全 文 ：中国桫椤科 6种植物的 RAPD分析
李雪雁 , 郑　博 , 徐　茵 , 陈国培 , 曾庆璐 , 王　艇
(中山大学生命科学学院 , 广东 广州 510275)
摘　要:应用随机扩增多态性 DNA (RAPD)的方法分析中国桫椤科 6 种植物:小羽桫椤
(Cyathea tsangii)、 粗齿桫椤(Alsophila denticulata) 、 黑桫椤(Alsophila podophy lla)、 白桫椤
(Sphaeropteris brunoniana)、海南白桫椤(Sphaeropteris brunoniana)、桫椤(Alsophila spinulosa)。经筛
选 40个引物 , 发现 14个引物的带型清晰并呈多态性。采用 UPGMA法对求出的遗传距离进行聚
类分析 , 得到的结果显示:所研究 6种植物明显地聚合为 3 个类群 , 支持夏群的分类处理。
关键词:桫椤科 (Cyatheaceae);RAPD;分类学
中图分类号:Q949.367　文献标识码:A　　文章编号:1007-1792 (2002)01-0227-05
桫椤科 (Cyatheaceae)1827年由 Kaulfuss 建立 , 包括的植物多为树状蕨类 , 具粗壮 、
高耸 、圆柱状直立茎干 , 是真蕨中一个颇为独特的类群。该科分布于温暖湿润的热带及亚
热带地区 , 有些南半球的种类向南可达亚南极区 。对于桫椤科的范围及所包含的种的数
目 , 目前的认识还极不统一:Tryon提出 (1982)全世界约有 500种;而有些学者认为约
900种或至少 600种[ 1] 。相应地 , 中国产桫椤科植物的种数也很不确定 , 有报道说 14种 2
变种 , 而其他研究认为是 20种或 54种[ 2 ,3] 。
对桫椤科科内的分类和系统发育认识也争议甚多 。主要的意见有:①该科内只设 1属
Cyathea , 属下设立 2亚属和 4组;②将该科分为 6属;③该科分为 Cnemidaria 和Cyathea 2
属;④秦仁昌将桫椤科分为 Alsophila 、 Sphaeropteris和Gymnosphaera 3属 , 夏群在此基础上
提出把 Alsophila和Gymnosphaera合并为 1属并分别给予两者以亚属等级[ 4] 。由于已报道的
桫椤科植物实验数据极其有限 , 所以目前还很难判断哪一分类系统更为可取。
中国产桫椤科植物位于该科分布的北缘 , 种类及分布均有一定的特色 , 而且不乏古特
有孓遗树种。本文采用 RAPD分子标记技术对 6种产于我国的桫椤科植物的进行了聚类分
析 , 拟为展开桫椤科的分子系统学研究提供初步基础 。
1　材料和方法
1.1　材　料
本研究所用植物材料及来源见表 1。
1.2　主要试剂
10 mer寡聚核苷酸随机引物及 RAPD试剂盒购自上海生工生物工程有限公司 。λDNA/
收稿日期:2001-11-18
基金项目:国家自然科学基金重点资助项目 (39830310);国家自然科学基金资助项目 (30170101 ,
30170789);广东省自然科学基金资助项目 (011125)
作者简介:李雪雁 (1976-), 女 , 硕士生;通讯联系人:王艇;E_mail:lsswt@zsu.edu.cn
　第 22 卷　第 1 期
2002年　2 月
中 山 大 学 学 报 论 丛
SUN YATSEN UNIVERSITY FORUM
Vol.22　No.1
Feb.　2002 　
EcoRⅠ +Hind Ⅲ Markers购自华美生物工程公司。其余均为国产 AR级试剂。
表 1　材料名称及来源
植物名称 来源 鉴定者
小羽桫椤 (Cyathea tsangii) 海南省尖峰岭 王伯荪
粗齿桫椤 (Alsophila denticulata) 江西省九连山自然保护区 陈炳辉
黑桫椤 (Alsophila podophylla) 广东省华南植物园
白桫椤 (Sphaeropteris brunoniana) 海南省尖峰岭 廖文波
海南白桫椤 (Sphaeropteris hainanensis) 海南省尖峰岭 廖文波
桫椤 (Alsophila spinulosa) 广东省英德市石门台自然保护区 陈炳辉
1.3　DNA的提取与浓度 、纯度检测
取0.25 g 植物新鲜叶片 , 在液氮中迅速研磨成粉末 , 分装于 2个 1.5 mL 离心管 , 充
分混匀 , 60 ℃保温4 h , 500μL 氯仿/异戊醇 (体积比为 24∶1)抽提10 min , 1 300 r/min离
心10 min , 重复 1次 。
取水相 , 加入 2/3体积冷异丙醇 , 轻轻混合 , 5 000 r/min离心 10 min , 弃上清 , 取沉
淀。每管加入 800 μL φ=70%乙醇漂洗 20 min , 3 000 r/min离心 10 min , 弃上清 , 重复 1
次。沉淀自然干燥。50μL TE (pH 8.0)溶解。ρ=0.8%琼脂糖凝胶 (加溴已锭至 0.5μg/
mL)、 4.3 V/cm电泳约 1 h , 紫外灯下观察照相 。DNA溶液稀释 50倍后在 Ultrospec 2000
UV/Visible Spectrophotometer(Pharmacia Biotech)上直接读出 A260的值 、 A280的值 、 A260/ A280
的比值 、 样品的浓度 。
1.4　RAPD分析
在Gene Amp PCR System 2400(Perkin Elmer Corporation)上进行 RAPD扩增 。反应体积
25μL , 包括水17.2μL , 10×PCR缓冲液 2.5μL , Mg2+ 2.5μL (2.5mmol/L), dNTP 0.5μL
(每种0.2mmol/L), 引物0.3μL , 模板1μL (70 ng), 稀释Taq酶1.0μL (1.0 U), 反应混
合物用20 μL石蜡油覆盖 。
扩增条件:94 ℃200 s预变性;94 ℃60 s , 36 ℃60 s;72 ℃120 s , 40个循环;72 ℃
600 s , 1个循环;4 ℃保存。RAPD产物经 ρ=1.4%琼脂糖凝胶电泳 (加溴已锭至 0.5μg/
mL), 于紫外灯下观察照相。
1.5　数据处理
任意 2个样本间的遗传距离(D)根据以下公式计算:
D =1-F
F =2NXY/(NX +NY)
其中 , NX 、 NY 分别是样本X 、样本 Y 扩增出的 DNA片段总数 , NXY是样本X 和样本Y 共
有的 DNA片段数 。
根据遗传距离采用 UPGMA发进行聚类分析 , 构建树系图。
2　结果与讨论
对40个 RAPD引物进行了筛选 , 其中 14个引物 (表 2)的扩增结果经琼脂糖凝胶电
泳分离后得到良好且呈多态性的带型 (图 1)。这 14个引物的G+C的百分含量为 60%～
228 中山大学学报论丛 第 22卷　
70%, 每个引物扩增出的DNA片段数为 1 ～ 7个 , 它们在每个样本中获得的 DNA片段总数
平均为40个。这些 DNA片段的分子质量范围在125 ～ 3 500 bp之间 。选择清晰而且重复性
好的谱带作为分子数据进一步分析 。
表 2　引物名称 、碱基序列和扩增后每种植物产生的带型数
名称 序列 植物材料
1)
1 2 3 4 5 6 总计
S29 GGGTAACGCC 2 2 2 2 7 2 17
S61 TTCGAGCCAG 2 2 2 2 2 3 13
S65 GATGACCGCC 1 2 2 2 1 2 10
S90 AGGGCCGTCT 3 4 2 2 2 2 15
S91 TGCCCGTCGT 5 4 4 4 6 4 27
S97 ACGACCGACA 2 6 3 2 5 4 22
S151 GAGTCTCAGG 4 5 2 2 4 4 21
S152 TTATCGCCCC 6 4 4 3 5 5 27
S156 GGTGACTGTG 1 3 1 1 2 1 9
S501 TGCGGGTCCT 1 3 1 3 4 2 14
S507 ACTGGCCTGA 5 3 6 1 1 6 22
S509 TGAGCACGAG 1 1 1 2 4 3 12
S511 GTAGCCGTCT 3 4 2 1 3 5 18
S512 ACAGGTGCGT 4 2 1 2 3 3 15
总和 40 45 33 29 49 46 244
1)1.小羽桫椤 (Cyathea tsangii)2.粗齿桫椤 (Alsophila denticulata)3.黑桫椤 (Alsophila podophylla)4.
白桫椤 (Sphaeropteris brunoniana)5.海南白桫椤 (Sphaeropteris hainanensis)6.桫椤 (Alsophila spinulosa)
图 1　随机引物 S512 (a), S90 (b), S91 (c)扩增产物
1.小羽桫椤 (Cyathea tsangii)2.粗齿桫椤 (Alsophila denticulata)3.黑桫椤 (Alsophila podophylla)
4.白桫椤 (Sphaeropteris brunoniana)5.海南白桫椤 (Sphaeropteris hainanensis)6.桫椤 (Alsophila
spinulosa)7.EcoRⅠ +Hind Ⅲ Markers
229　第 1 期 李雪雁等:中国桫椤科 6种植物的 RAPD分析
　　根据任意 2个样本 RAPD图谱中共有的 DNA片段数和扩增出的 DNA 片段总数 , 可以
求出它们之间的遗传距离 (表 3)。应用 UPGMA发对遗传距离进行聚类分析得到树系图
(图 2)。
表 3　任意 2种植物间的遗传距离 , RAPD图谱中共有的片段数和扩增片段总数
1 2 3 4 5 6
1 0.7411 0.7534 0.9130 0.7978 0.6047
2 11/ 85 0.5641 0.8108 0.6809 0.8021
3 9/ 73 17/ 78 0.8710 0.8293 0.8228
4 3/ 69 7/ 74 4/ 62 0.6410 0.7600
5 9/ 89 15/ 94 7/ 82 4/ 78 0.8316
6 17/ 86 9/ 91 7/ 79 9/ 75 8/95
图 2　根据 RAPD数据 , 应用 UPGMA 法构建的树系图
图2显示6种桫椤科植物聚为 3个类群:①粗齿桫椤 (Alsophila denticulata)和黑桫椤
(Alsophila podophylla);②小羽桫椤 (Cyathea tsangii)(又名阴生桫椤 Alsophila latebrosa)和
桫椤 (Alsophila spinulosa);③白 桫 椤 (Sphaeropteris brunoniana) 和 海 南 白 桫 椤
(Sphaeropteris hainanensis)。类群内的种间遗传距离介于 0.564 1 ～ 0.641 0之间 , 而类群间
的遗传距离最小为 0.680 9。秦仁昌的中国蕨类植物分类系统在桫椤科 (Cyatheaceae)内设
3个属:木桫椤属 (Cyathea)、 白桫椤属 (Sphaeropteris)和黑桫椤属 (Gymnosphaera)。夏
群根据叶柄基部鳞片 、叶轴背面两侧气囊体 、叶轴颜色 、 囊群盖和孢子数目等性状将该分
类方案修订为桫椤科只设白桫椤属 (Sphaeropteris)和桫椤属 (Alsophila), 把黑桫椤属降为
黑桫椤亚属置于桫椤属和桫椤亚属并列[ 5] 。我们的分析结果支持这种处理方式 。
230 中山大学学报论丛 第 22卷　
参考文献:
[ 1] 　TRYON R.Ferns and allied plants with special reference to tropical American[ M] .New York:Spr_Verl , 1982:
138-212.
[ 2] 　郑万钧.中国树木志[ M] .北京:中国林业出版社 , 1985.
[ 3] 　广东植物研究所.海南植物志[ M] .北京:科学出版社 , 1974.
[ 4] 　秦仁昌.中国蕨类植物科属的系统排列和历史来源[ J] .植物分类学报 , 1978 , 16(3):1-19.
[ 5] 　夏群.中国桫椤科植物的分类[ J] .植物分类学报 , 1989 , 27(1):1-16.
RAPD Analysis of Six Chinese Cyatheaceae Plants
LI Xue_yan , ZHENG Bo , XU Yin , CHEN Guo_pei , ZEN Qing_lu , WANG Ting
(School of Life Sciences , Zhongshan University , Guangzhou 510275 , China)
Abstract:RAPD technique was utilized to analyze the taxonomy of 6 Chinese Cyatheaceae plants , Cy-
athea tsangii , Alsophila denticulata , Alsophila podophylla , Sphaeropteris brunoniana , Sphaeropteris
brunoniana and Alsophila spinulosa.Forty primers were screened and 14 of them are able to produce
clear polymorphic patterns.The results generated by using UPGMA algorithm to cluster genetic dis-
tances calculated from RAPD data support Xia Quns taxonomic treatment.
Keywords:Cyatheaceae;RAPD;taxonomy
231　第 1 期 李雪雁等:中国桫椤科 6种植物的 RAPD分析