全 文 ：＊通讯作者
收稿日期:2005-05-18;修回日期:2005-06-17
基金项目:甘肃省科学技术攻关项目(2GS035-A41-001-04);甘肃省教育厅科研项目(42-042);国际原子能机构项
目(CPR-5-014)资助
作者简介:田宏(1978-),女 ,陕西省周至县人 ,硕士 , 2004年毕业于甘肃农业大学 ,现主要从事野生牧草种质资源收集
与保护工作 ,发表论文 9篇.
禾本科草坪草固氮菌株筛选及部分特性初步研究
田　宏 1 ,张德罡 2 ,姚　拓2＊ ,席琳乔 2
(1.湖北省农科院畜牧兽医研究所 , 湖北　武汉　430209;
2.甘肃农业大学草业学院 , 甘肃　兰州　730070)
　　摘要:从西安和兰州两地多年生禾本科草坪草根际分离到固氮菌株 302株, 通过气相色谱仪 ,利用乙
炔还原法最终筛选出 10个固氮酶活性较高的菌株。研究发现 ,菌株 X4固氮酶活性最高 ,达 180.20 nmol
C2H4 /h· ml,与其他菌株相比差异极显著(P<0.01), L9最小为 37.78 nmolC2H4 /h· ml。比较西安
和兰州两地多年生草地的固氮酶活性 ,西安地区不同草地的差异较大 , 最高者是最低者的 4.5倍左
右。单从固氮酶活性来看 ,西安地区草地有开发潜力的优良菌株相对较多 , 如 X4和 X1, 而兰州地区
的相对较少。分离到的固氮菌 70%都有溶磷能力 ,溶磷圈直径比(D/d)在 1.044 ～ 2.729之间 ,其中
L7菌株溶解有机磷和无机磷能力相对较好 , X1和 L5溶解无机磷的能力相对较好 , X4和 X2溶解有
机磷较好。菌株大部分都有分泌生长素能力 , 但差异较大 , 分泌 IAA浓度最高的是 X2, 达 22.3mg/
L, 其次为 X3菌株。
　　关键词:草坪草;固氮菌;固氮酶活性;溶磷性;生长素
　　中图分类号:S688.4　　文献标识码:A　　文章编号:1000-6311(2005)05-0047-06
IsolationandCharacteristicsofNitrogenFixationBacteriainRhizosphereofTurf-
grass.TIANHong1, 2 , ZHANGDe-gang2 , YAOTuo2 , XILin-qiao2 (1.InstituteofPoultry
andVeterinarian, HubeiAcademyofAgriculturalScience, Wuhan 430209, China;
2.PrataculturalColege, GansuAgriculturalUniversity, Lanzhou730070, China):Grassland
ofChina, No.5 2005, pp.47 ～ 52.
Abstract:The302nitrogenfixtionsrainswereisolatedfromtheRhizosphereofturfgrassin
Xi anandLanzhou.Andtenstrainswhichhadthehigherpositivenitrogenaseactivitywere
selectedforfurtherstudy.TheresultsshowedthatthenitrogenaseactivityofX4 strainwas
thehigest(180.20nmolC2H4 /h·ml)andwassignificantlydiferentfromotherstrains,
whilestrainL9 wastheleast(37.78 nmolC2H4 /h· ml).Thenitrogenaseactivityof
—47—
第 27卷　第 5期　　　　　　　　　　　　中　国　草　地　　　　　　　　　　　　2005年 9月
Vol.27　No.5　 　　　　　　　　　　　GrasslandofChina　　　　　　　　 　　　　Sept.2005
strainsisolatedfromXi anvariedgreatlycomparedwiththatofLanzhou.Themaximumwas
about4.5 timesofthemimmum.Thereweremanygoodstrainswhichhadsuchpotential
suchasX4 andX1 inXi anonlyinconsiderationofnitrogenaseactivity.Butfewstrains
withsuchabilitywereisolatedfromLanzhou.Seventypercentofnitrogenfixationbacteria
hadtheabilitytosolubilizephosphorus.ThevalueofD/dvariedfrom 1.044 to2.729.
StrainL17intheaspectofdissolvingorganicandinorganicphosphoruswasbeterthanother
strains.StrainsX15andL5coulddissolveinorganicphosphorus, andX4 andX2 resolved
organicphosphoruswel.SixtypercentofstrainshadtheabilitytoproduceIAA, buthad
significantlydiference.ThehighestcontentofIAAproducedwasupto22.3 mg/L.Strain
X3 wassecond.
Keywords:Turfgrass;Nitrogen-fixationbacteria;Aitrogenaseactivity;P-solubilizingabili-
ty;IAA
　　草坪是草坪植物与周围环境之间相互作
用构成的绿色生态系统 [ 1] 。氮素在维持草
坪草正常生长方面起着至关重要的作用 ,直
接影响草坪的颜色 、密度 、绿期 、抗病能力等。
目前 ,工业化肥是解决草坪氮素的主要途径。
然而 ,工业化肥成本高 ,利用率低 ,并对环境
带来一定的负面影响。因此 ,发掘新的氮素
资源以减少生产和使用工业氮肥带来的经济
压力 、非再生能源巨大消耗及生态环境污染
已成为人们关注的重要问题[ 2] 。
自 1966年 Doberener等在点状雀稗
(Paspalumnotatum)根际首次发现有较强固
氮作用的雀稗固氮菌 (Azotobacterpaspali)以
来 ,人们对这类非豆科植物与根系联合的特
殊固氮菌展开了广泛研究[ 3 ～ 10] ,但关于禾本
科草坪草固氮方面的研究报道较少。本研究
从西安市和兰州市两地特定气候 、土壤环境
中的禾本科草坪草根际分离 、筛选固氮菌株
并对其特性进行初步研究 ,以期为后续草坪
微生物接种剂或菌肥的研制与应用提供菌种
资源与理论依据 。
1　材料与方法
1.1　采样地自然概况
西安市:位于秦岭北麓 , 东经 108°55′
45″、北纬 34°15′24″,海拔 400m,属暖温带大陆
性季风气候。冬春干旱 ,夏季酷热 ,年平均温度
12.9℃,日照 2196h,年降水量 602.4mm,无
霜期 200d[ 11] 。草坪为匍茎翦股颖 (Agrostis
stolonifena)单播 ,建植年限 9年。
兰州市:位于东经 103°15′、北纬 37°30′,
海拔 1660m,属寒冷半干旱带。年平均温度
9.1℃, 年日照 2240 ～ 2640h, 年降水量
330mm,年蒸发量 146mm,无霜期 120 ～ 180d
左右。土壤含盐量很高 , pH8.0 ～ 8.7。草坪
为苇状羊茅(Festucaarundinacea)、多年生黑
麦草 (Loliumperenne)和草地早熟禾 (Poa
pratensis)混播 ,建植年限 9年 。
1.2　样品采集
采取 0 ～ 20cm内的草坪草根际(根系和
土壤)样品 ,按常规方法混合后 ,带回实验室
立刻进行固氮菌分离 。
1.3　固氮菌分离及固氮性能测试
选择 NFM、CCM和 LB培养基 ,各成分
见参考文献 [ 11] 。为便于研究 ,将草坪草根际
区分为:根际土壤(NRS)、根表土壤(RS)、根
系表面(RP)、根内(HP),分离方法主要参考
文献 [ 13, 14] 。
将从草坪草根际分离获得的纯培养物分
别接种于盛有 10ml半固体 NFM、CCM培养
—48—
中国草地　2005年　第 27卷　第 5期
基的血清小瓶中(每种培养基 3个重复), 28
～ 30℃下培养 24 ～ 48h后 ,将血清小瓶盖在
无菌条件下换成橡胶塞 ,用无菌注射器抽出
10%的气体 ,然后给每瓶注入 1mlC2H2 ,再
置培养箱中培养 24 ～ 48h。从瓶中抽取混合
气体 0.2ml注入气相色谱仪(TraceGC2000,
Chrom-cord, Italy)中 ,测定 C2H2 、C2H4的
生产情况。从气相色谱仪显示屏的 C2H2、
C2H4峰值判断有无 C2H4的产生 ,根据下列
公式计算固氮酶活性的大小。
N=(hx×C×V)/(hs×24.9×t)
其中 , hx为样品峰值;hs为标准 C2H4峰
值;C为标准 C2H4浓度(nmol/ml);V为培养
容器体积(ml);t为样品培养时间(h);N为
产生的 C2H4浓度(nmol/ml· h)。
1.4　固氮菌溶磷能力和分泌生长激素能力
测定
1.4.1　溶磷能力测定
采用溶磷圈法 。选用 PKO和蒙金娜有
机培养基 [ 15, 16] ,观察溶磷圈的生成情况 ,根
据溶磷圈直径(D)和菌落直径(d)比值的大
小确定解磷能力 。
1.4.2　分泌生长激素能力测定
取在含有 100mg/l色氨酸的 King培养
基上培养的菌株悬浮液 1滴 ,同时滴加 1滴
比色液。对照仅在比色液中加 1滴 50 ×
10
-6的 IAA(吲哚乙酸),置于室温下 15min
后观察颜色的变化 ,颜色变为粉红色者为阳
性 ,否则为阴性 ,以确定菌株是否产生 IAA。
定量测定采用 Salkowski比色法。标准
曲线采用纯的 3-IAA(3 -吲哚乙酸)制作。
分泌 IAA的测定是将菌株培养液在 10000
r/min离心 10min,取上清液 1ml加比色液在
黑暗中静置 0.5h,取出立即在波长 530nm下
测定吸光度 ,详细方法见参考文献 [ 17 ～ 20] 。
2　结果与分析
2.1　土壤样品的部分化学性质
植物根际固氮菌的种类 、固氮酶活性等
会因所处的土壤环境不同而有所差异。因
此 ,本研究对采样地土壤肥力状况进行了常
规分析 ,结果见表 1。
表 1　采样地土壤化学性质
Table1　Propertiesofsoilsample
地点 pH 有机质 (%) 速效 N(mg/kg) 全氮 (%) 全磷 (%)
西安 7.63 1.0780 0.00497 0.0756 0.05611
兰州 8.17 1.4269 0.0029 0.0767 0.04057
　　表 1表明 ,两个采样地土壤状况有较大
差异 ,西安地区土壤中性略偏碱 ,兰州地区土
壤呈碱性;西安地区土壤有机质和全氮含量
比兰州地区低 ,但速效 N和全磷含量比兰州
地区高。这种土壤环境及气候(见 1.1采样
地自然概况)的差异有可能对两地草坪草固
氮菌的种类分布及固氮酶活性等产生一定的
影响。因为土壤酸碱度影响植物和固氮菌种
类 ,酸性土壤和盐碱土壤都有各自适应的植
物和固氮细菌。温带和亚热带地区的农作物
大都在 pH5.5以上至 8.0以下土壤中生长 ,
在它们根部进行联合固氮的细菌适应在
pH7.0左右的环境中发挥作用 [ 21] 。而土壤
根际无机氮化物对固氮酶有抑制作用 ,在土
壤 —植物系统中 ,根际无机氮含量由于根的
吸收而远低于根外土壤。 Balandrean等曾在
含 50×10-6NO3 -的土壤中测出较高的根际
固氮活性 [ 22] 。
2.2　草坪草固氮菌固氮酶活性
从西安和兰州地区共分离到固氮菌 302
—49—
田　宏　张德罡　姚　拓等　禾本科草坪草固氮菌株筛选及部分特性初步研究
株 ,其中兰州 114株 ,西安 188株 ,通过菌株
在各种无氮培养基上生长状况 、固氮酶活性
大小等比较 ,最终筛选出综合性状表现较好
的菌株 10株(表 2)。
表 2　分离自草坪草根际的固氮菌株
Table2　Nitrogenfixationbacteriastrainsisolatedfromturfgrass
菌株号＊
StrainCode
来源
origin
部位
Section
固氮酶活性大小(nmolC2H4 /h· ml)
QuantityofAitrogenaseActivity
X4 兰州 NRS 180.20aA
X1 西安 NRS、HP 118.15bB
L5 兰州 RS 91.36cC
L6 兰州 RS、RP 56.17dD
L7 兰州 RS、RP、HP 50.57eDE
X3 西安 NRS 47.85eE
L8 兰州 RS 42.77fF
L10 兰州 RS 41.45fgFG
X2 西安 RS, RP 39.32fgG
L9 兰州 NRS 37.78gG
　　注:大写字母表示 0.05水平 ,小写字母表示 0.01水平;＊菌株学名正在鉴定中。
　　从草坪草根际分离的 10株固氮菌株来
源有所差异 ,其主要来自根表土壤 ,共 6株
(其中兰州 5株 ,西安 1株),其次为根际土
壤和根表 ,分别为 4株(兰州 1株 ,西安 3株)
和 3株(兰州 2株 ,西安 1株),占 20%;根内
(HP)较少 ,仅 2株(兰州 1株 ,西安 1株)。
分离到的菌株以根表土壤和根表的数量较
多 ,根内和远根土壤相对较少 ,这结果与大部
分学者研究结果相一致[ 14, 16, 23] 。
10株菌株均具有较高的固氮酶活性 ,但
各菌株固氮酶活性差异较大 。其中固氮酶活
性最大为 X4菌株 ,固氮酶活性高达 180.20
nmolC2H4 /h· ml, 最小为 L9菌株 , 仅有
37.78nmolC2H4 /h· ml,而介于 40 ～ 60nmol
C2H4 /h· ml之间的菌株占分离物的 80%。
从西安地区分离到的 4株菌株固氮酶活
性差异较大 , X4菌株的固氮酶活性与其他菌
株相比差异极显著 (P<0.01), X1菌株次
之 。相比之下 ,兰州地区具有较高固氮酶活
性的菌株不多 ,大部分(66.7%)分离物固氮
酶活性在 40 ～ 60nmolC2H4 /h· ml之间 。本
研究对草坪草根际分离菌株固氮酶活性测定
结果与大多数研究相似 ,但也存在着差别 ,出
现这种现象的主要原因是固氮酶活性受植物
种类 、土壤类型(有机质含量影响植物根系
固氮酶活性)、C/N比 、温度 、湿度和氧气分
压等多种因素影响的结果 [ 14, 26] 。
2.3　草坪草固氮菌溶磷和分泌生长激素的
能力
2.3.1　草坪草固氮菌的溶磷能力
在分离到的 10株固氮酶活性相对较高
的菌株中 ,除了 L6、L8和 L10菌株没有溶磷
性外 ,其他菌株均可以在 Pikovaskaia s和蒙
金娜平板培养基上形成透明圈 ,说明这些菌
株可分泌一些酸性物质 ,使菌落周围培养基
中的磷酸盐 〔Ca3(PO4)2〕或卵磷脂溶解 。测
定溶磷圈直径(D/d)发现 , 7株菌株溶解无
机磷的能力为:L7>X1>L5>L9>X2 /X4>
—50—
中国草地　2005年　第 27卷　第 5期
X3;溶解有机磷能力大小为:L7 >X2 /X4 >
L5>L9>X1>X3(表 3)。其中来自西安的
有 4株 ,占 57.14%,来自兰州的 3株 。
2.3.2　草坪草固氮菌的分泌生长激素能力
草坪草根际分离物大部分具有分泌生长
素的特性 ,但产生 IAA的能力差异较大。菌
株分泌 IAA的浓度在 3.18 ～ 22.3mg/L之
间 ,其中 X2菌株分泌 IAA的浓度最高 ,达
22.3mg/L,其次为 X3和 X4,分别为 19.2mg/
L和 17.6mg/L。
表 3　分离自草坪草的固氮菌溶磷和分泌生长激素性能
Table3　AbilityofP-solutizingandIAAproducing
菌株号
StrainCode
溶磷能力(D/d)
AbilityofP-solubilizing
PKO培养基 蒙金娜培养基
分泌生长素
IAAProducing
定性 定量(mg/L)
X4 1.123 2.012 ++ 17.6
X1 2.2 1.215 + 10.7
L5 2.167 1.875 + 15.1
L6 0 0 ++ 16.2
L7 2.729 2.267 + 12.2
X3 1.012 1.011 +++ 19.2
L8 0 0 - ND
L10 0 0 - ND
X2 1.123 2.012 +++ 22.3
L9 1.642 1.369 - ND
　　注:“ -”颜色没有变化;“ +”粉红色;“ ++”较深粉红;“ +++”深粉红色。
　　本研究从多年生禾本科草坪草根际分离
到的固氮菌株大部分具有溶解磷元素和分泌
生长激素的能力 ,这与许多学者的研究结果
相一致 [ 16, 24, 26, 27] 。菌株 X4、L5、L7、 X1、X2
等具有较强的固氮 、溶磷和分泌生长素的能
力 ,在微生物肥料研制方面可能具有较大的
开发潜力 ,建议对其作进一步接种试验 ,以确
定其开发利用价值。
3　结论
3.1　通过对多年生草坪草根际固氮菌的分
离筛选 ,获得固氮菌 302株 ,通过气相色谱
仪 ,利用 ARA法测定 ,最终筛选出 10株固氮
酶活性相对较高的菌株。
3.2　筛选的 10株菌株 ,固氮酶活性差异较
大 , X4菌株固氮酶活性最高 ,达 180.20 nmol
C2H4 /h· ml, L9活性最小为 37.78 nmol
C2H4 /h· ml。两地多年生禾本科草地各菌
株固氮酶活性相比 ,西安地区差异较大。如
单从固氮酶活性来看 ,西安地区草地有开发
潜力的优良菌株相对较多 ,如 X4和 X1 ,而兰
州地区相对较少 。
3.3　分离到的固氮菌株 70%具有溶解无机
和有机磷的能力 , 溶解无机磷溶磷圈直径
(D/d)值在 2.729 ～ 1.012之间 ,溶解有机磷
值在 2.267 ～ 1.011之间 ,其中 L7菌株溶解
磷酸盐 〔Ca3(PO4)2〕或卵磷脂能力均较强 ,
X1和 L5两者溶解无机磷的能力较强 , X4和
X2溶解有机磷较好 。
3.4　分离物大部分具有分泌生长激素 IAA
—51—
田　宏　张德罡　姚　拓等　禾本科草坪草固氮菌株筛选及部分特性初步研究
的能力 ,但差异较大 ,分泌 IAA浓度最高的
是 X2,其次为 X3菌株 , L10最小 。
3.5　本研究从草坪草根际分离到的固氮菌
X4和 L5,无论从固氮能力 ,还是溶解磷元素
和分泌生长素的能力方面均表现良好 ,在微
生物肥料研制方面可能具有较大的开发潜
力 ,建议对其作进一步研究 。
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