全 文 ：第 20卷第 4期 孝感学院学报 (自然科学版 ) VOL. 20 NO. 4
2000年 11月 JOU RN AL OF XIAOGAN UNIV ERS ITY( Natural Sciences) NOV. 2000
分子标记在茄科蔬菜作物遗传育种研究中的应用
邹礼平
(孝感学院 农学系 ,湖北 孝感 432100)
摘 要: 综述了分子标记在茄科蔬菜作物遗传育种中应用的几个方面: 1)遗传图谱的构建 ; 2)种质资源研
究 ; 3)质量性状基因的定位和分子标记辅助选择 ; 4)数量性状基因的分析。
关键词:分子标记 ;茄科蔬菜 ;遗传育种
中图分类号: Q789; S641 文献标识码: A 文章编号: 1007- 1075( 2000) 04- 0078- 04
遗传标记在遗传学的建立和发展过程中有着
举足轻重的作用 ,同时也是作物遗传育种的重要工
具。直到十多年前 ,植物遗传育种中所用的标记大
多数还是基于形态性状的标记 ,这类标记数量有
限 ,而且要找到与目标性状相关的形态标记实际上
是较困难的。同工酶标记在过去的二三十年得到了
广泛的发展和应用 ,其分析手段较为简单 ,适合较
大群体的遗传分析 ,但缺点是能够使用的同工酶系
统的数量有限。近年来分子生物学技术的发展为植
物遗传育种提供了基于 DNA多态性的分子标记。
1 分子标记概述
与形态标记及同工酶标记相比 ,分子标记具有
明显的优越性: 大多数分子标记是共显性的 ,对隐
性的农艺性状的选择十分便利 ;基因组变异极其丰
富 ,分子标记的数量几乎是无限的 ;在发育的不同
阶段 ,不同组织的 DNA都可用于标记分析 ,使得
对植株基因型的早期选择成为可能。随着分子生物
学技术的发展 ,目前已经开发了多种基于 DNA多
态 性 的 遗 传 标 记 , 主 要 有: 1 ) RFLP 标 记
( Restriction Fragment Leng th Polymorphisms,限制
性片段长度多态性 ) ,是指用限制性内切酶酶切不
同个体基因组 DNA后 ,含同源序列的酶切片段在
长度上的差异。差异的显示和检测是用克隆的
DNA片段作为同源序列探针来进行的。 对于特定
的 DNA限制性内切酶组合 ,产生的片段是特异
的。 碱基序列不同的 ,或已发生缺失、插入、易位的
DNA会产生大小不同的限制片段。 2) RAPD
( Random Ampli fied Polymorphic DN A,随机扩增
多态性 DNA) ,是用随机序列组成的寡聚核苷酸作
为引物通过专门的 PCR反应扩增获得的长度不同
的多态性 DNA片段。 RAPD标记可转化为 RFLP
标 记。 3 ) AFLP ( Amplified Fragments Leng th
Polymo rphism,扩增片段长度多态性 ) ,指通过
PCR扩增基因组 DNA模板产生显示多态性的
DNA片 段。 4) SSLP ( Simple Sequence Leng th
Polymo rphism,简单序列长度多态性 ) ,是指微卫星
DNA由于重复次数不同以及重复程度的不完全而
造成的每个座位的多态性。 5) STS ( Sequence-
Tagged Sites,序列标记位点 ) ,是指一段长度为 200
～ 500bp的序列所界定的位点 ,在基因组中只出现
一次。任何单拷贝的多态性标记都可作为基因组的
界标 ( Landmark)而转变为 S TS标记。
茄科蔬菜是重要的蔬菜作物 ,分子标记技术作
为一项非常有希望的新技术 ,已开始广泛应用于包
括茄科蔬菜在内的许多作物的遗传育种研究。
收稿日期: 2000- 07- 06
作者简介: 邹礼平 ( 1967- ) ,男 ,湖北汉川人 ,孝感学院农学系讲师 ,农学硕士。
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2 遗传图谱的构建
遗传图谱是遗传研究的重要内容 ,又是种质资
源、育种及基因克隆等许多应用研究的理论依据和
基础。随着以 RFLP为代表的分子标记的出现 ,遗
传作图在许多物种中得到了飞速发展。在植物中已
分别发表了玉米、水稻、小麦等许多种植物的分子
图谱 ,其中有些图谱包含了上千个分子标记 [1 ]。 在
蔬菜作物中目前已有 17种作物构建了遗传图谱。
构建遗传图谱的主要步骤包括: 1)根据遗传材料之
间的多态性确定亲本组合 ,建立作图群体 ; 2)对群
体中不同植株或品系的标记基因型进行分析 ; 3)确
定标记间连锁群。其中构建永久性分离群体是作图
成功和高效的关键。在茄科蔬菜作物中 ,番茄作为
一种模式植物 ,其遗传图谱上的标记较为饱和。 近
缘植物的同源性为蔬菜作物分子标记遗传图谱的
创建提供了极大的便利 ,因为构建图谱所用的探针
和引物可以比较方便地从亲缘关系较近的作物或
模式植物中移植。 例如 ,马铃薯和辣椒图谱上的
RFLP探针大都来自番茄。 目前 ,蔬菜作物遗传作
图的趋势是高饱和化、实用化和通用化。高饱和化
即增加图谱上标记的密度 ,高密度的遗传图谱有助
于克隆基因和精确解析数量性状基因。实用化即遗
传图谱可以直接应用到作物育种中 ,利用遗传图谱
导入野生种的有益等位基因在番茄中被证明是非
常成功的。通用化即遗传图谱的信息可以在种内甚
至种属间交流 ,而不局限于作图亲本。要想将分子
标记遗传图谱更广泛地应用在茄科蔬菜作物育种
实践中 ,有两个迫切需要解决的问题: 一是除番茄
和马铃薯以外 ,大多数蔬菜作物图谱上的标记还需
饱和 ,二是目前图谱上的标记主要为 RFLP标记 ,
其技术较为复杂 ,需要的 DNA多 ,不易进行大量
单株的鉴定 , 需要将其转化为易操作的 PCR标记
如 STS标记或增补 PCR标记如 RAPD标记和
SSR( Simple sequence repeat )标记等。
3 种质资源研究
种质资源是遗传育种研究的原材料。虽然世界
各国搜集了大量的种质资源 ,据不完全统计 ,全世
界搜集的番茄和马铃薯种质资源约有 74000份 ,但
鉴定和利用它们的手段还十分有限。用传统的表现
型鉴定法从种质资源中发现的有益基因甚少 ,而由
于许多有重要经济价值的有益基因与不利基因连
锁 ,使其难以通过传统的资源鉴定方法来发现。 现
代分子标记技术的迅速发展为解决这些难题提供
了全新的手段。
在种质资源鉴定方面 ,分子标记可以用来绘制
蔬菜品种、品系的指纹图谱。如 Weising利用 SSR
探针 ( GATA) 4检测出 15个番茄栽培品种的差
异。 而 Bredemeijer等 ( 1998)则利用半自动荧光微
卫星分析方法对番茄品种进行鉴别。分子标记也是
检测种质资源遗传多态性的有效工具。 Lefebrv e等
( 1992)用 RFLP标记证明甜椒的多态性远低于辣
椒 ,这说明甜椒的遗传背景更为狭窄 ,因而在育种
上较难取得突破。 在通过远缘杂交、细胞融合和诱
变等手段创新种质资源时 ,分子标记更是鉴定创新
性的重要依据。 Porvan等 ( 1996)用 SSR标记来鉴
定马铃薯的种内体细胞杂种 ,这种方法可用愈伤组
织检测并且可以自动化操作 ,从而可以大大节省常
规检测方法所需要的时间和费用。
在种质资源的利用方面 ,分子标记不但可以辅
助准确地导入野生材料的单个优良质量性状基因 ,
减少连锁累赘 ,而且可以发现和导入控制产量和品
质等重要农艺性状的优良数量性状基因位点
( Quantitative t rait loci, QTL)。
4 质量性状基因的定位和分子标记
辅助选择
蔬菜作物的许多重要的农艺性状表现为质量
性状遗传的特点 ,如抗病性、育性等。利用分子标记
可对这些性状进行早期、间接、准确的选择 ,克服根
据表型选择的一些弱点。近年来 ,蔬菜作物中有许
多重要的质量性状基因已被标记 ,并已经在育种实
践中应用 ,即所谓分子标记辅助选择 ( Marker -
assisted selection, MAS)。
标记目标质量性状的方法基本有 3种 ,即近等
基因系法 ( Near isogenic lines, NILs)、分离群体分
组分析法 ( Bulked seg regant analysis, BSA)和作图
法。N ILs是除目标性状位点不同外 ,其余基因位点
都基本相同的品系 ,多通过回交或诱变形成 ,这种
方法是在相同的背景下找差异。 BSA是在分离世
代中将具有相同目标性状的个体混合 ,创造出类似
近等基因系遗传组成的两份 DNA混合物。只要有
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分子标记在茄科蔬菜作物遗传育种研究中的应用
分离群体和易鉴别的表型 ,就可以通过 BSA找到
相关的标记。这种优越性使该方法在标记目标质量
性状的应用中越来越普遍。作图法即根据已有的连
锁图进行标记 ,一旦发现目标基因定位于某一染色
体上 ,就可选择分散在该染色体上不同位点的标记
逐渐逼近 ,很快可以找到与目标基因紧密连锁的标
记。
质量性状的基因定位相对简单 ,它可在已经知
道目标基因位于某一染色体或连锁群上的前提下 ,
选择该连锁群上不同位置的标记与目标基因进行
连锁分析。显然 ,该方法的效率偏低 ,且由此定位的
目标基因与标记间的距离取决于所用连锁图上的
标记密度。另外 ,它不适合尚无连锁图或连锁图饱
和程度较低的作物。
利用 N ILs已定位了许多质量性状基因 ,如番
茄抗烟草花叶病毒基因 Tm- 2a和番茄抗细菌病
毒基因等 。需要指出的是 ,由于连锁累赘 ( Linkage
Dragging ) ,即在成对 N ILs间有差异的目标基因区
段可能还连锁着其它有差异的 DNA区段 ,有时在
N ILs中揭示的有多态性的标记位点可能与目标基
因相距较远 ,甚至还可能位于不同的连锁群上。
分子标记辅助选择技术在番茄和马铃薯抗病
虫育种中得到了广泛的应用。据统计 ,目前在番茄
中已找到了与 20余个抗病虫基因连锁的分子标
记 [3 ]。在这些标记中 ,有的与基因之间的距离很近 ,
如 Tm- 2a基因被定位于第 9染色体 ,位于分子标
记 TG207和 GP125A之间 ,两边的距离仅为 0.
05cM ,而分子标记 R12则与 Tm- 2a基因共分离。
Martin等通过比较两个番茄近等基因系 RAPD的
多态性 ,鉴定出与抗 Pseudomonas的基因 ( Pto )紧
密连锁的 DNA片段 ( S47、 R110和 RS120) ,并将
该基因定位在番茄的第 5染色体的连锁图中。由于
分子标记与目标性状基因紧密连锁 ,因此可用于对
目标性状进行辅助选择 ,目前已有一些番茄抗病性
状通过分子标记辅助选择的方法得到了改良。例如
许多种子公司利用跟抗线虫基因 (Mi )位点紧密连
锁的分子标记 ( Aps- 1) ,已经成功地将抗线虫基
因转入到不同的番茄材料中。这种选择方法可以大
大缩短选育的时间 ,例如利用 Tm- 2基因两侧遗
传距离为 1cM的 RFLP标记 ,只用两代就可以获
得导入基因片段仅为 2cM含 Tm - 2基因的植株 ,
而用常规育种的方法则至少需要 100代才能得到
同样的结果。在马铃薯中 , Hamalainen等 ( 1997)利
用 RFLP标记对抗马铃薯病毒 Y的基因 Ryadg进
行了作图和分子标记辅助选择。
在抗逆性方面 , Foolad等 ( 1999)对番茄耐盐性
状进行了 RFLP作图 [4 ]。
分子标记辅助选择技术还可用于品质育种。
Chetelat等 ( 1995)利用分子标记辅助选择将在 L .
chmielewskii中发现的一种酸性蔗糖酶缺失基因
(sucr )导入到普通番茄中 ,明显地提高了果实的可
溶性固形物含量、可滴定酸度和番茄酱的产出率。
Zhang等 ( 2000)用 N ILs和 BSA方法对两个影响
番茄果实 β- carotene积累的 B、 MoB基因进行了
RAPD和 AFLP分析 [ 5]。
质核互作雄性不育系是理想的杂交制种方式 ,
但在许多蔬菜作物中 ,恢复系并不普遍存在。例如 ,
甜椒品系中很少发现恢复系 ,要培育甜椒雄不育
系 ,就需要向父本材料中导入恢复基因。常规的回
交育种方法每一代都需要与不育系测交以确定分
离世代单株的基因型 ,而利用与恢复基因紧密连锁
的标记就可以省去测交这一步 ,使育种效率提高一
倍。
5 数量性状基因的分析
蔬菜作物大多数重要的农艺性状 ,如产量、品
质、熟期等均表现数量性状的遗传特点 ,即受许多
数量基因座位 ( QTLs)和环境因子的共同作用。 数
量性状是传统育种的难点 ,是育种效率的主要制约
因素。长期以来 ,数量遗传学是以统计推理为基础
的 ,即将控制数量性状的多基因作为一个整体 ,通
过数理统计学的一级和二级统计量来剖析描述
QTLs的遗传特征。 这无法确定控制数量性状的
QTLs的数目 ,更无法确定单个 QTL的遗传效应
以及它们在染色体上的位置。如果能将多基因性状
分解成若干个单一的遗传组分 ,则可实现用研究单
基因的方法去研究 Q TLs,并进而可定位乃至克隆
QTLs。许多学者运用传统标记在不同生物上进行
了类似的研究 ,但由于所用的常规标记的局限性 ,
难以实现对单个 QTL的遗传效应的追踪。 近年
来 ,由于分子标记技术的迅速发展特别是完整遗传
连锁图谱的建立 ,人们能够将数量性状分解成易为
遗传育种工作者操作的单个的位点即 Q TL进行
研究。 目前 , QTLs分析已成为蔬菜作物分子标记
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邹礼平
研究和应用的热点之一。
QTL技术在番茄和马铃薯遗传育种中应用最
为广泛 ,已取得了一些传统育种难以取得的成果。
Paterson等 ( 1988)和 Azanza等 ( 1994)利用 RFLP
标记筛选到一些 与可溶性固形物含量相关的
QT L位点 ,并发现其主效位点位于番茄的第 7染
色体上 ,这些标记可用来进行辅助选择。 Doganlar
等 ( 2000)利用 RAPD标记对两个与番茄果实熟期
缩短有关的数量性状位点进行了作图。 Grandillo
等 ( 1999)对影响果实大小和果形的数量性状位点
进行了识别。 Vanden Berg等 ( 1996)利用 RFLP标
记对马铃薯块茎形成进行了 Q TL分析。 Schauml
等 ( 1998)对马铃薯块茎产量和淀粉含量进行了
QT L分析。 Tanksley ( 1996)针对数量性状的改良
提出了一种 新的育种策略 ,即高世代回交群体
QT L 分 析 方 法 ( Advanced backcross Q TL
analysis) ,这 种方法将发现 Q TL的过程和育种实
践更紧密地结合在一起 ,并且还可同时对多个性状
进行改良 ,从而加快了育种的进程 [6 ]。他将野生种
L. hirsutum的特异 QTL导入到加工番茄品种
E6203中 ,使其产量增加 48% ,可溶性固形物含量
增加 22% ,茄红素含量增加 33% ,并且这些结果经
过了各种生产环境的考验 ,而传统育种只能使这些
性状指标每年以 1%的速度增长。 Bernacchi等
( 1998)用该方法同时对番茄的 7个数量性状进行
了分析与改良 ,并且成功地将多毛番茄和醋栗番茄
的有益基因导入到普通番茄中 ,得到了一批可溶性
固形物含量较对照高 6% ～ 22%的材料。
综上所述 ,分子标记技术的进一步发展和在茄
科蔬菜作物上的应用 ,将促使对茄科蔬菜作物遗传
基础的更深入了解 ,促进目标基因在品种间的转
移 ,使得茄科蔬菜作物种质资源的管理、利用和新
品种的选育变得更加有效 ,极大地推动茄科蔬菜作
物的育种进程。
[参 考 文 献 ]
[ 1] 陆朝福 ,朱立煌 .植物育种中的分子标记辅助选择 [ J].生物工程进展 , 1995, 15( 4): 11- 17.
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Appl ication of Molecular Marker in the Study
of Genetics and Breeding of Vegetables of Solanceae
ZOU Li- ping
(Department of Agronom y , Xiaogan University , X iaogan, Hubei 432100,China)
Abstract: This paper review s the several aspects of application of molecular marker on the genetics and
breeding of v egetables of solanceae: 1) const ruction of genetic map; 2) research of germplasm resources; 3)
localization and molecular ma rker- assisted selection of quali tativ e t rait g ene; 4)analysis of quantitativ e trait
loci.
Key Words: molecular marker; vegetables of solanceae; g enetics and breeding
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分子标记在茄科蔬菜作物遗传育种研究中的应用