全 文 ：中国红树科 7种红树植物遗传多样性分析
周涵韬　林　鹏
(厦门大学生命科学学院,厦门　361005)
摘要:以红树 、红海榄 、秋茄 、角果木 、木榄 、海莲 、尖瓣海莲等 7 种红树科植物为材料 ,采用改
进的 CTAB 法获得了纯度较高 、得率高 、片段完整的基因组 DNA。通过筛选出的 15 个有效
引物进行 RAPD分析 ,探讨了 7 种红树植物间的亲缘关系。 15 个有效引物共扩增出 617 条
DNA带 , 其中多态性条带 415 条 ,占总扩增条带的 67.26%。利用 Nei指数法得出 7 个分类
群间的遗传一致度和遗传距离 ,并运用 UPGMA 法进行聚类分析。 7 个分类群分为A 、B 两个
大组 ,平均遗传距离为 0.41。将得出的 7 个分类群的 DNA 分子分类系统图 , 与传统的分类
进行比较 ,发现结果相符。同时获得一个 OPG05—900 的差异片段可作为区分海莲和尖瓣海
莲的分子标记。
关键词:红树科;RAPD;遗传多样性
中图分类号:Q948.8　　文献标识码:A　　文章编号:1000-3207(2001)04-0362-08
红树林是生长于热带 、亚热带陆海交汇的海湾河口潮间带的盐生木本植物群落 。它
在维护海岸生态平衡;防风减灾 、护堤保岸;环境污染监测 、净化与防治等方面发挥重要的
作用 。同时 ,它是热带河口海湾生态系统重要的第一性生产量贡献者 ,为人们提供各种产
品;它蕴藏着丰富的动植物 、微生物资源 。在我国红树植物实际分布中 ,红树科红树植物
分布最为广泛:南到海南 、台湾 、广东 、广西 ,北(如秋茄)人工引种已分布到浙江 ,该地最低
月均温 7.3℃,并且从高潮到低潮带均有分布。分布地区生境变化较大 ,植株的形态也多
种多样。目前国内外对红树植物开展了大量的生物学研究工作 ,成果多集中在生态学 、生
理学 、生物化学等领域[ 1] ,而分子生物学的研究工作正处于起步阶段 。对红树植物的分
类主要通过形态比较细胞学观察等进行研究 ,对红树植物某些种 、变种的分类关系仍不确
定。自 1990年建立以来 ,随机扩增多态性 DNA(RAPD)技术已广泛用于种质资源分析 ,
品种鉴定[ 2] ,遗传连锁图谱的构建[ 3] ,基因定位[ 4]等领域 。本文通过对海南东寨港红树
林自然保护区内 7种红树植物的 RAPD研究 ,在 DNA 分子水平上探讨红树科不同种属
之间的遗传关系 。从而为进一步开发和利用我国红树林资源打下基础。
1　材料和方法
1.1　红树植物样品 实验用7种红树科红树植物嫩叶样品为红树(Rhizophora apiculata)、
　　收稿日期:2000-10-09;修订日期:2001-01-10
　　基金项目:国家教育部高等学校博士点基金资助项目(批准号:1999038410)
　　作者简介:周涵韬(1970—),男 ,湖北省武汉市人;博士;研究方向:植物分子生物学
　第 25卷 第 4期
2 0 0 1 年 7 月
水 生 生 物 学 报
　 　 　 　 ACTA HYDROBIOLOGICA SIN ICA 　 　 　 　
Vol.25 , No.4
July , 2 0 0 1 　
红海榄(R .stylosa)、秋茄(Kandelia candel)、角果木(Ceriops tagal)、木榄(Bruguiera
gymnorrhiza)、海莲(B .sexangula)、尖瓣海莲(B .sexangula var.rhynchopetala)均采自
海南东寨港红树林自然保护区内 ,采集时间为 1999年 3月 23日 。
1.2　试剂　Taq DNA 聚合酶 、单核苷酸(dNTPs)、分子 Marker 、CTAB等均为 Promega
公司产品;所用引物(表 2)为 Operon公司及 Sangon公司产品;其它试剂均为国产分析纯
试剂 。
1.3　仪器　PCR仪:PE 公司 , 480型;紫外分光光度计:752 型;电泳仪:BIO-RAD公
司 ,Pow er300型。凝胶成像系统:UVP 公司 ,GDS8000。
1.4　DNA的提取及检测　红树植物总基因组的提取 ,采用改进的 CTAB(Cety l t rimethyl
ammonium bromide ,十六烷基三甲基溴化铵)法 。称取0.5g 红树植物嫩叶 ,加液氮研磨成
粉状 ,加入预热至 65℃的 CTAB抽提缓冲液(1%β -巯基乙醇 ,2%CTAB ,1.4mol/L Na-
Cl ,20mmol/ L EDTA ,100mmol/L Tris-HCl ,pH8.0)混匀 , 65℃恒温 1h 。加入等体积的
氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提。于 15000r/min离心 5min ,取上清液 ,加入 2/3体积异丙醇混
匀 ,置于-20℃冰箱中 60min 。于 15000r/min 离心 10min 。弃上清液 ,沉淀用 70%的酒
精洗两次 ,待酒精挥干后 ,加入 400μL TE 缓冲液溶解。加入 RNase 至终浓度为 50ng/
mL ,置于 37℃恒温水浴 60min。加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提两次 ,于
15000r/min离心 5min。取上清液 ,加入 1/10体积 3mol/L NaCl和 2倍体积的无水乙醇 ,
置于-20℃冰箱中 90min。于 15000r/min离心 10min ,弃上清液 ,沉淀用 70%的酒精洗
两次 。待酒精挥干后 ,加入 50μL TE缓冲液溶解 。
1.5　DNA纯度 、浓度的测定和电泳检测　将 DNA溶液稀释后以 TE 缓冲液为空白对照
测其在 260nm 及 280nm 波长的紫外吸收 ,计算 DNA 的浓度 ,得率并判断其纯度。用 1×
TBE配制的 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测判别 DNA分子的大小及基因组是否降解 。将符
合条件的样品稀释至 20ng/μL 用于 RAPD分析 。
1.6　RAPD反应　聚合酶链式反应(PCR)体系 Taq DNA 聚合酶 1.5U ,引物(5μmol/ L)
2μL ,dN TPs(1mmol/L)2.5μL , MgCl2(2mmol/L)2.5μL ,模板 DNA50ng ,加超纯水至
25μL ,反应体系用 20μL 石蜡油覆盖 。PCR 循环设置为:94℃变性 1min , 36℃复性
1min ,72℃延伸 2min ,共 40个循环 ,然后 72℃延伸 7min 后置于 4℃冰箱保存 。
1.7　电泳及观察　将 PCR扩增产物在用 1×TBE配制的 1.5%的琼脂糖凝胶中电泳分
离。EB直接加入胶中 ,终浓度约为 0.5mg/L。在 3V/cm 的恒压下电泳 2.5h 。电泳结束
后在紫外检测仪上观察记录扩增产物的泳带 ,并在凝胶成像系统中保存图象。
1.8　数据的统计与分析　按琼脂糖凝胶同一位置上 DNA带的有无进行统计 ,有带的记
为`1 (包括弱带),无带的记为`0 。利用 UPGMA 法对所得数据进行聚类分析 。
2　结果与分析
2.1　DNA提取
提取的 7种红树植物 DNA溶液的紫外吸收 ,A260和A280值见表 1 ,琼脂糖凝胶电泳检
测结果见图 1。
由表1结果可见 ,7种红树植物紫外检测的A260/A280比值在1.6 —1.8之间 , DNA纯
3634 期 周涵韬等:中国红树科 7 种红树植物遗传多样性分析 　
表 1　7种红树科红树植物 DNA提取结果
Tab.1　The result s of the DNA ext raction of 7 taxa of mangroves in Rhizophoraceae
种名 A 260 A280 A 260/A280 得率(μg/ gFG)
红树 12.1 6.40 1.880 121
红海榄 12.5 6.95 1.797 125
角果木 10.4 6.20 1.677 104
秋茄 11.2 6.90 1.623 112
木榄 13.9 8.58 1.620 139
海莲 12.5 7.52 1.666 125
尖瓣海莲 11.8 6.76 1.744 118
度较好。由图 1 可知 , DNA 的片段大小均一 , 长度为 23Kb。所获得的 DNA 可作为
RAPD反应的模板。
图 1　红树植物 DNA 电泳图谱
(1—7依次为:1.木榄 2.海莲 3.尖瓣海莲 4.秋茄 5.红树 6.红海榄 7.角果木
M 为λDNA EcoR I/HindⅢ分子量标记)
Fig.1　Genomic DNA elect rophoresis of 7 taxa of mangroves in Rizophoraceae
(1—7 are species numbers:1.B ruguiera gymnorrhiza , 2.B.sexangu la , 3.B.s.var.rhynchopetala ,
4.Kandelia can del , 5.R hizophora apiculata , 6.R.stylosa , 7.Ceriops taga l ,
M:λDNA EcoRⅠ/Hind Ⅲ)
2.2　RAPD扩增结果
以 7种红树植物为材料 ,通过已筛选出的 15个有效引物进行 RAPD分析 ,获得了 7
种植物间的亲缘关系 。PCR扩增的电泳图谱见图 2。由图 2可知各引物在上述每种红树
植物中扩增的条带数为 5—8条 ,扩增片段的大小在 0.35 —3.5Kb 之间。15个有效引物
扩增的条带重复性好(重复 2次以上),带型清晰 ,便于统计分析。同时对 DNA 带型进行
统计(表 2)。由表 2可知 ,这 15个有效引物共扩增出 617条 DNA带 ,平均每个引物在这
7种红树植物中扩增出 41.13条带 。多态性条带 415 ,平均每个引物有 27.67 。多态性条
带占总扩增条带的 67.26%。
364　 水　　生　　生　　物　　学　　报 25 卷
图 2　红树科红树植物植物 DNA 指纹图谱
(1—7依次为:1.木榄 2.海莲 3.尖瓣海莲 4.秋茄 5.红树 6.红海榄 7.角果木
M 为λDNA EcoRⅠ/HindⅢ分子量标记)
Fig.2　Genomic DNA fingerprint s of 7 taxa of mang roves in Rhizophoraceae
(1—7 are species numbers:1.B ruguiera gymnorrhiza , 2.B.sexangu la , 3.B.s.var.rhynchopetala ,
4.Kandelia can del , 5.R hizophora apiculata , 6.R.stylosa , 7.Ceriops taga l ,
M:λDNA EcoRⅠ/HindⅢ)
表 2　15个有效引物在 7种红树植物中 PCR 扩增
Tab.2　Amplification of 15 ef fective primers on 7 taxa of mangroves in Rhizophoraceae
引物号
Primer number
序列
Sequence
扩增条带
Number of DNA band
多态性条带
Number of
polymorphic bands
多态性条带占百分比
Percentage of
polymorphic bands(%)
OPG05 CTGAGACGGA 48 33 68.75
OPG15 ACTGGGACTC 45 32 71.11
OPH01 GGTCGGAGAA 46 30 65.22
OPH19 CTGACCAGCC 32 22 68.75
OPA02 TGCCGAGCTG 44 28 63.64
OPA19 CAAACGTCGG 49 35 71.43
S08 GTCCACACGG 38 28 73.68
S58 GAGAGCCAAC 42 28 66.67
S68 TGGACCGGTG 36 19 52.78
S78 TGAGTGGGTG 43 30 69.77
S88 TCACGTCCAC 39 24 61.54
S168 T TTGCCCGGT 42 30 71.43
S178 TGCCCAGCCT 41 27 65.85
S188 TTCAGGGTGG 36 28 77.78
S198 CTGGCGAACT 36 21 58.33
T otal 617 415
Average 41.13 27.67 67.26
3654 期 周涵韬等:中国红树科 7 种红树植物遗传多样性分析 　
2.3　遗传一致度及遗传距离聚类分析
利用 Nei指数法[ 5]得出 7种红树植物间的遗传一致度和遗传距离(表 3)。并运用
UPGMA 法对 7种红树植物间的亲缘关系进行聚类分析(图 3)。7个种分为 A 、B 3个大
组 ,平均遗传距离为 0.41 ,遗传距离最大的为角果木和尖瓣海莲之间 0.56(<0.6)。
红树 、红海榄及角果木处于 A 组。红树 、红海榄遗传距离为 0.23 。表明红树与红海
榄在分子水平上处于同一属。这与它们在宏观分类上属于红树属相一致。角果木与红树
的遗传距离为 0.38 ,与红海榄的遗传距离为 0.46 ,平均为 0.42(>0.4),在聚类图上 ,红
树 、红海榄处于同一亚组 ,而角果木单独处于另一亚组 。表明角果木(角果木属)与红树 、
红海榄(红树属)为科内属间关系 ,这与宏观分类结果一致。
秋茄 、木榄 、海莲 、尖瓣海莲同处于 B组 。B组分为 2个亚组 ,秋茄处于一个亚组 ,它
与木榄 、海莲 、尖瓣海莲间的平均遗传距离为 0.38(最大为 0.48),为属间关系。
表 3　红树科 7种红树植物的遗传距离(下三角)及遗传一致度(上三角)
Tab.3　Similari ty mat rit and genetic distance of 7 taxa of mangroves in Rhizophoraceae based on
Nei s estimate of simi larity and genetic distance
红海榄
Rhizophor
a sty losa
红树
Rhizophora
apiculata
角果木
Ceriops
tagal
秋茄
kandelia
candel
木榄
Bruguiera
gymnorrhiza
海莲
Bruguiera
sexangu la
尖瓣海莲
Bruguiera s.var.
rhynchopeta la
红海榄 0 0.77 0.54 0.44 0.53 0.55 0.49
红树 0.23 0 0.62 0.54 0.61 0.63 0.46
角果木 0.46 0.38 0 0.52 0.55 0.51 0.44
秋茄 0.56 0.46 0.48 0 0.62 0.61 0.52
木榄 0.47 0.39 0.45 0.38 0 0.7 0.64
海莲 0.45 0.37 0.49 0.39 0.3 0 0.82
尖瓣海莲 0.51 0.54 0.56 0.48 0.34 0.18 0
图 3　7种红树植物的聚类图
Fig.3　DNA molecular dendrogram of 7 taxa of mangroves in Rhizophoraceae
　　木榄 、海莲 、尖瓣海莲处于同一亚组 ,平均遗传距离为 0.27 ,为属内种间关系 。进一
366　 水　　生　　生　　物　　学　　报 25 卷
步分析发现 ,海莲 、尖瓣海莲处于同一小组内 ,尖瓣海莲与海莲的遗传距离为 0.18 ,接近
种内种群间关系;而尖瓣海莲与木榄遗传距离为 0.34 ,二者为不同种。
3　讨论
3.1　红树植物的遗传多样性
遗传和变异是生物进化发展的基础 ,变异为进化提供原料 ,通过遗传保存和积累某些
变异 。作为一个独立的科 ,红树科红树植物具有一些共同的特点 ,例如其木材纤维具有独
特的梯状穿孔;此外其筛管分子中普遍存在 PV 亚型的筛分子质体 ,在双子叶植物中只有
3个科(另外 2个科是 Cy rillaceae 和 Erythroxylaceae)的植物筛管分子具有 PV 亚型的蛋
白质积累[ 6] 。但由于生态环境差异较大 ,红树科红树植物之间的形态解剖结构差异也较
大。这与本研究从分子水平所获得的结论一致 。所研究的 7种红树科红树植物 ,其多态
位点率为 67.26%,远高于种间的平均水平(27.4%), 较之与 Lycopersicon 的 37.2%,
Solanum 的 20.15%, Acanthus的 34%,也高出许多。较高的多态位点率 ,反应植物本身
的遗传多样性丰富。植物的遗传变异可以反映出其对环境的适应能力 。大量的研究表
明 ,广泛分布的物种包含的遗传变异较多。
由聚类分析的结果看 ,所研究的 7种红树植物的亲缘关系与宏观分类关系一致 。如
角果木为角果木属 ,红树和红海榄属红树属 ,聚类图中红树和红海榄聚为同一亚组 ,红树 、
红海榄遗传距离为 0.23为属内种间关系。而角果木与红树属的平均遗传距离为 0.42为
科内属间关系。以上结果证实了 RAPD技术用于红树植物遗传多样性研究的准确性。
3.2　木榄属 3种红树植物的遗传变异
表4中列出了木榄属 3种红树植物的形态学差异。从中可以看出 ,木榄 、海莲 、尖瓣
海莲形态学的差异较小 ,主要集中在花器的构造上 ,并且海莲与尖瓣海莲的差异更是微
小。在对这 3种红树植物进行野外考察和采样时 ,往往会将它们混淆 ,特别是在无花和果
实的时期 。在植物宏观分类上 ,对这 3 种红树植物也存在着一些争论 。主要的观点有 2
种:1.由于尖瓣海莲与海莲的形态学差异较小 ,认为尖瓣海莲是海莲的变种;2.尖瓣海莲
在有些生态学 、生理学等的特性上与木榄有着一定程度的相似性 ,认为尖瓣海莲是木榄与
海莲的自然杂交种。
通常 ,证实种间关系(变种或杂交种)主要依靠形态学 、次生化合物 、染色体 、地理分布
和实验杂交等方法 ,但这些方法都有其局限性 。相比之下 ,分子标记技术是一种有效的分
析手段 。对于任何一个类群来说 ,要么含有某个基因位点 ,要么不含该位点 ,不存在形态
性状中难以判断的中间性 。
本研究的结果表明 , ①电泳图谱上(图 2),尖瓣海莲与海莲的指纹图谱极为相似而与
木榄的指纹图谱差异较大 。②聚类图上(图 3),尖瓣海莲与海莲聚于同一亚组 ,而木榄处
于另一亚组 。③遗传距离划分上(表 3),木榄 、海莲 、尖瓣海莲处于同一亚组 ,平均遗传距
离为 0.27 ,为属内种间关系 。尖瓣海莲与海莲的遗传距离为 0.18 ,接近种内种群间关系;
而尖瓣海莲与木榄遗传距离为 0.34 ,二者为不同种。由此认为 ,将尖瓣海莲处理为海莲
的变种较为合适 。这一结论与林鹏的研究 ,葛菁萍[ 7]等位酶研究的结论一致 。
同时 RAPD分子标记技术也能有效地将亲缘关系接近的尖瓣海莲和海莲区分开来 。
3674 期 周涵韬等:中国红树科 7 种红树植物遗传多样性分析 　
如图 4 ,在 15个有效引物对木榄属 3 种红树植物扩增的指纹图谱中 ,有些引物在海莲和
尖瓣海莲之间扩增的结果没有差异;有些引物虽然存在着差异 ,但差异片段扩增较为模
糊;如OPG05 ,在尖瓣海莲扩增的指纹图谱中 ,出现 1个DNA片段 ,大小约为900bp ,命名
为OPG05—900。该 DNA 片段在海莲中没有出现 。所获得的差异片段可作为区分海莲
和尖瓣海莲的分子标记。
表 4　木榄属 3种红树植物的形态学差异
Tab.4　Morphological variat ion of 3 taxa of mangroves in Bruguiera
项目
Item
海莲
B.sexangula
尖瓣海莲
B.sexa ngula.var.rhynchopetala
木榄
B.gym norrh iza
1.花萼裂片 9—12枚 ,通常 10枚 10—14枚 ,通常 12枚
2.花萼/萼管 结果时长于萼管 结果时短于萼管
3.花萼管 有纵棱 平滑
4.花瓣 边缘被粗毛 基部被密毛 ,上部秃净
5.花瓣裂片 裂片顶端具刺毛 1—2条,裂口 1条 顶端锐具刺毛 2—4条 ,裂
口 1条 ,明显超出花瓣顶端
1.刺毛:1条 2条
2.花药:不具喙 具喙
通过本实验可以看出 , RAPD标记技术能较为客观地反应出红树植物的遗传多样性
及其相互关系 ,它应用于红树植物的分子分类研究是切实可行的 。RAPD技术对于红树
资源的鉴定 ,分类及遗传多样性评价是一种有效的手段。因此 RAPD技术结合传统的资
图 4　木榄属 3种红树植物植物 DNA 指纹图谱
(1—3依次为:1.木榄 2.海莲 3.尖瓣海莲 M 为λDNA EcoR Ⅰ/HindⅢ分子量标记)
Fig.4　Genomic DNA f ingerprints of 3 taxa of mangroves in Brugu iera
(1—3 are taxa numbers:1.B.gymnor rhiza , 2.B.sexangula , 3.B.sexangula var.rhynchopetala ,
M:λDNA EcoRⅠ/Hind Ⅲ)
源鉴定方法必将进一步促进红树资源的合理开发 、保护和管理。
368　 水　　生　　生　　物　　学　　报 25 卷
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ANALYSIS ON GENETIC DIVERSITYOF SEVEN MANGROVES
IN RHIZOPHORACEAE IN CHINA
ZHOU Han-tao and LIN Peng
(S chool of Li fe S ciences , Xiamen Universi ty , Xiamen　361005)
Abstract:　DNAs from 7 txax of mang roves in Rhizophoraceae w ere ext racted by using the
CTAB method.A260/A280ratio of DNA solutions ranged from 1.6 to 2.0 , and the length of
DNA fragment w as about 23kb.RAPD markers were used to assess the relationships among
the 7 taxa of mang roves in Rhizopho raceae.Fif teen effective primers were screened from 30
10-oligonucleot ide arbit rary primers , and a total of 617 DNA bands were amplified , among
which 415 (67.26%)were polymorphic.Based on UPGMA cluster analysis of 617 DNA
bands amplified by the 15 primers , a DNA molecular dendrog ram was established ,which di-
vided 7 species in Rhizophoraceae into 2 main g roups.The average genetic distance among
the 7 taxa was 0.41 , and the maximum genet ic distance w as 0.56(<0.6), which between
Ceriops tagal and Bruguiera sexangula var.rhynchopetala.It indicated that the 7 tax a are
in the same family.Group A included 3 taxa-Rhizophora apiculata , R .stylosa , Ceriops ta-
gal;group B contained 4 species Bruguiera gymnorrhiza , B .sexangula , B.sexangula
var .rhynchopetala , and Kandelia candel.The dendrogram obtained from the cluster analy-
sis was consistent to morpholog ical classification.A special DNA fragment , which named
OPG05-900 , was amplified to distinguish B.sexangula and B .sexangula var.rhyn-
chopetala.The results could be valuable to the pro jects of plant int roduction , ecological
restoration and conservation in mangroves.
Key words:　Rhizophoraceae;RAPD;Genetic diversity
3694 期 周涵韬等:中国红树科 7 种红树植物遗传多样性分析