全 文 ：南京农业大学学报 2013，36(4) :77－82 http:/ /nauxb． njau． edu． cn
Journal of Nanjing Agricultural University doi:10． 7685 / j． issn． 1000－2030． 2013． 04． 013
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收稿日期:2012－04－28
基金项目:广东省教育厅产学研结合项目(2010B090400431) ;江苏省科技支撑计划项目(BE2009347)
作者简介:张鹏，硕士研究生。* 通信作者:冉炜，研究员，博士，研究方向为生物有机肥，E-mail:ranwei@ njau． edu． cn。
张鹏，韦中，朱震，等．生物有机肥对连作番茄和辣椒根际土壤微生物区系及茄科雷尔氏菌的影响［J］． 南京农业大学学报，2013，36(4) :
77－82
生物有机肥对连作番茄和辣椒根际土壤
微生物区系及茄科雷尔氏菌的影响
张鹏，韦中，朱震，高雪莲，邓开英，冉炜* ，沈其荣
(南京农业大学江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室，江苏 南京 210095)
摘要:利用平板计数、实时荧光定量 ＲT-PCＲ和 PCＲ-DGGE指纹图谱等方法研究田间条件下连作番茄和辣椒施用生物有机
肥(BOF)和常规施肥(CK)的根际土壤微生物组成差异。结果表明:与 CK 相比，BOF 处理的番茄和辣椒产量分别提高了
26． 0%和 19． 9%，青枯病发病率分别降低了 41． 5%和 44． 7%;对于未发病植株，与 CK相比，BOF处理的番茄和辣椒植株根
际土壤细菌数量分别增加了 62． 7%和 142． 4%，放线菌数量分别增加了 32． 8%和 39． 6%，真菌数量分别减少了 43． 9%和
53． 1%，病原菌数量分别减少了 73． 2%和 90． 1%;对于发病植株，与 CK相比，BOF处理的番茄和辣椒植株根际土壤细菌和
放线菌数量没有显著差异，但真菌和病原菌数量显著降低。PCＲ-DGGE分析表明，施用 BOF提高了番茄和辣椒植株根际土
壤微生物群落结构多样性指数、丰富度指数和稳定性指数。
关键词:生物有机肥;根际土壤;微生物区系;青枯病;番茄;辣椒
中图分类号:S144 文献标志码:A 文章编号:1000－2030(2013)04－0077－06
Effect of a bio-organic fertilizer on microbial flora and Ｒalstonia
solanacearum population in rhizosphere soils of
continuous cropping tomato and pepper
ZHANG Peng，WEI Zhong，ZHU Zhen，GAO Xuelian，DENG Kaiying，ＲAN Wei* ，SHEN Qirong
(Jiangsu Key Laboratory of Soild Organic Waste Utilization，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China)
Abstract:Microbial flora and Ｒalstonia solanacearum population in rhizosphere soils of continuous cropping tomato and pepper in
field under application of a bio-organic fertilizer(BOF)and conventional management(CK)were studied with focus on the difference
of microflora in rhizosphere soil of tomato and pepper by using plate count，real-time quantitative PCＲ and PCＲ-DGGE fingerprint
techniques． As compared with CK，the BOF treatment increased the yields of tomato and pepper by 26． 0% and 19． 9% and
decreased the bacterial wilt incidence rates of tomato and pepper by 41． 5% and 44． 7%，respectively． For non-diseased plants，the
BOF treatment increased the numbers of bacteria and actinomycetes by 62． 7% and 32． 8% in rhizosphere soils of tomato and by
142． 4% and 39． 6% in rhizosphere soils of pepper，and decreased the numbers of fungi and Ｒ． solanacearum by 43． 9% and 73． 2%
in rhizosphere soils of tomato and by 53． 1% and 90． 1% in rhizosphere soils of pepper，respectively，as compared with CK． For
diseased plants，no significant difference between the BOF treatment and CK existed in the numbers of bacteria and actinomycetes in
rhizosphere soils of both tomato and pepper，but the BOF treatment significantly decreased the numbers of fungi and Ｒ． solanacearum
in rhizosphere soils of both tomato and pepper as compared with CK． PCＲ-DGGE analysis showed that application of BOF enhanced
the diversity，richness and stability indices of microbial community in the rhizosphere soils of tomato and pepper．
Key words:bio-organic fertilizer;rhizosphere soil;microflora;bacterial wilt;tomato;pepper
青枯病是由茄科雷尔氏菌(Ｒalstonia solanacearum)引起的细菌性土传病害，茄科雷尔氏菌具有广泛的
寄主，可侵染 50 多个科的 200 多种植物，其中马铃薯、番茄、烟草和辣椒等茄科作物受害最为严重［1］。连
作容易诱发青枯病等土传病害。我国茄科作物集约化连作种植很普遍，由连作引起的土传病害问题已成
为限制我国经济作物生产的主要因子［2－3］。施用有机肥料，尤其是将有机肥与具有拮抗病原菌生长的功
能微生物相结合制成生物有机肥，对青枯病等土传病害具有较好的防治作用［4－6］，但是，在田间条件下生
南 京 农 业 大 学 学 报 第 36 卷
物有机肥调控根际土壤微生物群落结构的机制尚待进一步研究。土壤微生物区系及功能微生物种群变化
对土壤肥力、土壤中物质转化和作物生长有重要的影响［7］。未发病或健康的植株与发病或受胁迫的植株
产生的根系分泌物在种类和数量上有较大的差异［8］，研究发病与健康作物的根际土壤微生物群落变化可
为青枯病的生物防治提供理论依据。本文通过平板计数、实时荧光定量 PCＲ和 PCＲ-DGGE指纹图谱等方
法研究施用生物有机肥后对番茄和辣椒根际土壤微生物区系和茄科雷尔氏菌种群数量的影响，以期为利
用生物有机肥修复连作障碍土壤提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 生物有机肥的制备
供试功能菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens QL-18) ，对青枯菌 QL-Ｒs1115 有较强的平板
抑制作用［4］。将菌株 QL-18 种子液按 1%接种 NA液体培养基，30 ℃ 170 r·min－1摇床振荡培养 24 h 后，
菌液 5 000 g离心 5 min，将所得菌体用无菌水重悬成 5×109 CFU·mL－1的菌液。供试有机肥为猪粪和菜粕
有机肥，分别购自江苏田娘农业科技有限公司和江苏新天地肥料有限公司［9］。将 1 L 菌株 QL-18 菌悬液
接种至 5 kg猪粪与菜粕混合有机肥(质量比为 1 ∶1)中混和均匀，进行固体发酵，发酵 5 ～ 7 d 后获得生物
有机肥，生物有机肥中拮抗菌数量为 1×109 CFU·g－1。
1． 2 田间试验设计
试验于 2010 年 7—11 月在南京市麒麟镇后村蔬菜大棚进行，该地区种植番茄和辣椒等茄科作物，已
有 10 年青枯病发病史。以不施用生物有机肥的常规水肥管理为对照(CK) ，以施用生物有机肥(BOF)为
单个处理，重复 3 次。每个小区面积 100 m2，种植 250 株苗。BOF采用穴施，施用量为每穴 25 g，CK按照
生物有机肥的最高养分为基准用化肥补齐。供试番茄品种为‘合作 903’，辣椒品种为‘苏椒 5 号’。
1． 3 测定项目与方法
1． 3． 1 发病率和产量统计 作物移栽 25 d左右植株开始出现萎蔫，病茎维管束变黑褐色。移栽后 45 d
统计发病率。秋季种植季结束收获时分别计算每小区产量，然后换算成 t·hm－2。
1． 3． 2 样品采集及根际土壤的获得 移栽后 45 d在每小区分别采集健康(healthy，H)和发病(wilted，W)
植株样品，即未施肥发病型(CKw)、未施肥健康型(CKH)、施肥发病型(BOFw)和施肥健康型(BOFH)。同
一处理小区的健康和发病植株样品分别混合。用手轻抖植物根系，然后放入离心管中超声波震荡，分离根
际土。用 DNA提取试剂盒(MOBIO Laboratories，Carlsbad，CA，USA)提取根际土壤样品总 DNA。
1． 3． 3 土壤根际土中细菌、真菌和放线菌的数量测定 微生物数量采用稀释平板法［10］计数，将 10 g混合
土样稀释成 10－1、10－2、10－3、10－4和 10－5等不同稀释梯度的土壤溶液。用无菌吸管分别由不同稀释梯度的
土壤溶液中各吸取 0． 1 mL放入培养基平板，涂布均匀，于 28 ℃培养箱培养。细菌采用牛肉膏蛋白胨培养
基，放线菌采用高氏 1 号培养基，真菌采用马丁氏培养基［10］。
1． 3． 4 土壤根际土中 Ｒalstonia solanacearum的数量测定 以青枯病病原菌(Ｒalstonia solanacearum)flic
基因的特异性引物［11］(F:5-GAACGCCAACGGTGCGAACT-3;Ｒ:5-GGCGGCCTTCAGGGAGGTC-3)进行
Ｒeal-time qPCＲ，扩增产物为 400 bp。用 CTAB法［11］提取青枯菌 QL-Ｒs1115 总 DNA，用上述引物进行扩增
并将基因片段纯化后与 pMD19-T(TaKaＲa)进行酶连，用热激法转化酶联产物到 E． coli DH5α。用碱裂解
法提取质粒［12］，用 NanoDrop 2000 超微量分光光度计检测质粒浓度和纯度。将阳性质粒依次稀释 10 倍，
成 8 个浓度梯度，每个梯度 3 次重复，最后选取扩增效率高的 5 ～ 6 个梯度用于标准曲线的绘制。阴性对
照以无菌超纯水代替。采用 TaKaＲa公司的实时荧光 PCＲ试剂盒 SYBＲ Premix Ex TaqTM在 ABI 7500TM实
时荧光定量 PCＲ检测仪上运行。反应体系(20 μL) :SYBＲ Premix Ex TaqTM(2×)10 μL，ＲOX Ｒeference
Dye(50×)0． 4 μL，上、下游引物(10 mmol·L－1)各 0． 4 μL，DNA模板 2 μL，双蒸水 6． 8 μL。两步法 PCＲ扩
增程序:第 1 步为 95 ℃ 30 s;第 2 步为 95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40 个循环。
1． 3． 5 PCＲ-DGGE指纹图谱分析 采用 16S rDNA通用引物 338f /518r(5-GC clamp-ACTCCTACGGGAG
GCAGCAG-3 /5-ATTACCGCGGCTGCTGG-3)扩增细菌 V3 区片段［13］;真菌 PCＲ-DGGE 扩增采用 18S
rDNA 引物 NS1 /GCFung(5-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3 /5-GC clamp-ATTCCCCGTTACCCGTTG-3) ，其
中 GC clamp 为 5-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCC-3［14］。PCＲ 反应条件为:
95 ℃ 4 min;94 ℃ 1 min，61 ℃(真菌退火温度为 58 ℃)45 s，72 ℃ 45 s，30 个循环;72 ℃ 10 min。反应体
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第 4 期 张鹏，等:生物有机肥对连作番茄和辣椒根际土壤微生物区系及茄科雷尔氏菌的影响
系(50 μL) :10×PCＲ Buffer(Mg2+ Plus) (TaKaＲa DＲ001B)5 μL，dNTP Mixture(各 2． 5 mmol·L－1)4 μL，
20 pmol·L－1的引物各 1 μL，Taq酶(5 U·μL－1)0． 2 μL，DNA模板 10 ng。扩增产物经 15 g·L－1琼脂糖凝胶
电泳检验后，4 ℃保存。聚丙烯酰胺凝胶浓度为 8%，细菌 DGGE的变性剂梯度为 45% ～55%，真菌 DGGE
的变性剂梯度为 30% ～45%。电泳条件:60 ℃恒温，电压为 80 V，电泳时间为 16 h。电泳结束后银染并
扫描。
1． 4 数据分析
数据统计分别使用 SPSS 13 软件、7500 System Software软件、Quantity One 软件分析完成，采用邓肯氏
新复极差法检验各处理间差异显著性，利用Microsoft Excel 2003 作图。用 Quantity One分析 DGGE指纹图
谱，计算香农多样性指数(Shannons diversity index，H) ，H = －∑ pi lnpi，其中:pi 为 DGGE 条带 i 的相对
丰度;计算各群落的均匀度指数(Evenness index，E) ，E =H / lnＲ，其中:Ｒ 为丰富度(Ｒichness) ，表示总的
DGGE条带数;计算各群落的稳定性指数(Stability index，S) ，S =∑ (pi /pi，max)/n，其中:pi，max为群落中丰
度值最大的条带 i，n是 DGGE胶片上的样品数［15］。
2 结果与分析
2． 1 施用生物有机肥对番茄和辣椒产量的影响
由图 1 可知，施用生物有机肥能显著提高作物产量。BOF 处理的番茄产量是 CK 的 1． 26 倍，BOF 处
理的辣椒产量是 CK的 1． 20 倍，且差异显著。
图 1 施用生物有机肥(BOF)对番茄(A)和辣椒(B)产量的影响
Fig． 1 Effects of application of bio-organic fertilzer(BOF)on the yields of tomato(A)and pepper(B)
1)CK．对照 Control;BOF．施用生物有机肥 The soil treated with bio-organic fertilizer
2)不同字母表示在 0． 05 水平差异显著。Different letters mean significant difference at 0． 05 level． The same as follows．
2． 2 施用生物有机肥对番茄和辣椒发病率的影响
由图 2 可知，施用生物有机肥能显著降低青枯病的发病率。番茄 CK的发病率为 42． 67%，是 BOF处
理的 1． 71 倍;辣椒 CK的发病率是 34． 27%，是 BOF处理的 1． 81 倍。
图 2 施用 BOF对番茄(A)和辣椒(B)青枯病发病率的影响
Fig． 2 Effects of application of BOF on the incidences of bacterial wilt of tomato(A)and pepper(B)
2． 3 施用生物有机肥对番茄和辣椒根际土壤中青枯病病原菌数量的影响
从图 3 可知，番茄 CKw 的病原菌数量为 8． 62×10
7 g－1，显著高于其他样品，BOFH 的为 6． 51×10
5 g－1，显
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南 京 农 业 大 学 学 报 第 36 卷
著低于其他样品。CKH 和 BOFH 与 CKw 和 BOFw 分别比较可知，健康植株根际土病原菌的数量低于发病
植株根际土病原菌数量 1 ～ 2 个数量级(P＜0． 05)。施用 BOF 的番茄和辣椒的根际土壤病原菌数量减少
了 73． 2%和 90． 1%。雷尔氏菌荧光定量 PCＲ标准曲线方程为 y = －3． 294x+44． 925，Ｒ2 = 0． 999 8，扩增效
率(E)为 1． 01。
图 3 BOF对番茄(A)和辣椒(B)根际土壤中青枯病病原菌数量的影响
Fig． 3 Effects of application of BOF on the population of Ｒalstonia solanacearum
in the rhizosphere soil of tomato(A)and pepper(B)
CKw:未施用生物有机肥的发病型 Control but wilted;CKH:未施用生物有机肥的健康型 Control but healthy;BOFw:施用
生物有机肥的发病型 Treatment treated with BOF but wilted;BOFH:施用生物有机肥的健康型 Treatment treated with BOF but
healthy． The same as follows．
2． 4 施用生物有机肥对根际土壤中可培养微生物数量的影响
由图 4 可知，从番茄和辣椒的 CKw 和 BOFw 与 CKH 和 BOFH 分别比较可知，健康的根际土中细菌数量
显著高于发病的，相差 1 个数量级。番茄和辣椒的 BOFH 根际土的细菌数量是 CKH 根际土的 1． 63 和
2. 43 倍，辣椒 BOFH 根际土的细菌数量是番茄根际土细菌数量的 1． 43 倍;番茄和辣椒的 BOFw 和 BOFH 根
际土的真菌数量显著低于 CKw 和 CKH 根际土的真菌数量，分别减少了 43. 9%和 53． 1%;健康植株的根际
土放线菌数量显著高于发病植株，番茄和辣椒 BOFH 根际土的放线菌数量是 CKH 根际土的 1． 32 和 1． 39
倍。因此，施用生物有机肥能显著增加根际土壤中细菌和放线菌的数量，减少真菌的数量。
图 4 对照和施用 BOF处理中番茄(A)和辣椒(B)健康和发病植株根际土壤可培养微生物数量
Fig． 4 Populations of cultured soil microbial flora in the rhizosphere soil of healthy and wilted tomato(A)
and pepper(B)plants treated with BOF and CK
2． 5 DGGE指纹图谱分析
对细菌 DGGE指纹图谱(图 5)进行聚类分析，在 0． 17 ～ 0． 48 的相似度水平上被分为 6 组，其中番茄
和辣椒 BOFH 根际土的 DGGE带谱相似性达到 48%，番茄 BOFw 根际土与其他样品根际土的差异最大，
DGGE带谱相似性为 17%，CK与 BOF处理的 DGGE带谱相似性存在显著差异。对真菌 DGGE 指纹图谱
进行聚类分析，在 0． 48 ～ 0． 69 相似度的水平上被分为 6 组，其中辣椒和番茄 CKw 根际土的 DGGE 带谱相
似性达到 69%，番茄和辣椒 BOFH 根际土的 DGGE带谱相似性为 57%。
对根际土壤细菌群落的丰富度、多样性、均匀度及稳定性指数(表 1)进行比较分析可以看出，辣椒与
番茄 BOFH 根际土细菌的丰富度指数和多样性指数分别是 36 和 3． 58 与 35 和 3． 56，明显高于其他样品;
辣椒与番茄 BOFH 根际土的细菌和真菌的稳定性指数分别是 4． 17 和 3． 35 与 3． 95 和 2． 75，明显高于其他
样品。
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第 4 期 张鹏，等:生物有机肥对连作番茄和辣椒根际土壤微生物区系及茄科雷尔氏菌的影响
图 5 番茄和辣椒根际土壤中细菌(A)和真菌(B)DGGE电泳图谱及聚类分析树
Fig． 5 DGGE banding patterns and phylogenetic tree with clustering analysis of bacteria(A)
and fungi(B)communities of tomato and pepper
TCKw:未施用生物有机肥的发病番茄型 Control but wilted of tomato;TCKH:未施用生物有机肥的健康番茄型 Control but
healthy of tomato;TBOFw:施用生物有机肥的发病番茄型 Treatment treated with BOF but wilted of tomato;TBOFH:施用生物有机肥
的健康番茄型 Treatment treated with BOF but healthy of tomato;PCKw:未施用生物有机肥的发病辣椒型 Control but wilted of
pepper;PCKH:未施用生物有机肥的健康辣椒型 Control but healthy of pepper;PBOFw:施用生物有机肥的发病辣椒型 Treatment
treated with BOF but wilted of pepper;PBOFH:施用生物有机肥的健康辣椒型 Treatment treated with BOF but healthy of pepper．
表 1 番茄和辣椒根际土壤微生物群落的丰富度、多样性、均匀度及稳定性指数
Table 1 The indices of richness，Shannons diversity，evenness and stability of the microbial community of
the rhizosphere soil of tomato and pepper
作物
Crop
处理
Treatment
丰富度指数
Ｒichness index
细菌 Bacteria 真菌 Fungi
多样性指数
Shannons diversity index
细菌 Bacteria 真菌 Fungi
均匀性指数
Evenness index
细菌 Bacteria 真菌 Fungi
稳定性指数
Stability index
细菌 Bacteria 真菌 Fungi
CKw 30 22 3． 40 3． 08 0． 998 0． 998 3． 19 2． 46
番茄 CKH 32 25 3． 46 3． 20 0． 999 0． 994 3． 60 2． 54
Tomato BOFw 30 22 2． 40 3． 08 0． 999 0． 998 3． 34 2． 53
BOFH 35 24 3． 56 3． 17 0． 999 0． 999 3． 95 2． 75
CKw 29 24 3． 36 3． 17 0． 999 0． 997 3． 24 2． 50
辣椒 CKH 32 25 3． 46 3． 20 0． 999 0． 996 3． 68 2． 74
Pepper BOFw 32 28 3． 46 3． 31 0． 999 0． 993 3． 64 2． 88
BOFH 36 30 3． 58 3． 39 0． 999 0． 998 4． 17 3． 35
3 讨论
在田间连作土壤中施用生物有机肥显著增加了番茄和辣椒的产量，降低了发病率，说明生物有机肥可
以用于综合防治青枯病。凌宁等［16］对西瓜的研究也表明施用生物有机肥能显著降低西瓜发病率和促进
西瓜植株的生长，增加其产量。施用生物有机肥能够减少作物根际土壤中病原菌的数量，有效防止青枯病
的发生，可能是由于生物有机肥中的拮抗微生物在植物根表或根内定殖，并与病原菌发生拮抗作用，减少
根际病原菌的数量，从而保护植株免受病原菌侵染［17－19］。
同一土壤中不同茄科作物受青枯菌侵染却表现出不同的发病程度，可能与不同作物的根际土壤的微
生物群落结构存在差异有关。2 种作物健康与发病类型土壤的微生物种群类型及数量都存在显著差异，
施用生物有机肥对 2 种作物根际微生物区系调控程度存在差异，这可能与作物根系分泌物不同有关。
土壤微生物区系失去平衡是作物连作产生障碍的主要因素之一，因此在研究克服连作障碍的施肥过
程中，不仅要抑制土传病原菌的数量，而且要提高有益细菌和放线菌的数量［20－21］。生物有机肥的生防机
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南 京 农 业 大 学 学 报 第 36 卷
制是通过改变作物根际土壤中生物种群类型及数量从而改变根际区系微生物环境。王超等［22］认为土壤
中细菌、放线菌数量与土壤养分含量及作物产量呈显著正相关，而真菌数量与养分含量之间相关性较差。
由于微生物平板计数只能反映出根际土壤中可培养的微生物种群数量的变化，并不能反映出根际微生物
区系的整体动态，因此在研究调控土壤微生物区系中有一定的局限性。
生物有机肥对根际土壤微生物区系的调控作用，可能与其防治青枯病的生防机制相关。张慧［23］通过
DGGE的方法分析生物有机肥对棉花连作土壤中微生物区系的影响时发现，细菌 DGGE 指纹图谱的条带
数明显增多。Gorissen等［24］发现施用猪粪有机肥可以有效控制马铃薯青枯病，对土壤细菌群落结构进行
DGGE分析发现，土壤细菌多样性随着土壤中细菌数量增加和抑真菌能力提高而增加，且细菌群落结构发
生了变化。植物土传病害的生物防治在一定程度上依赖于土壤微生物的群体作用，当土壤微生物群落结
构越丰富，物种越均匀，多样性越高时，对抗病原菌的综合能力增强［25－26］。因此，生物有机肥可以通过对
作物根际土壤微生物群落结构的调控实现对番茄和辣椒青枯病的生物防治。
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责任编辑:刘怡辰
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