全 文 ：禾木科作物基因转化研究进展

王慧中　　赵培洁　陈卫辉　　王冀平
　　 (生物系 )　　　　　　 (省中药研究所 )　　　　　　 (省分析测试中心 )
摘　　要
本文从四个方面对禾本科作物特别是水稻的基因转化的新近研究成果进行了评述。
作者认为 ,研究工作取得了不少成果 ,但尚未建立起一整套具体的操作模式 .
关键词　禾本科 ,转化 ,根癌农杆菌 ,原生质体 .
DN A重组及其遗传操作技术的迅速发展以及植物组织培养技术的日趋完善 ,为植物
遗传工程的发展奠定了坚实的基础 [ 1, 2]。将有应用价值的外源基因导入受体细胞使其定向
而稳定地遗传 ,具常规育种所无法比拟的优势 [3, 4 ]。禾谷类作物是人类主要的粮食来源 ,其
品质改良一直以来是遗传育种工作的一项重要内容。 近年来 ,植物基因工程研究发展迅
速 ,在禾本科作物抗病、抗虫和抗除草剂等方面均得到了瞩目的成就 [5, 6 ]。但由于禾本科作
物 ,特别是水稻的体外组织培养和再生分化能力依赖于其基因型和培养条件 ,虽然有报道
水稻转基因成功 ,但多数局限在粳稻品种 [7 ] ,籼稻成功例子为数不多 [8 ]。本文将以水稻为
主从外源基因导入禾本科作物方法 ,用于禾本科作物基因转化的基因、禾本科作物原生质
体再生植株以及外源基因在禾本科作物上的表达及遗传四个方面的新近成果加以评述。
1　外源基因导入禾本科作物的主要方法
1. 1　农杆菌介导的基因转化
农杆菌可以通过伤口感染受伤的植物组织。利用农杆菌 Ti质粒衍生载体进行基因转
移 ,目前主要采用原生质体共培养、植物组织器管共培养、植物原生质体和农杆菌原生质
球的融合转化三种方法。过去认为 Ti转化系统只适用于双子叶植物 ,认为 Ti质粒上的
Vir基因的激活有赖于植物细胞释放的某些信号因子 ,而单子叶植物不能产生这类信号
分子。这类信号分子经分离、纯化、鉴定确定为一组酚类化合物 ,属于乙酰丁香酮及其同系
物 ,单子叶植物体内缺乏该类物质 [9 ]。 Raineri等人 [10 ]用乙酰丁香酮预先处理具有广寄主
范围的野生农杆菌 ,然后感染水稻盾片 ,在诱导的愈伤组织中检测到 T-DNA已整合到水
稻细胞中。 酚类化合物处理的 C58 C1RifR农杆菌感染籼稻悬乳细胞时 ,李宝健等人 [11 ] ,也
检测到 N PT-Ⅱ酶活性和 nos基因的表达。研究表明 ,农杆菌可以感染 5个科近 20种单子
叶植物 [12 ]。 Bata[13 ]等人以 PEG为融合剂 ,直接把水稻原生质体和农杆菌原生质球相融
1998年第 3期　　　　　　　杭　州　师　范　学　院　学　报　　　　　　　　 1998年 5月
No. 3. 1998　　　 JOURNAL OF HANGZHOU TEACHERS COLLEGE　　　 May　 1998
收稿日期 1997— 12— 20.
合 ,把 Ti质粒引入水稻细胞 ,使农杆菌转化法的应用范围不断扩大。
1. 2　基因直接转移法
农杆菌转化法由于细菌侵染范围的限制 ,应用于禾本科作物尚有困难 ,基因直接转化
法以 PEG处理植物原生质体与裸露的质粒 DNA分子的混合液即可将外源基因引入到
植物细胞 [14 ]。由于方法本身是非特异性的 ,因此没有种属范围的限制。1990～ 1993年间由
PEG介导转化的基因有 hph基因、 gus基因和 Bt基因。此外对共培养的原生质体施加电
场刺激即电击法可以提高转化频率 [15 ] ,由电击法导入水稻的基因有 npt-Ⅱ基因、 hph基
因、 cat基因和 gus基因 [ 16、 17]。应用以上两个最为广泛的转化方法 ,已成功地转化了多种作
物 ,特别是多种粮食作物 [18 ] ,由于禾谷类作物的原生质体再生难题几乎全部被攻克 ,相信
这些方法将有快速发展。
1. 3　以脂质体为载体的遗传转化
　　将脂质体与植物原生质体在适当的培养基中混合 ,两者之间便会发生内吞作用、融合
作用或交换作用。 随后再与溶酶体融合 ,并逐渐被降解 ,使内含物释放出来。 这样就可以
使被包裹的核酸传递到各种类型的细胞中 [19 ]。目前又出现了一种改进的脂质体叫 pH-敏
感脂质体。试验结果表明 ,使用脂质体作为载体转化原生质体比用裸露 DNA转化有明显
的提高转化频率作用。最近完成的利用 pH-敏感脂质体介导的转化水稻原生质体工作 ,结
果表明转化频率高达 14% ,并由此得到了水稻转化再生植株。
1. 4　其它转化方法
1. 4. 1　基因枪法　将 DNA与钨粉颗粒混合后利用火药产生的冲击波将其射入植物细
胞中 ,这一方法可直接用于转化组织。该法转化玉米、水稻、甘蔗、小麦已取得成功 [20、 21、 22 ]。
Jun Cao利用基因枪转化系统和 bar基因的筛选效率 ,从转化水稻胚性悬浮细胞再生的水
稻植株中筛选了具有 PPT或 BASTATM抗性的植株。燕义唐报道了利用该法将水稻条纹
叶枯病毒外壳蛋白基因导入水稻悬浮细胞系愈伤组织 ,得到了能够表达该基因的水稻植
株。
1. 4. 2　花粉管途径　该法是我国学者周光宇等人根据远缘杂交育种实践而设计的方法。
但目前报道只限于棉花和水稻这两种作物 [23、 24 ]。 该法的可靠性和重复性尚待进一步验
证。
2　用于禾本科作物遗传工程的基因
2. 1　标记基因
2. 1. 1　新霉素磷酸转移酶 ( N PT-Ⅱ )基因　氨基糖苷类抗生素、卡那霉素、新霉素具有干
扰核糖体合成蛋白质的能力 ,从而抑制细胞的生长。 N PT-Ⅱ可以催化 A TP gamma位磷
酸转移到上述抗生素的某些基团上 ,使之失活。使用 N PT-Ⅱ基因转化作物可以赋予转化
细胞抗上述抗生素的能力 [25 ]。但水稻细胞对卡那霉素表现有天然的耐受力 [ 26 ] ,所以对供
试水稻要事先明确其转化前忍受卡那霉素水平。再者 ,使用卡那霉素筛选抗性组织会出现
白化苗现象。 Dekeyseer等 [26 ]以 npt-Ⅱ基因为报告基因 ,构建了 6个不同启动子的嵌合基
因 ,借助电击技术成功地将基因导入水稻悬浮细胞系和叶片制备的两种原生质体中。
2. 1. 2　 beta葡萄糖酸苷酶 ( GU S)基因　转化作物所产生的 GU S可以在体外催化裂解
beta-Methy lumbelliferene glucuronide等人工合成底物 ,并形成荧光物质 ,使用荧光光度
计可对其进行定量测定。尽管水稻等作物组织和细胞存在内源性葡萄糖苷酸酶 ,但该酶含
量低 , gus基因仍可用于水稻转化研究。 Zhang和 Wu [27 ]、 Dard和 Raineri[10 ]、 Meijer分别
选用不同启动子和 gus融合 ,转化水稻后 ,可以看出 gus基因的表达。
2. 1. 3　氯霉素乙酰转移酶 ( Cat )基因　氯霉素具有干扰核糖体合成蛋白质并最终抑制细
76 杭　州　师　范　学　院　学　报　　　　　　　　 1998年
胞生长的作用 , Ca t可以催化乙酰 CoA转乙酰基反应 ,乙酰化的氯霉素即失去了其抗菌
素的活性 ,所以携带有 cat基因的转化植物细胞将具有抗氯霉素的能力。 Ou-Lee[16 ]曾将
CaMV 35s启动子 Cat和果蝇 Copia LT R启动子 Ca t这两组嵌合基因 ,应用电击法导入由
水稻品种台南 67的叶片和愈伤组织制备的原生质体中。
2. 2　目的原因
用于植物基因工程的目的基因已多达百个。与抗除草剂、抗虫、抗病、抗逆等有关 ,比
如 EPSP合成酶基因、苏云金杆菌毒素蛋白的基因、种子储存蛋白基因、金属硫因蛋白基
因、烟草花叶病毒 CP基因、苜蓿花叶病毒 CP基因、黄瓜花叶病毒卫星 RNA、烟草环斑病
毒卫星 RNA以及一些人体基因如α-干扰素基因 ,但应用于禾本科作物特别是水稻当中
的目的基因仅有 bar基因、 RSV的 CP基因 , Bt杀虫基因等少数几种 [ 29、 30] ,多数仍使用报
告基因 ,离实际应用尚有距离。
3　禾本科作物原生质体再生植株的研究
原生质体的全能性即再生完整植株是进行遗传操作最关键的基础 ,禾本科作物包括
了最重要的几种粮食作物 ,如小麦、水稻、玉米等。 80年代以前 ,它们的原生质体培养一直
很困难。1980年 Vasil等利用珍珠谷的胚性悬浮细胞游离得到原生质体 ,并成功地再生得
到小植株 ,这是首次禾本科作物的成功报道。以后相继在羊草、紫狼尾草取得成功。近年
来 ,利用胚性愈伤组织或悬浮系游离原生质体 ,分别在水稻 [7 ]、玉米 [31 ]、小麦 [32 ]、甘蔗 [ 33]成
功地获得再生植株。我国自 1986年由水稻再生植株成功后相继有 6个粳稻品系、一个籼
稻品种先后再生植株。 中科院植物所运用杂种玉米通过胚性愈伤首次使其原生质体再生
植株 ,在国际上引起反响。遗传所报道了用小麦原生质体的再生愈伤组织高频率地分化再
生植株。谷子与高梁是上海植生所在国际上首次由原生质体获得再生植株。 中国水稻所
颜秋生等把大麦通过原生质体途径再生成植株。但从已成功的报道中可以看出 ,没有一个
普遍适用的培养方法或培养基。随基因型、游离原生质体的材料及培养基和培养方法不同
而有差异。
4　外源基因在受体细胞中的表达及遗传研究
已有多位研究者报道了由原生质体直接摄入 DNA转化粳稻并再生转基因植株 [27 ]。
Uchimiya等 [34 ]将由农杆菌胭脂碱合成酶 ( No s)基因启动子控制的 npt-Ⅱ基因导入水稻
原生质体并得到了卡那霉素抗性转基因愈伤组织。 Zhang和 Wu报道不同选择标记而转
化原生质体中得到转基因水稻植株 ,报导玉米乙醇脱氢酶基因的调节序列控制下的 gus
基因导入了水稻原生质体。 这些研究者均观察到了该基因在水稻愈伤组织及根组织中的
表达。 Dekey ser等 [26 ] ,在水稻原生质体转化试验中用 DHFR基因作为二次标记 ,但没有
发现该基因在转基因水稻愈伤组织中的表达。 另外 , E. G. M. M eijer [28 ]等报道了有关鼠
DHFR基因和 ho t基因在转基因水稻细胞系和转基因水稻小植株中表达的资料。 也有报
导将选择标记基因 neo和报告基因 gus A共转化入水稻原生质体 [35 ]并建立了从原生质体
再生出可育的籼稻植株的体系。 但只有少数几位研究者给出了外源基因在遗传上传递给
子代的分子证据 [17 ]。 Jianying Peng[ 35]报导了籼稻转基因植株的产生以及外源 DNA在后
代中的遗传。 Takahiko Hayakawa等将 RSV CP基因导入两个粳稻品种 ,转基因植株高
效表达了 RSV CP并表现出对 RSV感染的显著抗性。而且观察到抗性能稳定地传递到转
基因植株的下一代中去。M. R. Davey等报导了台北 309水稻抗卡那霉素原生质体诱导的
愈伤组织再生成株以及 R0代 R1植株的表现型特征和分子鉴定。
综上所述 ,多数外源基因能在转基因水稻植株中稳定表达 ,外源基因在转基因水稻后
77第 3期　　王慧中　赵培洁　陈卫辉　王冀平: 禾木科作物基因转化研究进展
代中有遗传现象。
参考文献
1　 Greene, A. E. and Rich ard, F. A. Vi rology, 1996, 225( 1): 231～ 234
2　 Pruefer, D. J. Schmi tz, E. and Tack, B. Molecular and General Gen etics , 1997, 253( 5): 609～ 614
3　 He, X. H. Rao, A. L. N and Cream er, R. Ph ytopathology, 1997, 87( 3): 347～ 352
4　 Cooper, B and Dodds, J. A. Journal of General Vi rolog y, 1995, 76( 12): 3217～ 3221
5　 Cooper, B. Isabelle, S. and Rao, A. L. N. Vi rology, 1996, 216( 1): 208～ 213
6　 Hong, Y. Keith, S. and Martin, R. Vi rology, 1996, 220( 1): 119～ 127
7　 Fromm, M. E. and Morris , F. Bio /Tech nology, 1990, 8: 833～ 839
8　Wang, D. and Mil ler, P. D. Plant Cell Rep. 1989, 8: 329～ 332
9　 Stachel, S. E. Nature, 1985, 318: 624～ 629
10　 Rainer, D. M . and Bot tino, P. Bio / Tech nolohy. 1990, 8: 33～ 38
11　李宝健 ,欧阳学智 ,许耀 ,中国科学 B辑 . 1990, 20: 144～ 149
12　 Gould, J. Devey, M. and Hasegaw a, O. Plan t Physiol , 1991, 95: 426～ 434
13　 Bata, A. Hasezawa, S. and Syono, K. Plant Cell Ph ysiol. 1986, 27: 463～ 471
14　 Peng, J. Konon ow icz, H. and Hodges, T. K. Th eor. Appl. Genet. 1992, 83: 855～ 863
15　 Dat ta, S. K. Peterhans , A. Dat ta, K and Pot ryk us, I. Bio /Technolog y. 1990, 8: 736～ 740
16　 Ou-Lee, T. M . Turgeon, R and Wu, R. Proc. Natl. Acad. Sci. 1986, 83: 6815～ 6919
17　 Shimamo to, K. and Terada, R. Nature, 1989, 338: 274～ 276
18　 Toriyama, K. Arimoto, Y. and Uchimiya, H. Bio /Technolog y, 1988, 6: 1072～ 1074
19　钱迎倩 ,邹吉涛 ,张士波 ,王铁帮 .生物工程进展 , 1990, 52: 1～ 17
20　 Bow er, R. and Bi rch , R. G. Ph an t. J. 1992, 2: 409～ 416
21　 Go rdon-Kamm ,W . J. Spencer, T. M . and Mangan o,M . L. Plant Cell. 1990, 2: 603～ 618
22　V asi l, V . Cast ill o, A. M. and Fromm , M. E. Bio /Techn ology, 1992, 10: 667～ 674
23　 Duan X and Ch en S. China Ag ric. Sci. 1985, 3: 6～ 9
24　 Peng, Z, and Wu, R. Gene, 1986, 45: 247～ 252
25　 Sch el l, J. S. Science, 1987, 237: 1176～ 1183
26　 Dekeyser, R. Clae, B and M arichal, M . Plant Ph ysiol. 1989, 90: 217～ 223
27　 Zhang W and Wu R. Theor. Appl. Genet . 1988, 76: 835～ 840
28　 Mei jer, E. G. M and Ban, Iren , F. Plan t Cel l Rep. 1991, 10: 171～ 174
29　杨虹 ,李家新 ,郭三堆 ,陈学军 ,范云六 .中国农业科学 , 1989, 22( 6): 1～ 5
30　谢道昕 ,范云六 ,倪丕冲 .中国科学 B辑 , 1991, 8: 830～ 834
31　 Sun, C. S. Plant Cell Report s. 1989, 8: 313～ 316
32　 Harri s, R. Plan t Cel l Report s, 1988, 7: 337～ 340
33　 Srinivasan, C. Plant Ph ysiol, 1986, 126: 41～ 48
34　 Uchimiya, H. Fushimi , T. Hashim oto, H. and Harada, H. Gen. Genet. 1986, 204: 204～ 207
35　 Peng, J. Lyznik, L. A. Lee, L and Hodges , T. K. Plant Cel l Reports. 1990, 9: 168～ 172
ADVANCE IN THE GENETIC TRANSFORMATION OF
THE CROPS OF THE GRASS FAMILY
Wang Huizhong　 Zhao Peijie　 Cheng Weihui　Wang Jiping
( Department of biology)　　　　 ( Zhejiang Ins ti tute of Chin ese Medicine)　　　
Abstract
This a rticle discusses the latest resea rch results of the genetic t ransfo rmation o f the
78 杭　州　师　范　学　院　学　报　　　　　　　　 1998年
crops of the g rass family. And the autho r of this ar ticle thinks tha t a g reat prog ress has
been made in the research, but the resea rch lacks a set of model manipula tion.
Key words　 the grass fami ly. t ransfo rmation, Ag robacterium tumefaciens, pro to-
plast.
试谈实验室建设与素质教育
实验室是学生技能训练的主要场所 ,也是理论知识与实践操作的纽带。实验室建设 ,一般较重视硬件设施 ,这也无
可厚非。但如果因此忽略了思想道德建设 ,岂不离开了学校教育的根本。本文试就中等卫校实验室建设与素质教育的
关系 ,谈几点看法:
一、实验应是严谨求实的场所。教师在实验室不仅是“手把手”指导操作方法 ,更重要的还在于培养学生一丝不苟、
严谨求实的治学精神。对马虎应付的学习态度应给予教育批评 ,对华而不实的实验作风应及时纠正。实验是科学实践 ,
容不得点滴虚假。从这个意义上说 ,某一次实验的失败可以原谅 ,而弄虚作假的风气则务须杜绝。实验室正是培养学生
这一方面素质的理想场所。
二、实验室应是增强集体观念的基地。 随着科技的发展和现代仪器的日新月异 ,现代医疗卫生事业已不同于昔日
的个体行医 ,往往需要多学科协作 ,方能成功。实验室操作正可以在这方面给学生留下深刻印象 ,一个实验 (手术 )的成
功总是许多人齐心协力、共同配合的结果 ,有人“主刀” ,有人当配角 ,实验 (手术 )才能顺利进行 ;任何一个部位出差错 ,
实验都无法进行下去 ,让学生明白这个道理 ,至关重要。 所以说 ,实验室不仅是知识关联实践的钮带 ,亦应是发扬贡献
与奉献精神的“试验田” ,是教育学生增强集体观念的基地。
三、实验室应是求知探索的起跑线。 中等卫校的实验室 ,一方面应该不断添置新设备 ,让学生不断面对新技术、新
知识 ;另一方面则应该鼓励学生立志探索新知识 ,而后者尤为重要。 随着时代的发展和科技的进步 ,人体和天体一样 ,
许多未知的奥秘正在破译 ,许多疾病有待克服 ,许多细菌和病毒相继被发现和被相应的新药所抑制。凡此种种 ,在实验
中就要注意鼓励学生解放思想 ,在尊重科学的基础上勇于探索 ,敢于试验 ,把实验室当作获得新知识的起跑线。发明创
造往往垂青有探索精神的年轻人 ,发明创造不一定产生在这样的实验室里 ,但是这样的实验室却应该为未来的科学家
作必要的素质准备。
四、实验室应是培养精神文明的园地。 为了加强对学生的精神文明建设 ,实验室的环境布置首先应该做到洁净有
序、合理布局 ,贵重仪器加套保护 ,试剂瓶摆放整齐 ,瓶上标签款式一致、书写规范、字迹清晰。 在如此整齐洁净的环境
里实验 ,会使学生心灵受到“美”的薰陶。实验过程中要求学生养成规范操作、爱护公物、保持洁净的良好习惯。语言文
明、步履轻快、站位得当、动作默契 ,决非仅仅是为了实验室本身的权宜之计 ,它的深远意义还在于培养新一代“白衣战
士”的良好医德医风。
综上所述 ,中等卫生学校的实验室的任务和作用 ,绝不是单纯的实验场所 ,它同样肩负着培养学生综合素质的使
命。认识到这一点 ,将对实验室建议提出更高要求 ,使实验室也能成为学校思想教育工作中一个必不可少的组成部分。
(朱毓琴 )
79第 3期　　王慧中　赵培洁　陈卫辉　王冀平: 禾木科作物基因转化研究进展