全 文 ：地毯草根际固氮菌的分离及鉴定
收稿日期：2011-05-24
基金项目：海南省自然科学基金项目（310019）
作者简介：樊俊华（1978-），男，讲师，硕士，研究方向为草业学。E-mail: fans6590@126.com
樊俊华1，张晓波1,2，赵 艳1
（ 1.海南大学农学院，海口 570228；2.热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室，海口 570228）
摘 要：结合气相色谱仪，利用乙炔还原等方法对地毯草（Axonopus compressus）根际固氮菌进行分离和鉴
定。结果表明，从地毯草根际土壤中分离获得 6 株固氮菌株，菌株的固氮酶活性相差较大（92.5 C2H4~295.2 C2H4
nmol·mL-1·h-1），菌株hnN2及hnN6具有较高的固氮酶活性（>200 C2H4 nmol·mL-1·h-1）；菌株经鉴定分属Bacillus（2
株）、Azotobacter（3株）和Pseudomonas（1株）3个属。
关键词：地毯草；固氮菌；分离与鉴定；根际
中图分类号：S154.3 文献标志码：A 文章编号：1005-9369（2012）08-0105-05
Isolation and identification of associative nitrogen-fixing bacteria in the rhizo⁃
sphere of Axonopus compressus/FAN Junhua1, ZHANG Xiaobo1, 2, ZHAO Yan1(1. School of
Agriculture, Hainan University, Haikou 570228, China; 2. Key Laboratory of Protection and Develop-
ment Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources, Hainan University, Ministry of Education, Haik-
ou 570228, China)
Abstract: This study isolates and identifies associative nitrogen-fixing bacteria from the rhizo-
sphere of Axonopus compressus by acetylene reduction assay (ARA) combined with gas chroma-
tography(GC). Six strains were isolated, and showed that nitrogenase activity was large variation between strains
(from 92.5 C2H4 to 295.2 C2H4 nmol·mL-1·h-1). Strains hnN2 and hnN6 showed higher nitrogenase activity (>200
C2H4 nmol·mL-1·h-1). All strains belonged to Bacillus(2 strains), Azotobacter (3 strains) and Pseudomonas (1
strains), respectively.
Key words: Axonopus compressus; associative nitrogen-fixing bacteria; isolation and identifica-
tion; rhizosphere
[ 参 考 文 献 ]
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Journal of Northeast Agricultural University
东 北 农 业 大 学 学 报第43卷 第8期 43(8): 105~109
2012年8月 August 2012
地毯草（Axonopus compressus）用于水土保持、建
植公路护坡草坪和遮荫地草坪。氮肥在维持草坪正
常生长方面起重要作用，直接影响草坪颜色、密
度、绿期、抗病能力等[1]。目前，工业化肥是补充草
坪氮素的主要途径。但化肥成本高、利用率低，对
环境有负面影响。因此，发掘新的生物氮肥，以减
少生产和使用工业氮肥带来的经济压力、非再生能
源巨大消耗及生态环境污染已成为人们关注的重要
问题[2-3]。固氮菌可依赖植物根系分泌物生长和固
氮，通过固氮作用为粮食作物提供氮素，豆科植物
固 氮 菌 的 研 究 已 非 常 深 入 ， 自 1972 年 巴 西
Dobbereiner 在禾本植物根际发现固氮菌并提出禾
本科植物固氮的概念以来，禾本科植物根际固氮菌
的研究受到极大重视[4]，并进行大量的禾本科作物
的固氮研究，但关于禾本科植物草坪草固氮方面的
研究较少，特别是地毯草草坪固氮方面的研究还未
见报道。因此，本研究从海南地毯草草坪根际土壤
中分离、筛选固氮菌株并对其特性进行初步研究，
以期为筛选高效优良菌株，并为草坪生物氮肥的研
制与应用提供菌种资源与理论依据，对促进草地的
氮循环和退化草地的治理具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试土样基本特征
土样采自选定的地毯草草坪，其土壤 pH 为
5.43，有机质含量为 1. 216%，全氮为 0. 0631%，
全磷为 0. 0312%，全钾为 1.401%，速效磷为 8.162
mg·kg-1，速效钾为 43. 670 mg·kg-1，速效氮为
76. 034 mg·kg-1。
1.1.2 培养基
NFM 培养基 [5]：葡萄酸 10.0 g，K2HPO4 0.2 g，
MgSO4·7H2O 0.2 g，NaC1 0.2 g，CaCO 35.0 g，K2SO4
0.2 g，Agar 20.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0，121℃
灭菌20 min。
1.2 方法
1.2.1 根际土样的采集
选定一个地毯草生长良好的区域作为标准样地
（3 m×3 m），在每个标准样地内按 S形随机选择 15
株地毯草，采集根际土样时先去除表层的落叶及枯
草，将整个植株带根系小心挖出，轻轻抖落根系上
的大块土壤，用刮刀轻轻刮下黏附于根系表面约2
mm土壤，分别将采集到的根际土样装入经过高压
消毒的无菌纸袋，并在袋上标注，带回实验室立即
处理。
1.2.2 固氮菌的分离与纯化
采用稀释涂布平板法分离[6]。称取根际土壤样
品 1 g，制备不同浓度梯度的悬浮液，取稀释度为
10-2、10-3、10-4 的悬浮液各 0.1 mL，接种到盛有
NFM的培养皿中，用无菌玻璃刮铲在培养基表面
涂抹均匀。每浓度设置3个重复，恒温28℃，培养
2~4 d，利用画线法挑选挑选比较光滑，比较大、
粘稠的菌落接种到LB平板上进行纯化，保存到LB
斜面上进一步测定其它能力。
1.2.3 固氮酶活性测定
将获得的纯化菌株分别接种于盛有 5 mL半固
体NFM 培养基的血清瓶中（每菌株 5个重复），结
合气相色谱仪，利用乙炔还原法（Acetylene reduc-
tion assay，ARA）确定菌株有无固氮活性[7]，并计算
固氮酶活性。
其中，hx-样品峰值；hs-标准C2H4 峰值；C-
标准 C2H4 浓度（nmol·mL-1）；V-培养容器体积
(mL)； t-样品培养时间（h）；N-产生的 C2H4 浓度
（nmol·mL-1·h）
1.2.4 固氮菌的形态学、生理生化特性及鉴定
1.2.4.1 形态学特性观察
①菌落特性：用接种环接菌对制成的平板进行
划线，28℃恒温培养 2~4 d，观察并描述其菌落形
状、透明度、颜色、边缘、表面状况、生长速度
等；②细胞特性：观察细胞形状、大小及鞭毛着
生情况、革兰氏染色、芽孢染色等。
1.2.4.2 生理生化反应测定
测定菌株过氧化氢酶、氧化酶、葡萄糖氧化发
酵、淀粉水解、明胶液化、果胶水解、硝酸盐还原
等生化反应[8]。
1.2.4.3 固氮菌鉴定
综合分析以上观察和测定结果，参照文献[9]
对分离得到的各个菌株进行鉴定。
2 结果与分析
2.1 菌株的菌落形态及细胞特性
试验选用NFM培养基对结缕草根际土壤进行
N= hx × C × Vhs × 24.9 × t
东 北 农 业 大 学 学 报·106· 第43卷
了分离和纯化，共获得6个固氮菌株的纯培养。从
表 1、2 可以看出，分离获得的固氮菌除 hnN1 和
hnN5 外其余菌株均为革兰氏阴性菌并不产生芽
孢；除菌株 hnN3、hnN6生长速度比较慢外，其余
菌株为生长速度较快，具体菌落特征及细胞形态见
表1、2。
表1 地毯草根际固氮菌在NFM培养基上培养的菌落形态
Table 1 Colony morphology of nitrogen-fixing bacteria strains isolated from Axonopus compressus
rhizosphere on NFM culture medium
菌株号
Strain code
hnN1
hnN2
hnN3
hnN4
hnN5
hnN6
细胞形态
Cell morphology
杆状
杆状
杆状
类球状
杆状
杆状
细胞大小（μm）
Cell size
2.6×0.8
1.6×0.4
2.3×0.6
1.8
2.8×0.6
1.8×1.1
革兰氏染色
Gram stain
G+
G-
G-
G-
G+
G-
鞭毛
Fiagella
极生
极生
周生
周生
周生
周生
产生芽孢
Produce spore
产生
不产生
不产生
不产生
产生
不产生
菌株号
Strain code
hnN1
hnN2
hnN3
hnN4
hnN5
hnN6
菌落形状
Colony shape
圆形
圆形
圆形
圆形
圆形
圆形
透明度
Transparence
稍透明
不透明
不透明
不透明
透明
稍透明
颜色
Colour
白色
白色
灰白色
灰白色
白色
白色
边缘
Border
完整
完整
完整
完整
完整
完整
隆起度
Apophysis
凸起
平坦
凸起
凸起
平坦
平坦
表面状况
Surface condition
很湿润
较湿润
较干
较干
很湿润
很湿润
生长速度
Growth rate
较快
较快
慢
较快
较快
慢
表2 地毯草根际分离的固氮菌菌株在NFM培养基上生长的细胞特性
Table 2 Cell characteristic of nitrogen-fixing bacteria strains isolated from Axonopus compressus
rhizosphere on NFM culture medium
2.4 固氮菌菌株的鉴定
目前国际上公认和普遍采用的细菌分类系统
主要是“伯杰氏”分类系统和“原核生物”分类系
统。尽管在细菌分类和鉴定中引入了分子生物学
方法，但目前认识细菌仍主要依靠细菌培养特
性、生理特征和生化反应等 [9]。本研究采用“伯杰
表3 地毯草根际固氮菌株的固氮酶活性测定
Table 3 Acetylene reduction method for measuring nitrogenase activity test of nitrogen-fixing bacteria
strains isolated from Axonopus compressus rhizosphere
菌株号
Strain code
hnN1
hnN2
hnN3
固氮酶活性（C2H4 nmol·mL-1·h-1）
Nitrogenase activity
132.9
267.5
105.2
菌株号
Strain code
hnN4
hnN5
hnN6
固氮酶活性（C2H4 nmol·mL-1·h-1）
Nitrogenase activity
92.5
194.5
295.2
2.2 固氮酶活性
固氮酶活性测定结果见表3，表明不同菌株的
固氮酶活性有较大差异，产生的C2H4浓度在 92.5~
295.2 nmol·mL-1·h-1之间，菌株hnN2和hnN6的固氮
酶活性较高，分别为267.5及295.2 nmol·mL-1·h-1。
2.3 菌株的生理生化特征
参考固氮菌的特征，对 12株菌株的主要生理
生化指标进行了测定，由表3可见，供试菌株过氧
化氢酶、氧化酶试验均为阳性反应，果胶水解和
吲哚试验为阴性反应；菌株hnN1、hnN5淀粉水解
为阳性反应，明胶水解为阴性反应；除 hnN2外其
余菌株均有色素产生且硝酸盐还原试验结果为阳
性反应；试验分离的6个菌株在pH为5.7的营养肉
汤培养液中均生长不良，且菌株hnN2能产生H2S。
樊俊华等：地毯草根际固氮菌的分离及鉴定第8期 ·107·
3 讨论与结论
目前，有关禾本科植物根际固氮菌固氮酶活
性研究报道较多，姚拓等从燕麦根际中分离获
得的 8 株固氮菌株固氮酶活性在 112.5~1147.9
nmol·mL-1·h-1之间[10]；田宏等从禾本科草坪中筛选
出的 10 株固氮菌株固氮酶活性在 37.78~180.20
nmol·mL-1·h-1之间[11]。本研究通过对地毯草根际中分
离获得菌株固氮酶活性在 92.5~295.2 nmol·mL-1·h-1
之间，与上述学者研究结果的差异，原因可能是
固氮酶活性受到植物种类、土壤类型、C/N、温
度、湿度和氧气分压等多种因素的影响[12]。
从鉴定结果看，本试验从地毯草根际土壤中
分离到的固氮菌类群有芽孢杆菌属（Bacillus）、固
氮菌属（Azotobacter）和假单胞菌属（Pseudomonas）
3 个属。这一结果与田宏从草坪草根际分离到的
固氮菌 Enterobacter、Bacillus、Staphylococcus、Azoto-
bacter、Pseudomonas 和 Klebsiella[10]，杨海莲从水
稻根际分离到的 Pseudomonas、Bacillus、Entero-
bacter、Staphylococcus[13]，窦新田从春小麦根际分离
到的固氮菌 Enterobacter、Bacillus、Staphylococcus、
Azotobacter、Clostridium[14]及姚拓从高寒地区燕麦
分离到的根际固氮菌 Azotobacter，Pseudomonas、
Azospirillus[15]的结果基本相似。但本试验在结缕
草根际土样中没有分离到上述文献中提到的属
于Staphylococcus、Klebsiella、Enterobacter、Clostridium
以及 Azospirillus的固氮菌株，其原因与植物种类
及其生存环境及与采样时间、样品保存时间与方
表4 地毯草根际固氮菌菌株的生理生化反应特性
Table 4 Physiological and biochemical phenotype of nitrogen-fixing bacteria strains isolated from
Axonopus compressus rhizosphere
表5 地毯草根际固氮菌菌株的鉴定结果
Table 5 Identification result of nitrogen-fixing bacteria strains isolated from Axonopus compressus rhizosphere
生化反应
Biochemical reactions
过氧化氢酶 Catalase
氧化酶 Oxidase
葡萄糖氧化发酵 Oxidation-fermentation test using glucose
明胶水解 Gelatin hydrolysis
淀粉水解 Amylohydrolysis
果胶水解 Pectin hydrolysis
吲哚反应 Indole
硝酸盐还原 NO3 reduction
色素产生 Produce pigment
肉汤生长pH 5.7 Broth growth pH 5.7
产生H2S Produce H2S
菌株号Strain code
hnN1
+
+
+
-
+
-
-
+
+
-
-
hnN2
+
+
-
+
-
-
-
-
-
-
+
hnN3
+
+
-
+
-
-
-
+
+
-
-
hnN4
+
+
-
+
-
-
-
+
+
-
-
hnN5
+
+
+
-
+
-
-
+
+
-
-
hnN6
+
+
-
+
-
-
-
+
+
-
-
注：+ 阳性反应；- 阴性反应。
Note: + Possitive reaction; -Negative reaction.
菌株号
Strain code
hnN1
hnN2
hnN3
学名
Scientific name
Bacillus sp.
Pseudomonas sp.
Azotobacter sp.
菌株号
Strain code
hnN4
hnN5
hnN6
学名
Scientific name
Azotobacter sp.
Bacillus sp.
Azotobacter sp.
氏”分类系统，依据菌落特性、细胞特点和生理生
化特性，同时在查阅大量文献的基础上，对分离
到的固氮菌进行初步鉴定，结果见表5。
由表 5可知，地毯草根际固氮菌类群有芽孢杆
菌属（Bacillus）、固氮菌属（Azotobacter）和假单胞菌
属（Pseudomonas）3 个属。其中以 Azotobacter为主，
分别为菌株hnN3、hnN4、hnN6，其次菌株hnN2鉴
定属于Pseudomonas，菌株hnN1、hnN5为Bacillus。
东 北 农 业 大 学 学 报·108· 第43卷
式、所用培养基种类等有一定关系，同时也表明
禾本科植物根际具有比较相似的固氮菌类群
存在。
此外，菌株生长速度与其竞争能力有一定的
关系，生长速度快，占领空间和获得营养的能力
强，易在生态竞争中获胜。本研究获得的菌株
hnN1、hnN2、hnN4、hnN5 生长速度较快，因此，
其在土壤中存活定居的可能性大，有利于发挥其
固氮效应。本研究固氮菌株的获得可为植物根际
微生态系统的调控以及我国草坪专用微生物肥料
的研制提供必要的材料及理论基础。
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