全 文 ：第 20 卷第 3期
2 0 0 2年 9月
上 海 交 通 大 学 学 报 (农 业 科 学 版 )
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文章编号 ; 10 0 0一 x 9 3X ( 2 0 0 2 ) 0 3一 0 2 5 8一 0 3
一种适于杉科植物遗传多样性分析的 R A P D
体系的建立初探
陈云鹏 ` , 2 , 潘士华 3 , 张建军 4 , 竺唯杰” , 纽慧娟 3 ,
曲志才 2 , 王敬文 2 , 沈大棱“ ,叶增基 3
l(
. 上海交通大学 植物科学系 , 上海 2 01 1 01 ; 2 . 复旦大学 遗传所 ,上海 2 0 04 3 3 ;
3
. 上海市 林业站 ,上海 2 0 0 0 7 2 ; 4 . 上海市农科院 作物育种栽培研究所 ,上海 2 0 1 1 0 6)
摘 要 : 以基西哥落羽衫 、 中国柳衫及 日本柳衫为代表样品 ,摸索出一套适于衫科植物遗传分析的 R A P D 方法 ,通过大贵的
引物筛选和扩大所用引物数童 ,将能从理论上筛选出特定的引物对 , 用 于衫科植物的真很杂种鉴定 、 亲本确认以及分类学
的研究 。
关健词 :植物遗传多样性 ; R A P D
中图分类号 : Q 943 文献标识码 : B
A P r im a r y S t u d y o n R A P D a n a ly s is o f g e n e t i e r e la t io n s h iP s
a m o n g t h e n a t u r a l P o P u l a t io n S o f T a x o d i u m P la n t
C H E N 介 n 一 P e n g , , 2 , p A N S h i一 u a 3 , ZH A N G iJ a n 一 ju n 4 , Z H U W e i 一 ije 3 , N 刀少 月“ i 一少“ 口 n 3 ,
Q U z 入i一 a i Z , W A N G iJ , g 一二 e 二 2 , S H E N aD
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S h a n g h a i 2 0 0 4 3 3 ; 3
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S h a n g h a i F o r e s t r y S t a t io n
,
Sh a n g h a i 2 0 0 0 7 2 ; 4
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C r o p B r e e d i n g a n d
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u lt iv a t io n R e s e a r e h In s t it u t e
,
S h a n g h a i A e a d e m y o f A g r ie u lt u r a l趾 i e n e e , Sh a n g h a i 2 0 1 1 0 6 , Ch i n a )
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记 iu m P l a n t w i t h s P e e i f ie P r im e r P a ir s e h o s e n f r o m a b u n d a n t P r im e r s .
K e y wo dr
s : g e n e t i
e P o l y m o r p h i s m o f P l a n t ; r a n d o m a m P l if ie d P o ly m o r Ph ie D N A
随机扩增多态性 D N A ( R a n d o m a m p l i f i e d p o ly m o r p h i c D N A , R A P D )分子标记技术 , 一经发明即广
泛用于生命科学的各个领域 , 充分显示了其简单 、 快捷 、 灵活和成本低的优点 1[] , 但迄今尚未见有其在杉科
植物遗传多样性研究中的系统报道 z[, 3〕。 早期该领域的研究局限于细胞遗传学和形态学的分析 , 所得到的
信息毕竟有限 , 要想对大量的杉科植物进行快速系统地遗传学分析 , R A P D 分子标记技术无疑具有相当
的优越性 。 本文探讨一套成熟的能用于杉科植物的 R A P D 分析体系 , 以期为衫科植物生产实践中的杂种
鉴定 、亲本确认以及品种鉴别等提供分子生物学证据 。
收稿日期 : 2 0 0 1一 1 2一 14 ;修稿日期 : 2 0 0 2一 03一 2 0
基金项日 `上海市农委科技攻关项目 ( 2 0 01 一 5)
作者简介 : 陈云鹏 ( 19 7 2一 ) , 男 , 湖北黄梅人 ,讲师 ,复旦大学在职博士 .
第 3期 陈云鹅 ,等 :一种适于杉科植物遗传多样性分析的 R A P D 体系的建立初探 2 5 9
1 材料和方法
1
.
1 材料
供试材料 12 份 (表 1 ) ,包括杂交墨西哥落羽杉 、 中国柳衫和 日本柳杉 , 均由上海市林业站提供 。 分别
取营养枝上的成熟新鲜叶片 ,低温保存于复旦大学遗传所植物遗传工程组 。
表 1 供试材料
aT 目 e 1 E x衅 r i. en 回 . at ier 目 s
编号 样品名称 拉丁名 采集地
ùeonrTó胡们用勿琳优邢用锐脚沉加ù杂交墨西哥落羽杉杂交. 西哥落羽衫杂交 . 西哥落羽衫
杂交呈西哥落羽衫
杂交墨西哥落羽衫
墨西哥落羽杉 (母本 )
杂交里西哥落羽杉
日本柳杉
杂交基西哥落羽杉
杂交里西哥落羽衫
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川沙林场
上海松江
上海松江
川沙林场
上海植物园
江苏南京
江苏南京
南京中山植物园
江苏镇江
松江实验林场
上海植物园
上海植物园
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1
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2 方法
1
.
2
.
1 D N A 提取方法 按照 K ob ay as ih 等4[] 的方法稍加改进 。 取 1 ~ 2 9 叶片 ,放人研钵中 , 迅速加人液
氮充分研磨成粉 , 分装在 1 . 5 m l离心管中 , 每管 1 0 0 ~ 2 0 0 m g ,加人 一血1 D N A 提取缓冲液 I ( 5 0 m m o l / L
T r i s 一 H C L ( pH s . o ) 、 5 m m o l / L E D T A 、 5 5 0 m m o l / L 山梨醉 、 0 . 1%乒一琉基乙醇 、 1 0 % P E G 6 0 0 o ) , 充分混
匀后 , 以 12 O0 r /m in 于 4℃下离心 5 m in ,倒去上清液 ,沉淀重悬于 0 . 5 时 D N A 提取缓冲液 l (1 %月桂
酞基肌氮酸钠 、 7 10 m m ol / L N a CI 、 。 . 1% C T A B ,其余成分同 D N A 提取缓冲液 I ) ,放人 60 ℃水浴中 25 一
5 0 im n
, 加人等体积的抓仿 : 异戊醇 ( 2 4 : i ) ,小心混匀 1 5 .而 n ,室温下以 1 2 o o o r / m i n 离心 1 5 而 n ,上清
液转人新的 1 . 5 m l离心管 ,加人 5 0 拌1 10 % C T A a / 0 . 7 m o l / L N a C I溶液 , 置 6 5 ,C 的水浴中 2 0 m i n ,再加
人等体积的抓仿 : 异戊醉 ( V那 , 2 4 : 1 ) ,小心混匀 1 0 m i n , 室温下以 12 o o o r /而 n 离心 1 5 m i n , 若上清液粘
稠浑浊 , 重复 10 % c T A B 0/ . 7 mo l / L N ac l抽提步骤 , 取上清液 , 加人 0 . 7倍体积预冷的异丙醇 ( 一 20 ℃ ) ,
轻轻摇匀 ,将离心管置于冰箱中沉淀 D N A S~ 10 而 n , 以 12 o o r / m in 于 4℃下离心 5 m in , D N A 沉淀用
80 。 川 70 % 乙醇洗涤 2 次 , 自然风干后 ,溶于 40 沁 T E 中 。 D N A 浓度用琼脂糖凝胶比色法与标准浓度的
泪ON A 分子标记物比较确定 。
1
.
2
.
2 引物 选用十碱基寡聚核昔酸随机引物 , 上海 aS gn on 公司产品 , O (D 26 。 )值为 0 . 2 。
1
.
2
.
3 A P一 P C R 反应体系组成及扩增程序 扩增反应在 iB o m et ar T G R A D IE N T 型 P C R 仪上进行 , 反
应体积 20 川 ,反应体系参照曹家树等 s[] 的方法稍作修改 : 10 x P C R 缓冲液 (终浓度 I X ) , 2 . 5 m m O I / L
M g CI
: , 0
.
2 5
un
o l / L dN ” s , 2 4 n g 引物 , 1 0 ~ 2 0 n g 模板 , 1 . 2 U T a q D N A 聚合酶 , p C R 所需试剂均购
自上海 aS gn on 公司 。 反应参数设置参照文献 [幻 ,并作适当修改 ,反应程序为 : 于 94 ℃中预变性 4 m in ;再
在 94 ℃ 中变性 。 . 5 而 n , 35 ℃ 中复性 1 面 n , 72 ℃ 中延伸 1 . 5 m in , 45 个循环 ;最后一步延伸 7 m in 。
P C R 产物在 1 . 5%琼脂糖凝胶上 , 70 v 稳压电泳 2 . s h , 电泳结果通过 F R 一 20 _型凝胶成像系统观察
记录 `