全 文 ：南京农业大学学报 2016，39(3) :408－416 http:/ /nauxb．njau．edu．cn
Journal of Nanjing Agricultural University DOI:10．7685 / jnau．201511036
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收稿日期:2015－11－20
基金项目:国家自然科学基金项目(30670008，31372365)
作者简介:王志伟，教授。* 通信作者:纪燕玲，讲师，研究方向为植物微生物学，E-mail:yanlingji@ njau．edu．cn。
王志伟，张晨炜，詹漓晖，等． 禾本科植物内生真菌研究 19:圆柱披碱草内生真菌的系统发育学研究［J］． 南京农业大学学报，2016，39(3) :
408－416．
禾本科植物内生真菌研究 19:圆柱披碱草
内生真菌的系统发育学研究
王志伟1，2，张晨炜1，詹漓晖1，亢燕1，纪燕玲1*
(1． 南京农业大学生命科学学院，江苏 南京 210095;2． 海南丰源无公害农业技术研究所，海南 海口 570207)
摘要:［目的］本文旨在确定圆柱披碱草(Elymus cylindricus)内生真菌的分类地位。［方法］选择 5株分离自新疆、青海的圆
柱披碱草内生真菌菌株，采用 SDS法提取基因组 DNA，利用选择性引物对其 tubB和 tefA基因片段进行扩增和克隆测序，下
载 NCBI中的相似序列并进行比对分析，用 MEGA 6．0软件构建系统发育树。［结果］成功获得差异极小的各菌株序列，且
tubB序列确认为仅 1个拷贝，而 2个菌株的 tefA序列则有 2个拷贝。在最大简约树上披碱草菌株的 tefA 和 tubB 第 1 拷贝
均在 EBY(Epichlo bromicola /E. yangzii)大支上，与 E. sinica比较接近;tefA的第 2拷贝与 ETC(E. typhina complex)中的成员
聚类。［结论］Epichlo sp. -Elymus cylindricus是一个新的共生体组合。圆柱披碱草分离菌株为杂交起源的 Epichlo 属真
菌，可能起源于 E. bromicola(syn. E. yangzii)和 E. sylvatica间的杂交。
关键词:圆柱披碱草;Epichlo属真菌;tubB;tefA;系统发育分析
中图分类号:Q939．5 文献标志码:A 文章编号:1000－2030(2016)03－0408－09
Grass endophyte researches 19:phylogenetic properties of
endophytic fungi obtained from Elymus cylindricus
WANG Zhiwei1，2，ZHANG Chenwei1，ZHAN Lihui1，KANG Yan1，JI Yanling1*
(1． College of Life Sciences，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China;
2． Fengyuan Institute of Frontier Technologies for Agriculture(FIFTA)，Haikou 570207，China)
Abstract:［Objectives］To identify the endophyic strains obtained from Elymus cylindricus，phylogenetic analysis were conducted．
［Methods］Five fungal strains were incubated． Then their genomic DNA samples were extracted by SDS extraction method． Fragments
of β-tubulin(tubB)and translation elongation factor 1-α(tefA)genes were amplified by specific PCＲ primers for isolated strains．
Ｒelated sequences of tubB and tefA were downloaded from NCBI，then were aligned and analyzed by DNAssist and BioEdit． The
phylogenetic characteristics of these strains were analyzed through the Maximum Parsimony tree performed by MEGA 6．0．［Ｒesults］
All the sequence were nearly similar． Five strains were confirmed to possess single alleles of tubB，while 2 of them had 2 alleles of tefA．
In the tree based on tubB fragment，they clustered together with Epichlo sinica within EBY(Epichlo bromicola /E. yangzii)clade． In
the tree based on tefA fragment，allele-1 were grouped with E. sinica，while allele-2 within the ETC(E. typhina complex)clade．
［Conclusions］They might be a new association of hybrid Epichlo sp. -Elymus cylindricus symbiosis. Strains obtained from Elymus
cylindricus could origin from hybridization of E. bromicola (syn. E. yangzii)and E. sylvatica．
Keywords:Elymus cylindricus;Epichlo;tubB;tefA;phylogenetic analysis
禾本科植物内生真菌，因其独特的生态类型和丰富的代谢产物，受到越来越多的关注。其中最受关注
的冷季型禾草 epichloae真菌包括 Epichlo 属及其无性型 Neotyphodium 属［1］。Glenn 等［2］利用 18S rDNA
的序列信息将其从 Acremonium属中独立出来，建立了 Neotyphodium Glenn，Bacon et Hanlin 属。目前，Neo-
typhodium属已被合并入 Epichlo属。然而，与其他真菌相比，Epichlo属真菌的种间形态学特征一般差别
不大［1］。
目前，Epichlo属真菌的种的鉴定主要根据经典分类学特征和系统发育学特征［3］进行，用于系统发育
学研究的主要基因片段有 tubB、tefA 和 actG 等［4－5］。随着研究的深入，同工酶图谱、微卫星序列等，结合
tubB、tefA等基因片段的系统发育学信息相继被应用于该属真菌的分类学当中，新种不断被发现。由于多
第 3期 王志伟，等:禾本科植物内生真菌研究 19:圆柱披碱草内生真菌的系统发育学研究
数原Neotyphodium属成员中具有 2 ～ 3 个拷贝的 tubB、tefA 等基因片段，它们被认为是不同有性 Epichlo 属
成员的杂交后代［6］。至今，已有报道的原 Neotyphodium属真菌共有 24个种和 4个变种［1，7］。
披碱草(Elymus spp．)是分布于北半球寒温带地区的优良牧草［8］。我国披碱草主要分布于东北、内蒙
古、四川北部一线以北的西北和东北地区，从 20世纪 70年代开始披碱草被推广栽培。由于其对环境要求
不严，且适应性强，具有抗旱、抗盐、抗寒及产草量高等特点，因此能在种植后第 2 年迅速建植。披碱草已
成为北方退化草原重要的补播草种，能够增加草地的覆盖率，是目前我国西北和华北牧区重要的牧草之
一，目前栽培面积呈扩大趋势。
对披碱草属植物内生真菌的研究工作起始于美洲地区，White［9－10］报道披碱草中含有内生真菌。加拿
大披碱草(El. canadensis)、El. hystrix、El. villosus、El. virginicus 等披碱草均被报道含有 Epichlo elymi［11］。
Charlton等［12］从 El. canadensis分离到具有杂交起源的 E. canadensis。我国研究人员已经完成披碱草属植
物内生真菌的资源调查和分离工作［13－14］，并对其分离菌株的 act、tubB、tefA基因进行了研究［15－16］。但目前
还没有对圆柱披碱草中内生真菌系统发育学特征及其杂交起源的详细探讨。本文利用 tefA 和 tubB 基因
的片段，对来自我国西北地区圆柱披碱草内生真菌的代表菌株进行系统发育学特征分析，确定其基因拷贝
数，并探讨其起源。
1 材料与方法
1．1 供试菌株的培养和基因组 DNA的提取
选取 5个圆柱披碱草样品分离菌株:Exn8101和 Exn8102 来自于青海省西宁市开发区;Exn8201 来自
于青海省西宁市植物园;Exj8101和 Exj8102来自于新疆阜康市天池风景区。从保存菌种的斜面挑取菌丝
转接到 PDA平板上，室温培养 10～15 d，直到菌落直径达 3～4 cm时收集菌丝，转接到 GY液体培养基上，
25 ℃、150 r·min－1培养 20～25 d。
采用 SDS法提取内生真菌的基因组 DNA［17］，提取到的基因组 DNA于 4 ℃冰箱中保存备用。
1．2 PCＲ扩增
PCＲ扩增片段为 tubB基因的 1～3 内含子(上游 tubB-4u，下游 tubB-1d)和 tefA 基因的 1 ～ 4 内含子。
PCＲ扩增反应所用试剂购自宝生物(大连)工程有限公司。反应程序为:94 ℃ 3 min;94 ℃ 45 s，57 ℃
45 s，72 ℃ 75 s，共 35个循环;72 ℃ 10 min。扩增产物立即电泳检测或者 4 ℃保存备用。PCＲ 扩增所用
引物见表 1。
表 1 PCＲ扩增 tubB和 tefA基因片段的引物及选择性扩增引物
Table 1 PCＲ primers and selcetive amplification primers used for tubB and tefA amplification
引物
Primer
引物方向
Primer direction
序列
Sequence(5→3)
来源
Origin
用途
Application
tubB-4u 上游 Up TGGTCAACCAGCTCAGCACC 文献［18］ Ｒeference［18］ A
tubB-1d 下游 Down GAGAAAATGCGTGAGATTGT 文献［18］ Ｒeference［18］ A
tefA-6u 上游 Up CGGCAGCGATAATCAGGATAG 文献［18］ Ｒeference［18］ A
tefA-1d 下游 Down GGGTAAGGACGAAAAGACTCA 文献［18］ Ｒeference［18］ A
KF-6U 上游 Up GTTCGAGAAGGTGAGATATATC 文献［19］ Ｒeference［19］ SA
KF-4D 下游 Down TCGAGAAGGTGAGATATATCTC 文献［19］ Ｒeference［19］ SA
注:A为简并引物 Degenerate primer;SA为选择性扩增引物 Selcetive amplification primer
1．3 相关序列的克隆与测序
PCＲ产物经电泳检测，切胶回收到清晰和单一的目的片段。通过目的 DNA片段和 pMD19－T载体的
连接，将载体质粒转化到 E. coli DH5α感受态细胞，送交华大基因公司测序。
1．4 序列的分析
用于系统发育分析的其他菌株序列及相关资料均来自 NCBI。首先把其中供试菌株测序的结果在
GenBank中进行 BLAST，得到数据库中 epichloae真菌的 tubB和 tefA序列，每个种选择 2～3 个不同宿主植
物、不同地理位置的代表性菌株，下载后整理成 FASTA格式的文件。
采用 3种生物学软件对测得的序列进行分析:1)DNAssist version 2．2［20］用于序列碱基的对比。将测
序得到的 2 条序列，通过比对整理获得完整的序列，找出不同序列间的差别碱基。2)采用 BioEdit
7．0．5．3［21］进行序列的多重比对，并调整序列长度，使进行系统发育分析的序列长度基本一致。3)采用
904
南 京 农 业 大 学 学 报 第 39卷
MEGA 6．0［22］构建系统发育树，运算 1 000次，绘制出所选供试菌株的最大简约系统发育树(MP) ，并对系
统发育树进行标注及分析。
2 结果与分析
2．1 目的基因片段的 PCＲ扩增产物的回收和克隆
采用 SDS法提取足够的真菌总 DNA，琼脂糖电泳检测条带清晰，获得约 23 kb 的菌株总 DNA。合成
相关引物(表 1)进行 PCＲ扩增，各菌株都获得了 tefA基因的第 1 拷贝，扩增片段约 850 bp(图 1－A)。利
用选择性引物对菌株的 tefA基因第 2拷贝进行 PCＲ扩增，得到 Exn8101、Exn8102、Exn8201、Exj8101 菌株
tefA基因第 2拷贝的条带，约 600 bp(图 1－B)。
图 1 tefA第 1拷贝(A)和第 2拷贝(B)扩增图谱
Fig. 1 PCＲ production of tefA gene allele-1(A)and allele-2(B)
A:M．Marker;1．Ｒjl7101;2．Ｒjl7104;3．Exn8101;4．Exn8102;5．Exn8201;6．Exj8101;B:M．Marker;1．Ｒjl7101;2．Ｒjl7104;3．Exn8101;4．Exj8101
图 2 tubB第 1拷贝扩增图谱
Fig. 2 PCＲ production of tubB allele-1
M． Marker;1． Ｒjl7101;2． Ｒjl7104;3． Exn8101;4． Exn8102;
5． Exn8201;6． Exj8101;7． Exj8101;8． Exj8102
PCＲ扩增没有得到 tubB基因片段的第 2拷贝，通
过 PCＲ 直接测序能够获得 tubB 第 1 拷贝清晰的峰
图，扩增片断约 750 bp;但确认供试菌株 tubB 基因没
有多拷贝(图 2)。
经测序获得全部 5个菌株的 tefA及 tubB基因第 1
拷贝、2个菌株(Exn8101、Exj8101)的 tefA基因第 2 拷
贝序列。
2．2 获得目的基因片段序列的分析
对测得的菌株序列在 NCBI数据库中进行 BLAST
搜索，结果表明测得的序列与 Epichlo属内生真菌相关序列的相似度最高(表 2)。同时对菌株序列之间
的差异进行了比对:用于系统发育分析的 tefA 和 tubB 基因序列相似度非常高，圆柱披碱草植物分离菌株
之间 tefA序列第 1拷贝之间也只存在 8个碱基的差异，tubB序列第 1拷贝则更为保守，只相差 4个碱基。
通过 NCBI数据库进行序列比对，并选择序列相似度最高的各种代表性菌株的序列构建 MP 系统发
育树。
表 2 Epichlo属菌株的 tubB和 tefA基因序列
Table 2 tubB and tefA sequence of Epichlo strains
菌种
Species
菌株
Strain
宿主
Host species
族
Host tribe
起源
Geographic origins
NCBI序列号
NCBI accession No．
tubB tefA
E. amarillans 906 Agrostis perennans Agrostideae AF457467 AF457506
E. amarillans ATCC200743 Sphenopholis obtusata Agrostideae 美国 USA L06958 AF231191
E. baconii ATCC200745 Calamagrostis villosa Agrostideae 瑞士 Switzerland L78270 AF231196
E. baconii ATCC76552 A． stolonifera Agrostideae 英国 Britain L06961 AF231193
E. brachyelytri ATCC200752 Brachyelytrum erectum Brachypodieae 美国 USA L78271 AF231197
E. brachyelytri ATCC201561 B． erectum Brachypodieae 美国 USA AF062427 AF231200
E. bromicola 9630 Bromus erectus Bromeae 瑞士 Switzerland AY033382 AY033356
E. bromicola 9633 Br. erectus Bromeae 瑞士 Switzerland AY033385 AY033359
E. clarkii ATCC200741 Holcus lanatus Poeae AF250738 AF231207
E. clarkii ATCC200742 H. lanatus Poeae 瑞士 Switzerland L78281 AF231206
E. elymi ATCC200850 Elymus virginicus Triticeae 美国 USA L78273 AF231208
014
第 3期 王志伟，等:禾本科植物内生真菌研究 19:圆柱披碱草内生真菌的系统发育学研究
续表 2 Table 2 continued
菌种
Species
菌株
Strain
宿主
Host species
族
Host tribe
起源
Geographic origins
NCBI序列号
NCBI accession No．
tubB tefA
E. elymi ATCC201554 El. villosus Triticeae 美国 USA AF250742 AF457503
E. festucae ATCC201550 Festuca rubra
subsp． commutata
Poeae 欧洲 Europe L06957 AF231211
E. festucae ATCC90661 F． rubra var． rubra Poeae L06955 AF231210
E． glyceriae ATCC200747 Glyceria striata Meliceae 美国 USA L78275 AF231216
E． glyceriae ATCC200755 G． striata Meliceae 美国 USA L78276 AF231217
E. sylvatica ATCC200748 Brachypodium sylvaticum Brachypodieae 日本 Japan L78278 AF231218
E. sylvatica ATCC200751 Bra． sylvaticum Brachypodieae 瑞士 Switzerland L78291 AF231219
E. typhina ATCC200738 Anthoxanthum odoratum Aveneae 瑞士 Switzerland L78288 AF231222
E. typhina ATCC200739 Bra． pinnatum Brachypodieae 瑞士 Switzerland L78292 AF231223
E. typhina ATCC200740 Dactylis glomerata Poeae 瑞士 Switzerland L78274 AF231225
E. typhina ATCC200851 Phleum pratense Agrostideae 瑞士 Switzerland L78280 AF231226
E. typhina ATCC201666 Poa silvicola Poeae 瑞士 Switzerland L78285 AF231228
E. typhina ATCC201667 P． nemoralis Poeae 瑞士 Switzerland AF062429 AF231229
E. typhina ATCC201669 P． pratense Poeae 瑞士 Switzerland L78284 AF231231
E. typhina E432 Lolium perenne Poeae 法国 France AF250752 AF231221
E. yangzii Ｒnj3302 Ｒoegneria kamoji Triticeae 中国 China DQ134036 DQ134030
E. yangzii Ｒnj4201 Ｒ. kamoji Triticeae 中国 China DQ134039 DQ134033
E. yangzii Ｒnj4301 Ｒ. kamoji Triticeae 中国 China DQ134040 DQ134034
Epichlo sp． 9924 Holcus mollis Poeae 美国 USA AF457469 AF457507
E． aotearoae CBS109344 Echinopogon ovatus Aveneae 新西兰 New Zealand
澳大利亚 Australia
AF323370 AF323391
E． australiensis CBS109346 /937 Ec． ovatus Aveneae 澳大利亚 Australia AF323379
AF323381
AF323400
AF323402
E． chisosa ATCC 64037 /134 Stipa eminens
(=Achnatherum
eminens)
Stipeae 北美
North America
AF457471
AF457470
AF457472
AF457509
AF457508
AF457510
E． coenophiala ATCC 90664 /e19 L． arundinaceum Poeae 日本 Japan L06964
L06951
X56847
AF457511
AF457512
E． gansuensis E7082 Achnatherum inebrians Stipeae 中国 China EF422757
E． gansuensis E7080 A． inebrians Stipeae 中国 China EF422756
E． inebrians ATCC MYA-1187/817 A． inebrians Stipeae 欧亚 Eurasia AF457494 AF457538
E． inebrians ATCC MYA-1228/818 A． inebrians Stipeae 欧亚 Eurasia AF457495 AF457539
E． guerinii CBS 112036 Melica ciliata Meliceae 法国 France EF422754
EF422755
E． guerinii ATCC MYA-1235 M． transsilvanica Meliceae 瑞士 Switzerland EF422746
EF422747
E. typhina subsp．
poae var． huerfana
ATCC 64040 Festuca arizonia Poeae 北美
North America
AF457493 AF457537
E. festucae var． lolii 135 L． perenne ssp． perenne Poeae 欧洲 Europe，
新西兰 New Zealand
AY865628 AF457540
E. melicicola CBS109342 /827 M． decumbens Meliceae 非洲 Africa AF323384
AF323386
AF323406
E． occultans 992 L．perenne var． rigidum Poeae 新西兰
New Zealand
AF176271
AF176275
AF457542
AF457541
E． siegelii ATCC 74483 /e915 L． pratense Poeae 欧洲 Europe AF308138
AF308139
AF308132
AF308133
E． tembladerae ATCC 200844 /1169 P． huecu Poeae 北美
North America
AF323389
AF323390
AF323407
AF323408
E． tembladerae 4055 F． arizonica Poeae 北美
North America
AF457496
AF457497
AF457545
AF457544
E. typhina subsp．
poae var． canariense
989 L． edwardii Poeae 西班牙 Spain AF176266 AF457543
E． uncinata CBS102646 L． pratense Poeae 欧洲 Europe L06946 AF308131
E． stromatolonga Cnj6611(AS5．904) C． epigeios Agrostideae 中国 China EU526823 EU526818
114
南 京 农 业 大 学 学 报 第 39卷
续表 2 Table 2 continued
菌种
Species
菌株
Strain
宿主
Host species
族
Host tribe
起源
Geographic origins
NCBI序列号
NCBI accession No．
tubB tefA
E． stromatolonga Cnj6617 C． epigeios Agrostideae 中国 China EU526824 EU526820
E. liyangensis Ply9201 P． pratensis ssp．
pratensis
Poeae 中国 China HM475156
HM475160
HM475168
HM475164
E. liyangensis Ply9202 P． pratensis ssp．
pratensis
Poeae 中国 China HM475157
HM475161
HM475169
HM475165
E． sinofestucae Fnj4602 F． parvigluma Poeae 中国 China FJ211211
FJ211212
FJ211201
FJ211202
E． sinofestucae Fnj6606 F． parvigluma Poeae 中国 China FJ211219
FJ211220
FJ211209
FJ211210
E. sinica Ｒxy6106 Ｒ. kamoji Triticeae 中国 China EU409305
EU409308
EU409303
FJ189478
E. sinica Ｒts2102 Ｒ. kamoji Triticeae 中国 China EU409307
FJ189479
EU409301
FJ189476
E. sinica Ｒjl7101 Ｒ. canina Triticeae 中国 China GU447303 GU447305
E. sinica Ｒjl7104 Ｒ. canina Triticeae 中国 China GU447304 GU447306
GU447307
E. canadensis CWＲ 5 El. canadensis Triticeae 北美
North America
JN886778
JN886777
JN886775
JN886776
E. bromicola NI_201201 El. excelsus Triticeae 中国 China KJ585731 KJ585716
E. bromicola NI_201203 El. excelsus Triticeae 中国 China KJ585732 KJ585717
E. bromicola NI_201206 El. tibeticus Triticeae 中国 China KJ585733 KJ585718
E. bromicola NI_201208 El. dahuricus Triticeae 中国 China KJ585734 KJ585720
E. bromicola NI_201209 El. tangutorum Triticeae 中国 China KJ585735 ND
E. bromicola NI_201210 El. tangutorum Triticeae 中国 China KJ585736 KJ585721
E. bromicola NI_201213 El. tangutorum Triticeae 中国 China KJ585737 KJ585722
E. bromicola NI_201214 El. excelsus Triticeae 中国 China KJ585738 KJ585723
E. bromicola NI_201216 El. tangutorum Triticeae 中国 China KJ585739 KJ585724
E. bromicola NI_201218 El. excelsus Triticeae 中国 China KJ585740 KJ585725
E. bromicola NI_201221 El. tangutorum Triticeae 中国 China KJ585741 KJ585726
E. bromicola NI_201222 El. cylindricus Triticeae 中国 China KJ585742 KJ585727
E. bromicola NI_201302 El. nutans Triticeae 中国 China KJ585743 KJ585728
E. bromicola NI_201306 El. dahuricus Triticeae 中国 China KJ585744 KJ585729
E. bromicola NI_201308 El. cylindricus Triticeae 中国 China KJ585745 KJ585730
E. bromicola NI_201207 El. tangutorum Triticeae 中国 China ND KJ585719
E. bromicola AL0814 /1 El. repens Triticeae 亚洲 Asia GU325782 KC296739
Epichlo sp． * Exj8101
Exj8102
Exn8102
Exn8201
Exn8101
(CGMCC 3．13631)
El. cylindricus
El. cylindricus
El. cylindricus
El. cylindricus
El. cylindricus
Triticeae
Triticeae
Triticeae
Triticeae
Triticeae
中国 China
中国 China
中国 China
中国 China
中国 China
HM042855
HM042856
HM042858
HM042859
HM042860
HM042861
KU379752
HM042862
HQ241821
HM042864
HM042866
HM042867
注:ND:未扩增到序列 No sequence detected;* :本研究中菌株 Strains in this study．
2．3 菌株的分子系统发育学分析
根据 tefA和 tubB基因序列构建的最大简约(MP)树的拓扑结构相似，除 ETC 中的 E. typhina 外，基本
上每一个物种都形成一个独立的分支，而且自展支持率较高(图 3和 4)。
在由 tubB基因序列所构建的 MP 树上，圆柱披碱草的 5 个分离菌株第 1 拷贝与鹅观草分离菌株
E. sinica的第 1拷贝亲缘关系较近，聚为一支，自展值为 71。tubB基因没有第 2拷贝。
在由 tefA基因序列所构建的 MP 树上，5 个分离菌株第 1 拷贝与我国其他披碱草菌株聚为单独的一
支，自展值为 70;尤其来自新疆的 2个菌株，以 100的自展值单独成支。分离菌株的第 1 拷贝与我国其他
披碱草菌株、鹅观草分离菌株 E. sinica、草地早熟禾内生真菌 E. liyangensis的第 1拷贝亲缘关系较近，聚集
为自展值为 90的一大支。Exn8101和 Exj8101的第 2拷贝分散位于 ETC内。
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第 3期 王志伟，等:禾本科植物内生真菌研究 19:圆柱披碱草内生真菌的系统发育学研究
图 3 根据 tubB基因序列构建的最大简约系统发育树
Fig. 3 Epichloae endophytes tubB phylograms based on maximum parsimony
1 000次重复，自展值＞60%。●:本研究中 El. cylindricus分离菌株;▲:亚洲披碱草分离菌株;◆:北美披碱草分离菌株。EBY:
Epichloё bromicola /E. yangzii。
1 000 replicates，bootstrap value＞ 60%． ●:Strains obtained from El. cylindricus in this study;▲:Asia strains obtained from Elymus
spp．;◆:North American strains obtained from Elymus spp．． EBY:Epichloё bromicola /E. yangzii． The same as follows．
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南 京 农 业 大 学 学 报 第 39卷
图 4 根据 tefA基因序列构建的最大简约系统发育树
Fig. 4 Epichloae endophytes tefA phylograms based on maximum parsimony
ETC:E. typhina complex
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第 3期 王志伟，等:禾本科植物内生真菌研究 19:圆柱披碱草内生真菌的系统发育学研究
3 讨论
麦类作物是最重要的作物之一。世界各地都在探索小麦属植物内生真菌，但至今仅仅获得了一些非
特异性菌株(即无严格宿主特异性的广义内生真菌) ，具有严格宿主特异性的 epichloae内生真菌则一无所
获［23－25］。与小麦属(Triticum)近缘的植物类群有偃麦草属(Elytrigia)、山羊草属(Aegilops)、冰草属(Agro-
pyron)、赖草属(Leymus)、新麦草属(Psathyrostachys)、鹅观草属(Ｒoegneria)、披碱草属(Elymus)、旱麦草属
(Eremopyrum)等［26］。因此，各国的研究人员都将探索范围扩大到与麦类植物近缘的其他禾本科植物，其
中以披碱草属和鹅观草属的相关工作最多。
披碱草属和鹅观草属亲缘关系非常密切，两者最显著的区别是在每节穗轴上小穗的数量。披碱草属
植物有 2个或 2个以上(2－4－6)的小穗;而鹅观草只有 1个小穗［26］。在美洲，披碱草属植物种类多，分布
广，而只有 1个小穗的鹅观草属植物则很少。因此，在美国的植物分类学，鹅观草属被合并入披碱草属中。
相反，在高加索以东的亚洲地区，只有 1个小穗的鹅观草属植物十分丰富。因此，在以苏联为代表的基于
欧亚大陆的植物分类学体系中，鹅观草属植物独立成为一个属［26］。在我国的植物分类学体系中，鹅观草
属与披碱草属共存。此前，欧美学者从美洲的披碱草属植物中，发现了有性的 E. elymi［11］，而我们从鹅观
草属植物中发现的类似的内生真菌则为 E. bromicola(syn. E. yangzii)［1，17］，显示出两者在宿主 /内生真菌应
答机制方面的差异。我们对我国 18个省市鹅观草(Ｒoegneria spp．)植物中的真菌进行过调查，报道了 2个
新物种，分别是有性型的 E. bromicola(syn. E. yangzii)和无性型的 E. sinica［17，19］。分离得到 E. sinica 各菌
株的宿主植物有 Ｒ. kamoji、Ｒ. ciliaris、Ｒ. japonensis和 Ｒ. canina等鹅观草属植物，在多年的研究中逐渐拓宽
了 E. sinica 的宿主种类。将 E. sinica 地理范围由华南、华东延伸至西北、华北［27］。E. bromicola
(syn. E. yangzii)的宿主目前仅为鹅观草(Ｒ. kamoji)，且地理范围较 E. sinica 局限。基于 tefA 和 tubB 基因
序列的系统发育学分析，E. sinica被认为是 E. bromicola(syn. E. yangzii)和 E． sylvtica的杂交后代。
从广泛分布于北美大陆的加拿大披碱草中，目前已有 2个物种被报道，分别是有性型的 E. elymi及无
性型的 E. canadensis［11－12］。根据系统发育学分析，E. canadensis 同样具有双拷贝，被认为是 E. elymi 和
E. amarillans的杂交后代。虽然我国已有在披碱草中分离到内生真菌的报道［13－14］，15 个披碱草分离菌株
仅得到 1个 actG拷贝、1个 tefA和 tubB拷贝［15］，也并未发现任何菌株具有第 2 个 tefA 基因拷贝［16］，并认
为它们为非杂交起源。
由于无法扩增得到 5个圆柱披碱草分离菌株的 tubB第 2拷贝，我们通过 PCＲ 直接测序的方法，获得
了单一的峰图。之前的研究表明，若菌株有多拷贝且采用 PCＲ 产物直接测序时，测序得到的信号峰图会
在某段位置出现双峰或杂峰［6，28］。所以可以判定分离菌株的 tubB 基因没有多拷贝，这与 E. sinica 有所区
别。本研究为首次从我国圆柱披碱草属内生真菌中检测到 tefA 基因片段的 2 个拷贝，其中第 2 拷贝通过
特异性引物获得。
由 tefA和 tubB基因序列获得的最大简约树拓扑结构相似，圆柱披碱草植物分离菌株的第 1 拷贝和第
2拷贝在 MP 树上都与 E. sinica亲缘关系较近，其中 tefA序列第 1拷贝能够聚为单独的一支。在系统发育
树上，分离菌株的 tefA序列 2个拷贝中其中 1个拷贝与 E. bromicola(syn. E. yangzii)聚类，另一个拷贝位于
ETC一支，所以分离菌株很可能是杂交而来。根据系统发育树我们认为分离菌株可能起源于 E. bromicola
(syn. E. yangzii)和 ETC中菌株，与 E. sinica有相似的起源。而且从目前在中国发现的具有杂交起源的分
离菌株都表现出比较近的亲缘关系，第 1拷贝都聚于 EBY大支，第 2拷贝分布于 ETC大支上，因此这些菌
株可能都有相同的祖先 E. bromicola(syn. E. yangzii)［19，27］。
长期以来的研究结果发现，亲缘关系接近的物种其中的内生真菌也往往接近［19］。虽然来自我国西北
的圆柱披碱草分离菌株与 E. elymi 及 E. canadensis 都分离自同一属的植物［11－12］，但两者亲缘关系较远。
分离菌株与 E. elymi在地理分布和系统发育分析上都有很大的差异，分离菌株与 E. elymi 及 E. canadensis
明显属于不同的类群。中国的菌株与国外菌株在起源上存在着巨大的差异，这可能是由于分布地点上有
较为明显的地域隔离所产生的结果。
圆柱披碱草分离菌株在基于 tefA 的系统发育树中聚类于独立的分支，但依然与 E. sinica 关系密切。
再加上宿主植物种类的差异，地理分布上的不同，它们之间存在一定的差异。本文发现的 Epichlo sp. -
El. cylindricus为一个新的共生体组合，从我国西北地区圆柱披碱草中获得的分离菌株为具有杂交
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南 京 农 业 大 学 学 报 第 39卷
［E. bromicola(syn. E. yangzii)和 E. sylvatica］起源的无性 Epichlo属内生真菌。
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责任编辑:刘怡辰
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