic relationship with L. pedunculare Rehd and further genetic relationship with L. japonicum Thunb. among all
tested species. The authors suggested that the further research be needed to study whether L. japonicum Thunb. var. pubscens Koidz
should be classified into a variata of L. japonicum Thunb., or considered as an independent species. The analysis results supported
that L. pururascens Y. C. Yang should be combined into L. robustum (Roxb.) Blume.
Key words: Oleaceae; Kudingcha; Germplasm resources; Relationship; Genetic diversity; RAPD

0 引言
【研究意义】“苦丁茶”是中国民间传统代茶饮
料的一大类植物的统称，其植物来源较为复杂，目前
在不同地区被称为“苦丁茶”的原植物涉及到至少 12
个科的 30 余个物种 [1]，此即所谓异物同名现象
（homonym）。其中开发利用较多并形成商品生产规
模的主要有冬青科冬青属苦丁茶和木犀科女贞属苦丁
茶两大类。在木犀科植物中，有 9 个物种在不同文献、
不同地域或不同民族中被称之为“苦丁茶”[1]，这些
物种主要包括女贞属的粗壮女贞[Ligustrum robustum
（Roxb.）Blume]、丽叶女贞（又名兴山蜡树，L. henryi
Hemsl.）、日本女贞（L. japonicum Thunb.）、日本毛
女贞（L. japonicum Thunb. var. pubscens Koidz）、女
贞（L. lucidum Ait.）、序梗女贞（L. pedunculare Rehd）、
光萼小蜡[L. sinense Lour. var. myrianthus（Diels）Hook.
f.]和宜昌女贞（L. strongylophyllum Hemsl.）以及木犀
属的牛矢果（Osmanthus masumuranus Hayata）。此外，
近年还有报道，李氏女贞（L. lianum Ham.）和川滇蜡
树（L. delavayanm Hariot）在贵州省务川、余庆等局
部地区作为苦丁茶使用[2]。由此可见，中国木犀科苦
丁茶种类繁多，异物同名现象非常普遍。由于各地推
崇的木犀科苦丁茶不尽相同，上述情况已在种子、种
苗或代茶产品的流通过程中造成诸多不便，而且在文
献引用、原植物认定、种植规划以及新产品研发等方
面给人们带来不少麻烦，有时甚至导致了法律纠纷。
关于木犀科苦丁茶主要种类的分类地位问题，《云南
植物志》（第 4 卷）认为是紫茎女贞（L. purpurascens
Y. C. Yang），并将紫茎女贞与粗壮女贞作为两个不
同的分种分别予以描述[3]，而《中国植物志》（第 61
卷）则将紫茎女贞归并于粗壮女贞条目之下[4]；众多
学者在介绍木犀科苦丁茶时，仍将紫茎女贞作为一个
独立的物种与粗壮女贞分别加以介绍[2,5-9]。通过在分子
水平上分析木犀科苦丁茶种质资源亲缘关系和遗传多
样性，可以解决异物同名和同物异名现象造成的诸多
不便，为木犀科苦丁茶的物种分类、种质资源保存和
遗传育种等提供重要的科学依据，这对于木犀科苦丁
茶种质资源的有效和可持续利用以及整个苦丁茶产业
的发展均具有重要意义。【前人研究进展】近年来，
在中国苦丁茶种质资源的研究方面，已有诸多学者从
形态学、同工酶水平及 DNA 分子水平对冬青属（Ilex）
苦丁茶种质资源进行了较为系统的研究。刘国民等[10]
通过对 200 余份从各个省区和居群中引种并定植于海
南大学苦丁茶种质资源库中的苦丁茶冬青种质材料的
茎叶进行了一次系统的形态学研究，揭示了苦丁茶冬
青（I. kudingcha C. J. Tseng）不同种质材料在茎叶形
态上的一些共同特征和变异规律，并发现了若干份介
于苦丁茶冬青和五棱冬青（I. pentagona S. K. Chen，
Y. X. Feng et C. F. Liang）之间的中间型种质材料，认
为它们很可能是苦丁茶冬青和五棱冬青天然的种间杂
交后代；同时还认为不同苦丁茶冬青种质材料在毛被
方面的形态学差异（毛被的有无与稀密）不宜将其作
为新种划分或种下划分之惟一的或至关重要的分类学
依据。史学群等[11]的研究结果初步显示，过氧化物酶
同工酶和酯酶同工酶之酶谱分析结果可以作为判断冬
青属苦丁茶种质材料的起源地域、遗传差异、亲缘关
系以及种级水平分类鉴定的参考依据之一。而付乾堂
等[12]经研究后认为过氧化物酶同工酶的酶谱分析结
果可以作为判定不同物种间的亲缘关系及冬青属苦丁
茶种级水平分类的依据之一，但同一物种内不同种质
材料的遗传差异以及种下分类群的划分则尚需更多分
子生物学及形态学研究结果相互佐证。张凤琴等[13]则
在 DNA 分子水平上利用 RAPD 技术探讨了冬青属苦
丁茶的遗传差异、亲缘关系与分类地位。分析结果表
明，RAPD 分析中的聚类结果与形态差异的观察结果
完全吻合，可把 22 份供试冬青属苦丁茶材料分成 4
类 5 组，第Ⅰ类为 I. pentagona（分为 A、B 两组：A
组为新变种 var. mashanensis G. M. L.；B 组为原变种
var. pentagona），第Ⅱ类为 I. kudingcha，第Ⅲ类为 I.
Latifolia，第Ⅳ类为 I. Cornuta；第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ这 3 类
各有一组材料组成；结果还表明同一种物种内不同种
质材料的起源地域也可以清晰地从系统树图中反映出
来。目前，对于木犀科苦丁茶种质资源的研究则仅停
留在经典形态分类学角度的原植物鉴定及资源调查等
4166 中 国 农 业 科 学 41 卷
方面。王世清等[2,5]对贵州苦丁茶品种文献资料考证、
原植物的鉴定、资源调查、蜡叶标本查阅和市场商品
鉴别的结果表明，贵州苦丁茶主流品种应为木犀科女
贞属植物粗壮女贞的叶；贵州省余庆县作苦丁茶收购
的木犀女贞属植物还有李氏女贞和川滇蜡树；张灿坤[14]
经调查及资料研究后认为，木犀科女贞属有 5 种植物
在西南地区称为苦丁茶广泛使用并形成商品，即紫茎
女贞、兴山蜡树、女贞、日本毛女贞和序梗女贞，其
中序梗女贞和日本毛女贞分别只在四川和贵州作苦丁
茶使用；杨远庆等[15]对贵州苦丁茶的资源状况、植物
学特征、生态环境等进行了调查和研究，认定贵州苦
丁茶其原植物为粗壮女贞。
分子标记技术目前已发展出多种成熟的方法，其
中 随 机 扩 增 多 态 性 DNA （ random amplified
polymorphic DNA，RAPD）分子标记技术因其具有快
速简便、试验成本低廉以及准确性较高等优点而被许
多学者作为优选的方法加以采用，广泛应用于植物种
质资源遗传多样性的检测、种质与品种鉴定、种间关
系的确定和种下划分等分类学问题的研究[16-23]。【本
研究切入点】目前文献报道的木犀科苦丁茶均是从经
典形态分类学角度描述，而通过分子标记技术对木犀
科苦丁茶种质资源的亲缘关系和遗传多样性所进行的
研究此前未见报道。【拟解决的关键问题】本研究拟
利用RAPD 技术揭示木犀科苦丁茶植物物种间的遗传
差异、亲缘关系，旨在分类鉴定西南地区各省（区）
分布和开发的木犀科苦丁茶种类，解决木犀科苦丁茶
原植物种名的争议，并验证紫茎女贞归并于粗壮女贞
的合理性，为木犀科苦丁茶的物种分类和遗传育种提
供重要的科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
从海南大学苦丁茶种质资源圃中定植的木犀科苦
丁茶8个物种共21份种质材料上取功能叶或嫩芽作为
本研究的供试材料，各份种质材料的种名、编号和采
集地如表 1 所示。

表 1 用于 RAPD 分析的 21 份木犀科苦丁茶种质材料及来源
Table 1 21 germplasm materials and their origins of Kudingcha species in Oleaceae used for RAPD
材料编号 Codes 种名 Species 采集地 Origins
CD-01 川滇小蜡 Ligustrum delavayanm Hariot. 贵州务川 Wuchuan, Guizhou
CD-02 川滇小蜡 L. delavayanm Hariot. 贵州务川 Wuchuan, Guizhou
CD-03 川滇小蜡 L. delavayanm Hariot. 贵州务川 Wuchuan, Guizhou
RM 日本毛女贞 L. japonicum Thunb. var. pubscens Koidz 贵州务川 Wuchuan, Guizhou
RB 日本女贞 L. japonicum Thunb. 湖南衡阳 Hengyang, Hunan
XG 序梗女贞 L. pedunculare Rehd 贵州荔波 Libo, Guizhou
LY 丽叶女贞 L. henryi Hemsl. 云南丽江 Lijiang, Yunnan
NS 牛矢果 Osmanthus masumuranus Hayata 海南尖峰岭 Jianfeng Mountain, Hainan
CZ-047 粗壮女贞 L. robustum (Roxb.) Blume 贵州余庆 Yuxing, Guizhou
CZ-058 粗壮女贞 L. robustum (Roxb.) Blume 贵州台江 Taijiang, Guizhou
CZ-068 粗壮女贞(或紫茎女贞) L. robustum (Roxb.) Blume(=L. pururascens Y. C. Yang) 四川屏山 Pingshan, Sichuan
CZ-069 粗壮女贞 L. robustum (Roxb.) Blume 四川叙永 Xuyong, Sichuan
CZ-070 粗壮女贞 L. robustum (Roxb.) Blume 云南会泽 Huizhe, Yunnan
CZ-072 粗壮女贞 L. robustum (Roxb.) Blume 云南盐津 Yanjin, Yunnan
NZ-11 女贞 L. lucidum Ait. 贵州植物园 Arboretum of Guizhou
NZ-13 女贞 L. lucidum Ait. 湖南祁东 Qidong, Hunan
NZ-22 女贞 L. lucidum Ait. 贵州湄潭 Meitan, Guizhou
NZ-23 女贞 L. lucidum Ait. 贵州台江 Taijiang, Guizhou
NZ-27 女贞 L. lucidum Ait. 贵州扎佑 Zhayou, Guizhou
NZ-35 女贞 L. lucidum Ait. 云南西畴 Xichou, Yunnan
NZ-36 女贞 L. lucidum Ait. 江西南昌 Nanchang, Jiangxi
12 期 郑道君等：木犀科苦丁茶种质资源的 RAPD 分析 4167
1.2 试剂与仪器
1.2.1 试剂 CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）、Tris
（三氯氨基甲烷）、EDTA（乙二胺四乙酸）均购自
广州威佳科技有限公司；Operon 引物系列随机引物购
自北京鼎国生物技术有限责任公司；3 S 100 bp DNA
ladder，Taq DNA polymerase 和 4×dNTP mix 购自上
海申能博彩生物科技有限公司。
1.2.2 仪器 离心机，电热恒温水浴锅，电冰箱，移
液枪，紫外分光光度计，icyclerTM Thermal Cycler 型
PCR 仪，水平电泳槽，Gel Doc XR 型凝胶成像系统等。
1.3 方法
1.3.1 总 DNA 的提取 总 DNA 的提取按照梁远发
等[24]的方法进行。用 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测所提
DNA 的完整性；稀释 100 倍，用紫外分光光度计测定
230、260 和 280 nm 处的吸光度，即 OD 值，计算所
提 DNA 的浓度及估测 DNA 的纯度。
1.3.2 PCR 扩增反应 反应在 icyclerTM Thermal
Cycler 型 PCR 仪上进行。采用优化后的 RAPD 反应体
系和扩增程序[25]，即：25 µl 反应体系中 10×buffer 2.5
µl，Mg2+浓度为 2.5 mmol·L-1，dNTPs 浓度为 200
µmol·L-1，Taq 酶用量为 2.0 U，引物浓度为 10 pmol，
模板浓度为 80 ng。RAPD-PCR 扩增程序为：94 ℃预
变性 4 min，然后按 94℃变性 30 s，37℃退火 45 s，72℃
延伸 120 s，进行 40 个循环，最后 72℃延伸 10 min。
每个引物对21份木犀科苦丁茶种质材料重复扩增2次。
1.3.3 扩增产物的检测 取 10 µl 扩增产物，用 1.4%
琼脂糖凝胶电泳检测，EB 染色，在 Gel Doc XR 型凝
胶成像分析系统下照相并记录。以 3 S 100 bp DNA
ladder 作为对照分子量标准。
1.3.4 PCR 扩增谱带的统计和分析 将电泳图谱上
清晰且可重复出现的条带记为“1”，同一位置没有条
带记为“0”。由此生成 0 和 1 原始矩阵，统计每个引
物扩增出的总带数和其中的多态性带数，计算多态性
带百分率（percentage of polymorphic bands，PPB），
PPB =多态位点数/位点总数。用 NTSYS-PC（2.02j）
软件中的 SIMQUAL 程序计算 Jaccard 遗传相似性系
数（genetic similarity，GS），并获得遗传相似系数矩
阵。计算公式：GSij=2Nij/（Ni+Nj），式中 Nij 指两个
个体间共有的带数，Ni+Nj指两个个体所有带数之和。
用 NTSYS-PC（2.02j）软件中的 SAHN 程序和 UPGMA
（unweighted pair group mean average）方法进行聚类
分析，并通过 Tree plot 模块生成系统树图。
2 结果与分析
2.1 引物筛选结果及 RAPD 多态性分析
在供试的木犀科苦丁茶 8 个物种中各选一份材
料，对所选购的 50 个 Operon 引物系列随机引物进行
筛选。共筛选出 20 个多态性好的有效引物，其编号和
序列见表 2。这 20 个引物在木犀科苦丁茶 8 个物种共
21 份种质材料中共扩增出 427 条谱带，其中 417 条为
多态性带，PPB 为 97.7%，平均每个引物产生 21.4 条
带和 20.9 条多态性带（表 3）。除木犀属苦丁茶牛矢
果（1 份材料）以外，上述 20 个引物在女贞属苦丁茶
7 个物种共 20 份种质材料中共扩增出 381 条谱带，其
中 356 条为多态性带，PPB 为 93.4%。不同引物扩增
的总带数和多态性带数差异较大，扩增条带数最多的
引物为OPA8，为32条；扩增条带最少的引物为OPB5，
为 12 条。部分引物的扩增结果见图 1 和图 2。

表 2 所筛选出的 20 个 RAPD 引物及其序列
Table 2 The 20 selected RAPD primers along with their sequence
引物编号 Primers 序列(5′ to3′) Sequence(5′ to 3′) 引物编号 Primers 序列(5′ to 3′) Sequence(5′ to 3′)
OPA8 GTGACGTAGG OPD5 TGAGCGGACA
OPA11 CAATCGCCGT OPF1 ACGGATCCTG
OPA13 CAGCACCCAC OPF2 GAGGATCCCT
OPA15 TTCCGAACCC OPF4 GGTGATCAGG
OPB5 TGCGCCCTTC OPF6 GGGAATTCGG
OPB6 TGCTCTGCCC OPF10 GGAAGCTTGG
OPB7 GGTGACGCAG OPG17 ACGACCGACA
OPB10 CTGCTGGGAC OPH3 AGACGTCCAC
OPB11 GTAGACCCGT OPH9 GAAACACCCC
OPB20 GGACCCTTAC OPH5 AGTCGTCCCC
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表 3 20 个 RAPD 随机引物在 21 份木犀科苦丁茶种质材料上的扩增结果
Table 3 20 RAPD primers and their results in 21 germlasm materials from Kudingcha species in Oleaceae
所有供试材料的扩增结果 The results for All materials 所有供试女贞属苦丁茶材料扩增结果 The results for materials in Ligustrum引物
Primers 总带数 Total bands 多态性带 Polymorphic bands PPB (%) 总带数 Total bands 多态性带 Polymorphic bands PPB (%)
OPA8 32 32 100 29 29 100
OPA11 30 30 100 28 28 100
OPA13 25 25 100 23 20 87.0
OPA15 20 18 90.0 20 17 85.0
OPB5 12 11 91.7 5 2 40.0
OPB6 13 13 100 9 7 77.8
OPB7 23 23 100 21 18 85.7
OPB10 20 20 100 18 18 100
OPB11 19 19 100 19 19 100
OPB20 22 21 95.5 19 18 94.7
OPD5 19 19 100 19 19 100
OPF1 25 25 100 24 23 95.8
OPF2 30 30 100 28 27 96.4
OPF4 23 23 100 18 16 88.9
OPF6 28 27 96.4 26 25 96.2
OPF10 18 15 83.3 16 13 81.3
OPG17 16 16 100 14 14 100
OPH3 17 17 100 14 14 100
OPH5 16 16 100 15 15 100
OPH9 19 17 89.5 16 14 87.5
总计 Total 427 417 97.7 381 356 93.4



图 1 引物 OPB7 的扩增结果
Fig. 1 The amplified result of primer OPB7

不同引物扩增出的谱带数不同，同一引物在不同
供试种质材料上也具有不同的指纹图谱，这种现象表
明了木犀科苦丁茶各物种之间遗传背景的复杂性。另
一方面，由于存在共同的扩增谱带，这同时也表明木
犀科苦丁茶种质资源在起源上的某些共同性，或者说
它们之间有不同程度的亲缘关系。
2.2 基于 RAPD-PCR 结果的木犀科苦丁茶种质资源遗
传关系分析
2.2.1 RAPD遗传相似系数分析 根据 20个RAPD引
物在21份木犀科苦丁茶种质材料中所获得的427条扩
12 期 郑道君等：木犀科苦丁茶种质资源的 RAPD 分析 4169


图 2 引物 OPA8 的扩增结果
Fig. 2 The amplified result of primer OPA8

增带，计算供试材料间的遗传相似系数（GS 值），并
得出遗传相似系数矩阵（表格略去）。结果表明，21
份木犀科苦丁茶种质材料间的 GS 值变化范围为
0.1522～0.8322，平均 GS 值为 0.5466。在属间物种水
平上，牛矢果与女贞 7 份不同地域来源的种质材料之
间的 GS 值最小，在 0.1522～0.1732，平均为 0.1648，
这表明它们之间的亲缘关系在所有的供试木犀科苦丁
茶物种中最为远；日本毛女贞与序梗女贞之间的 GS
值最大，为 0.4652，说明它们之间的亲缘关系在所有
供试的木犀科苦丁茶物种中最近。在属内物种间水平
上，供试的女贞属苦丁茶物种中日本女贞与女贞之间
的亲缘关系最远，它与 7 份女贞的 GS 值最小，在
0.2727～0.3204，平均 GS 值为 0.2981。归纳起来说，
在女贞属苦丁茶中，日本毛女贞与序梗女贞的亲缘关
系最近，GS 值最大，而与丽叶女贞的亲缘关系次之，
GS 值为 0.3564；紧接着，与川滇蜡树、日本女贞、女
贞及粗壮女贞的亲缘关系依次逐渐远之。
2.2.2 RAPD 聚类分析 根据所得到的遗传相似系数
矩阵，采用 UPGMA 法构建了 21 份木犀科苦丁茶种
质材料间的遗传关系系统树图（图 3）。从图 3 可以
看出，当 GS 值在 0.1798～0.3156 时，可以将供试的
木犀科苦丁茶种质材料分成两大类，Ⅰ类包括了女贞
属 7 个物种共 20 份材料，它们之间的相似系数在
0.2727～0.8322；Ⅱ类仅为木犀属的牛矢果，仅 1 份种
质材料。
在Ⅰ类中根据系统聚类的单调性性质，即每次聚
合的遗传相似系数由大到小划分为 1 个独立的组，即
Ⅰ（4）及 3 个复合组即Ⅰ（1）、Ⅰ（2）和Ⅰ（3）
（图 3）。Ⅰ（1）是由 3 份川滇蜡树和 6 份粗壮女贞
种质材料组成的复合组，它们在 GS 值为 0.4268 处聚
为一类，川滇蜡树的 3 份种质材料均采自贵州省务川
县；产自不同地域的 6 份粗壮女贞种质材料基本上是
按照地域来源各自聚类。Ⅰ（2）复合组由 7 份不同地
域的女贞材料组成，它们之间的聚类关系也基本上是
按种质材料的地域来源进行的，同时又与材料的形态
特征有明显关系。例如，来自贵州境内的 4 份材料聚
为 1 支；NZ-36 产自江西省南昌市，在形态上与其它
女贞材料差异最大，而且地理距离与其它材料亦相距
较远，故 NZ-36 在Ⅰ（2）复合组（女贞组），是单
独聚为 1 支的；NZ-13（来自湖南省祁东县）和 NZ-35
（来自云南省西畴县），起源地在女贞组这 7 份材料
中虽不是最近的，但二者的形态较近，故在聚类时，
这两份材料聚在同一支。这一组在 GS 值为 0.3669 处
与Ⅰ（1）相聚。复合组Ⅰ（3）先由日本毛女贞和序
梗女贞在 GS 值 0.4652 处聚合，再在 GS 值为 0.3465
处与丽叶女贞聚合进而组成。Ⅰ（4）为由日本女贞组
成的独立组，它与供试的其它女贞属苦丁茶物种亲缘
关系最远，被聚在女贞属苦丁茶的最外面。Ⅱ类仅有
1 份木犀属牛矢果种质材料，它与供试的其它木犀科
苦丁茶种质材料之间的关系属间关系，GS 值≤0.2076，
在亲缘关系上离其它物种最远。
根据聚类的结果，供试木犀科苦丁茶各物种间
的亲缘关系大小，由近及远依次为：Ⅰ（1）粗壮女
贞、川滇蜡树，Ⅰ（2）女贞，Ⅰ（3）序梗女贞、
日本毛女贞、丽叶女贞，Ⅰ（4）日本女贞，Ⅱ牛矢
果。
4170 中 国 农 业 科 学 41 卷


图 3 21 份木犀科苦丁茶种质材料的 RAPD 聚类分析图
Fig. 3 RAPD cluster analysis dendrogram for 21 germplasm materirals of Kudingcha species in Oleaceae

3 讨论
木犀科苦丁茶种类繁多，分布广泛，遗传背景复
杂，其主要种类粗壮女贞的原产地和种植区主要在中
国西南地区各省（区）。本研究选用 21 份木犀科苦丁
茶种质材料，利用 RAPD 技术系统地研究木犀科苦丁
茶种质材料之间的遗传差异与亲缘关系，所选用的 20
个引物在供试的 21 份木犀科苦丁茶种质材料扩增出
427 条 RAPD 谱带，检测到了 417 个多态性位点，PPB
为 97.7%，供试个体间的相似系数在 0.1522～0.8322，
平均 GS 值为 0.5466，结果能够较为清晰地把物种区
分开来并表明它们之间的亲缘关系。因此，RAPD 分
子标记技术是一种研究木犀科苦丁茶种质资源不同物
种间亲缘关系的有效方法。
经典分类学家根据形态学特征将日本毛女贞归类
为日本女贞种下的一个变种。但从 RAPD 分析得到的
遗传相似系数及系统树图看，日本毛女贞与日本女贞
间基于 RAPD 分析的 GS 值为 0.3268，较其与序梗女
贞（基于 RAPD 的 GS 值为 0.4652）和丽叶女贞（基
于 RAPD 的 GS 值为 0.3564）小；在 RAPD 分析聚类
时，日本毛女贞是与序梗女贞、丽叶女贞归聚在同一
组[Ⅰ（3）组]，而日本女贞则被归聚在所有供试女贞
属苦丁茶材料之外，构成独立的一组[Ⅰ（4）组]。由
此可见，基于 RAPD 分析的结果表明，日本毛女贞与
日本女贞的亲缘关系较之日本毛女贞与序梗女贞、丽
叶女贞更远，这与经典分类结果不一致。经典分类是
以几个主要形态特征作为分类的依据，而控制这几个
形态特征的基因在整个遗传信息中所占比例较小，
RAPD 分析则是通过多个不同的随机引物给出覆盖整
个基因组的多态性信息，并且是直接从 DNA 分子中
检测碱基序列的变化，因此以形态学为依据的分类系
统与以 DNA 水平为依据的分类结果就不可能完全吻
合[26]。关于日本毛女贞是否应该划分为日本女贞之种
下一个变种，还是可以独立划分为一个种的问题，尚
待进一步研究。
紫茎女贞（亦称变紫女贞，L. pururascens Y. C.
12 期 郑道君等：木犀科苦丁茶种质资源的 RAPD 分析 4171
Yang）在不少文献中均被称之为“苦丁茶”[2,5-9,14]，
《云南植物志》（第 4 卷）将其与粗壮女贞作为两个
不同的物种分别予以描述，其重要的区别是紫茎女贞
“小枝纤细，紫红色”[3]。而《中国植物志》（第 61
卷）则将紫茎女贞归并于粗壮女贞[4]。据本文作者的
观察，所谓“紫茎女贞”，实际上，其小枝颜色的变
异是不连续的，既与遗传背景相关，又与立地条件、
小枝的年龄等因素密切相关。分别取自云南、贵州、
四川等省的几份粗壮女贞（或紫茎女贞）种质材料，
其小枝的颜色从灰色、褐色、浅紫红色、紫红色及至
深紫色均有，但在海南大学苦丁茶研究所的资源圃中
定植 6～8 个月后，各种种质材料的小枝颜色趋同，均
渐变为灰褐色。据此，笔者赞同《中国植物志》（第
61 卷）中的观点，宜将紫茎女贞归并于粗壮女贞。在
本研究中，来自四川屏山的材料 CZ-068 即是所谓的
紫茎女贞，在基于 RAPD 分析的聚类结果中，它与不
同地域的粗壮女贞种质材料归聚在一起。因此，在
DNA 分子水平上 RAPD 分析的结果支持紫茎女贞归
并于粗壮女贞。
4 结论
4.1 RAPD 分子标记技术可有效地应用于木犀科苦
丁茶种质资源的遗传多样性分析、亲缘关系及分类地
位研究。
4.2 RAPD 的分析结果表明，木犀科苦丁茶各物种间
存在着较大的遗传差异；牛矢果与供试的其它苦丁茶
种类的亲缘关系最远；粗壮女贞与川滇蜡树的亲缘关
系较其它供试物种最近；日本毛女贞与序梗女贞的亲
缘关系最近，而它们与丽叶女贞的亲缘关系次之。
RAPD 分析的结果支持紫茎女贞归并为粗壮女贞。
4.3 根据 RAPD 的分析结果，日本毛女贞与序梗女
贞、丽叶女贞的亲缘关系在所有供试的 8 种木犀科苦
丁茶中最近，而与日本女贞的亲缘关系较远。据此，
作者认为，经典植物分类中将日本毛女贞划分为日本
女贞之下的一个变种的问题，尚需进一步研究。

References
[1] 刘国民. 中国木犀科代茶植物的多样性与开发状况. 贵州科学,
2003, 21(1-2): 69-77.
Liu G M. Investigations on the species diversity and exploiting
situation of the substituting-for-tea plant of Oleaceae in China.
Guizhou Science, 2003, 21 (1-2): 69-77. (in Chinese)
[2] 王世清, 郑亚玉, 潘文刚, 张志勇. 贵州苦丁茶品种考证及显微鉴
定. 中草药, 2002, 33(11): 1040-1042.
Wang S Q, Zheng Y Y, Pan W G, Zhang Z Y. Species textual research
and microscopic identification of Fulium ilicis in Guizhou Province.
Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2002, 33(11): 1040-1042. (in
Chinese)
[3] 中国科学院昆明植物研究所. 云南植物志(第 4 卷). 北京: 科学出
版社, 1986: 642, 645.
Kunming Plant Institute of Chinese Academy of Sciences. Flora
Yunnanica (Vol. 4). Beijing: Science Press, 1986: 642, 645. (in
Chinese)
[4] 张美珍, 缪柏茂, 陆瑞林, 邱莲卿, 韦 直, 李秉滔. 中国植物志
(第 61 卷). 北京: 科学出版社, 1992: 155-156.
Zhang M Z, Miu B M, Lu R L, Qiu L Q, Wei Z, Li B T. Flora China
(Vol. 61). Beijing: Science Press, 1992: 155-156. (in Chinese)
[5] 王世清, 郑亚玉. 贵州苦丁茶品种考证及资源调查(一). 中国民族
民间医药杂志, 2002, (55): 107-108.
Wang S Q, Zheng Y Y. Variety textual research and resources
investigation of Kudingcha. Chinese Journal of Ethnomedicine and
Ethnopharmacy, 2002, (55): 107-108. (in Chinese)
[6] 吴赵云, 包雪声, 顺庆生, 李熙乾. 苦丁茶的本草及植物来源考证.
上海中医药杂志, 2002, (11): 43-44.
Wu Z Y, Bao X S, Shun Q S, Li X Q. Texture research on the origin of
Ku Ding Cha”. Shanghai Journal of Traditional Chinese Medicine,
2002, (11): 43-44. (in Chinese)
[7] 唐 茜, 单红丽, 杨 安. 四川苦丁茶化学成分的初步研究. 四川
农业大学学报, 2003, 21(3): 237-240.
Tang Q, Shan H L, Yang A. Preliminary study on the chemical
components of Kudingcha in Sichuan. Journal of Sichuan
Agricultural University, 2003, 21(3): 237-240. (in Chinese)
[8] 贺震旦, 刘玉青, 杨崇仁. 云南邵通产苦丁茶的配糖体成分. 云南
植物研究, 1992, 14(3): 328-336.
He Z D, Liu Y Q, Yang C R. Glycosides from Ligustrum purpurascens.
Acta Botanica Yunanica, 1992, 14(3): 328-336. (in Chinese)
[9] 童华荣, 高爱红, 袁海波, 朱 琳, 汪 海. 女贞苦丁茶挥发油成
分分析. 植物资源与环境学报, 2004, 13(1): 53-55.
Tong H R, Gao A H, Yuan H B, Zhu L, Wang H. Volatile oils of
Kudingcha from Ligustrum henryi and L. robustrum. Journal of Plant
Resources and Environment, 2004, 13(1): 53-55. (in Chinese)
[10] 刘国民, 李娟玲, 陈 榆, 罗文杰, 潘学峰. 我国苦丁茶冬青种质
资源的形态学研究Ⅰ. 茎叶的形态学研究. 贵州科学, 2004, 22(3):
9-23.
Liu G M, Li J L, Chen Y, Luo W J, Pan X F. Studies on morphology of
the germplasm resources of Ilex Kudingcha in China. I. Study on
morphology of stem and leaf. Guizhou Science, 2004, 22(3): 9-23. (in
Chinese)
[11] 史学群, 刘国民, 徐立新, 唐碧军, 陈圣政. 冬青属苦丁茶不同种
4172 中 国 农 业 科 学 41 卷
质材料之过氧化物酶同工酶和酯酶同工酶研究初报. 贵州科学,
2003, 21(3): 46-50.
Shi X Q, Liu G M, Xu L X, Tang B J, Chen S Z. A preliminary report
on the peroxidase isoenzyme and esterase isoenzyme of different
germplasm materials several Kudingcha species in Holly. Guizhou
Science, 2003, 21(3): 46-50. (in Chinese)
[12] 付乾堂, 张桂和, 刘国民, 彭国全, 蒙海俊, 史学群. 冬青属苦丁
茶不同种质材料的过氧化物酶同工酶分析. 贵州科学, 2004, 22(4):
67-76.
Fu Q T, Zhang G H, Liu G M, Peng G Q, Meng H J, Shi X Q. Study
on peroxidase isozymes of the germplasm materials of five
“Kudingcha tea” species in Ilex L. Guizhou Science, 2004, 22(4):
67-76. (in Chinese)
[13] 张凤琴, 刘国民, 周 鹏, 徐立新, 郭安平. 用 RAPD 技术探讨冬
青属苦丁茶的遗传差异、亲缘关系与分类地位. 云南植物研究,
2004, 26(6): 637-644.
Zhang F Q, Liu G M, Zhou P, Xu L X, Guo A P. A study on genetic
variations, relationships and classification of several “KUDINGCHA”
species in Ilex (Aquifoliaceae) based on RAPD analysis. Acta
Botanica Yunnanica, 2004, 26(6): 637-644. (in Chinese)
[14] 张灿坤. 苦丁茶的原植物及商品调查. 中药材, 1994, 17(3): 14-15.
Zhang C K. Original plants and market drugs investigation of
“Kudingcha”. Journal of Chinese Medicinal Materials, 1994, 17(3):
14-15. (in Chinese)
[15] 杨远庆, 杨胜学, 朱冬雪. 贵州苦丁茶植物学特征及分类鉴定. 贵
州农业科学, 1996, (6): 47-49.
Yang Y Q, Yang S X, Zhu D X. Botanical characters and classification
appraisal of Guizhou Kudingcha tree. Guizhou Agricultural Sciences,
1996, (6): 47-49. (in Chinese)
[16] 孙万仓, 范惠玲, 孟亚雄, 张 涛, 张金文, 王保成, 武军艳, 邵登
魁, 朱惠霞, 燕 妮, 赵玉昌. 利用 RAPD 分子标记技术研究芸芥
(Eruca Mill. ) 的遗传多样性 . 中国农业科学 , 2006, 39(5):
1049-1057.
Sun W C, Fan H L, Meng Y X, Zhang T, Zhang J W, Wang B C, Wu J
Y, Shao D K, Zhu H X, Yan N, Zhao Y C. Genetic diversity of yunjie
(Eruca Mill.) accessions revealed by RAPD marker. Scientia
Agricultura Sinica, 2006, 39(5): 1049-1057. (in Chinese)
[17] 李冬梅, 叶庆生, 朱根发. 大花蕙兰种质资源亲缘关系的 RAPD
分析. 中国农业科学, 2007, 40(4): 800-806.
Li D M, Ye Q S, Zhu G F. Analysis on the genetic relationships of
hybrid Cymbidium’s germplasm resources with RAPD markers.
Scientia Agricultura Sinica, 2007, 40(4): 800-806. (in Chinese)
[18] 陈 亮, 王平盛, 山口聪. 应用 RAPD 分子标记鉴定野生茶树种质
资源研究. 中国农业科学, 2002, 35(10): 1186-1191.
Chen L, Wang P S, Yamaguchi S. Identification of wild tea germplasm
resources (Camellia sp.) using RAPD markers. Scientia Agricultura
Sinica, 2002, 35(10): 1186-1191. (in Chinese)
[19] 林伯年, 徐林娟, 贾春蕾. RAPD 技术在杨梅属植物分类研究中的
应用. 园艺学报, 1999, 26(4): 221-226.
Lin B N, Xu L J, Jia C L. Studies on identification and classification
of genomic DNA in Myrica by RAPD analysis. Acta Horticulturae
Sinica, 1999, 26(4): 221-226. (in Chinese)
[20] Ma R, Yli-Mattila T, Pulli S. Phylogenetic relationships among
genotypes of worldwide collection of spring and winter ryes (Secale
cereale L. ) determined by RAPD-PCR markers. Hereditas, 2004, 140:
210-221.
[21] Fracaro F, Zacaria J, Echeverrigaray S. RAPD based genetic
relationships between populations of three chemotypes of Cunila
galioides Benth. Biochemical Systematics and Ecology, 2005, 33:
409-417.
[22] 彭建营, 束怀瑞, 彭士琪. 用 RAPD 技术探讨中国枣的种下划分.
植物分类学报, 2002, 40(1): 89-94.
Peng J Y, Shu H R, Peng S Q. To address the problem of infraspecific
classification of Ziziphus jujuba Mill. using RAPD data. Acta
Phytotaxonomica Sinica, 2002, 40(1): 89-94. (in Chinese)
[23] Kaundun S S, Zhyvoloup A, Park Y G. Evaluation of the genetic
diversity among elite tea (Camellia sinensis var. sinensis) accessions
using RAPD markers. Euphytica, 2000, 115: 7-16.
[24] 梁远发, 郑道君, 刘国民, 鄢东海, 令狐昌弟, 田永辉. 一种适用
于木犀科苦丁茶的高效 DNA 提取法. 中国农学通报, 2008, 24(3):
44-47.
Liang Y F, Zheng D J, Liu G M, Yan D H, Linghu C D, Tian Y H. An
effective DNA extraction method for the Kudingcha species in
Oleaceae. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2008, 24(3): 44-47.
(in Chinese)
[25] 鄢东海, 郑道君, 梁远发, 令狐昌弟, 刘国民, 田永辉. 粗壮女贞
RAPD 分析实验条件优化的研究. 贵州科学, 2007, 25(2): 56-64.
Yan D H, Zheng D J, Liang Y F, Linghu C D, Liu G M, Tian Y H.
Study on the optimization of RAPD-PCR experimental system in
Ligustrum robustum(Roxb) BL. Guizhou Science, 2007, 25(2): 56-64.
(in Chinese)
[26] 周永红, 杨俊良, 郑有良, 颜 济, 贾继增, 魏育明. 用 RAPD 分
子标记探讨鹅观草属的种间关系 . 植物学报 , 1999, 41(10):
1076-1081.
Zhou Y H, Yang J L, Zheng Y L, Yan J, Jia J Z, Wei Y M. RAPD study
on inter-species relationships in Roegneria (Poaceae: Triticeae). Acta
Botanica Sinica, 1999, 41(10): 1076-1081. (in Chinese)

（责任编辑 曲来娥）