全 文 ：2003年 7月 内蒙古大学学报 (自然科学版 ) Jul. 2003第 34卷第 4期 Acta Scientiarum Naturalium Univ ersi tati s NeiM ongol Vol. 34 No. 4
　　文章编号: 1000- 1638( 2003) 04-0420-05
西鄂尔多斯特有种四合木与同生境下
蒺藜科三个种的核 rDN A IT S的序列比较研究①
张颖娟 ,杨　持 ,成文联
(内蒙古大学生态与环境科学系 ,呼和浩特 010021)
摘要:为揭示分布于西鄂尔多斯高原的中国特有种四合木对生境的适应性及与其他属的亲缘
关系 ,用 PC R直接测序方法 ,对四合木与同生境蒺藜科 ( Zygophllyaceae )其他 3个种的核糖体
DN A ITS片段进行了序列分析 .结果表明 , 4种植物在 ITS片段长度、 GC百分含量和变异位
点数上均存在一定差异 . ITS1长 177～ 212bp, ITS2长 218～ 237bp; GC含量为 57. 7% ～ 62% ,
信息位点比例 30. 1% .系统发育分析表明 ,四合木 ( Tetraena mongolica Maxim )与霸王
( Zygophyllum xanthoxy lum Maxim)在系统位置上较相近 ,白刺 (Nitraria sibirica Pall)与蒺藜
( Tribulus terrestris L. )较相近 . IT S所揭示的亲缘关系与这些种的形态学和胚胎学特征相似 .
关键词: nrDN A ITS;四合木 ;霸王 ;白刺 ;蒺藜 ;系统位置
中图分类号: Q751; Q19　　文献标识码: A
　　西鄂尔多斯高原是我国生物多样性保育的关键地区之一 ,区系起源古老 ,多是古地中海干旱植物
的后裔 ,集中分布着一批国家重点保护的残遗植物 ,成为亚洲中部荒漠区特有植物的避难所〔1〕 .特别
是有些属种在当地甚至在相邻植物区内都很少找到他们的亲缘关系 ,如四合木属 ,其形态独特 ,系统
分类地位难以确定 .研究该地区植物分子水平上的演化 ,对阐明该地区近缘科属的演化关系 ,揭示植
物的系统发育、区系形成及其与环境演变的关系有重要意义 .
随着分子生物学技术的迅速发展 ,植物系统与进化研究在分子水平上已获得了丰富的资料 ,为解
决分类学、系统发育、物种形成与进化等方面的难题提供了有力的技术支持 .近年来 ,植物 I TS序列
成为研究植物系统与进化的重要分子标记 .植物细胞的核糖体 DNA是高度重复的串联序列 ,核
rDN A的内转录间隔区 ( inter nal t ranscribed spacer, ITS)位于 18s- 26s rDN A之间 ,被 5. 8s rDN A
分为两部分 ,即 ITS1和 ITS2.被子植物的 ITS序列长度较裸子植物稳定 ,包括 5. 8s在内的总长度不
超过 700bp,且进化速度快 ,加上协同进化 (concerted evolution)使不同 IT S片段在基因组不同重复
单位间趋于一致 ,为测序提供了极大方便 .近年来 ,随着 PCR技术的发展 , ITS序列分析成为研究被
子植物科内系统发育和进化 ,尤其是近缘属间和近缘种间关系的重要方法〔 2～ 5〕 .
蒺藜科全世界约 25属 ,内蒙古有 5属 12种 ,多数是旱生或强旱生植物 .分布于西鄂尔多斯高原
的四合木 ,形成了该地区重要的植物群落和建群种 .有关四合木的研究一直停留在形态学和细胞学水
平 ,在分子水平上的研究极少〔 6～ 7〕 .本实验采用 PCR直接测序的方法 ,首次对该地区四合木与同一生
境下的蒺藜科 3种植物进行了核糖体 DNA ITS片段的序列分析 ,结合形态和胚胎方面的证据 ,探讨
各属之间的分类地位与生态和进化关系 ,为进一步采用 ITS片段探讨蒺藜科的系统分类和进化奠定
基础 .
① 收稿日期: 2002-02-27基金项目: 国家重点基础研究发展规划 ( G2000048704) ;国家自然科学基金项目 ( 30160020)作者简介: 张颖娟 ( 1970～ ) , 女 ,内蒙古大学 1999级博士研究生 .
1　材料和方法
1. 1　实验材料
本实验中 ,蒺藜 ( T . terrestris L. ) ,四合木 ( T . mongol ica Maxim ) ,霸王 ( Z . xanthoxylum Maxim ) ,
白刺 (N . sibirica Pall)均取自内蒙古乌海市巴音温都尔保护区 ,采集幼叶冰冻保存 .
1. 2　总 DNA提取
总 DNA提取采用 CTAB法 ,步骤如下:每个种选 1～ 2个个体 ,用大约 0. 5g的叶片混合石英砂
在液氮中研磨 ,细沫倒入 Eppendrof管 ,加入预热至 90℃的含 0. 5% β-巯基乙醇的 2× CTAB提取液
2 m L,混匀后于 65℃水浴保温 60 min.然后加 2 mL氯仿 -异戊醇 ( 24∶ 1) , 5000g离心 10 min,取上
清液加入 0. 6体积 - 20℃异丙醇静置数分钟 , 5000 g离心 5 min,弃上清液后加入 1 m L 65℃的 2×
CT AB,水浴 30 min.用等体积的氯仿 -异戊醇再抽提一次 ,上清液中加入 2 /3体积的异丙醇 , 10000
T /min离心 5 min,弃上清液 ,沉淀用 70%的乙醇洗涤 2次 ,风干后加入 200μL 1 mol /L TE溶解
DNA,置 4℃备用 .
1. 3　核糖体 DNA ITS片段 PCR扩增
PCR反应扩增核基因组的 ITS片段 ( 5 18s - 3 26s)采用的引物为 18s上 ITS1 ( 5 -
CGTAACAAGGTT TCCGTAGG- 3 )和 26s上的 IT S4 ( 5 - TCCTCCGCTT ATT GATATGC-
3 ) . 50μL反应体系含: 33. 36μL双蒸水 , 5μL 10× Buffer, 5μL 2. 5× 10- 2 mol /L M gCl2 , 1μL 1. 0×
10
- 2
mol /L dN TP, 1. 4μL引物 , 1. 2U Taq酶和 4μL DNA模板 . PCR扩增条件为: 94℃预变性
5min, 94℃ 1min, 55℃ 1min, 72℃ 1min,循环 30次 ,最后 72℃延伸 5min, 4℃保温 .
1. 4　 IT S测序
测序引物除上述 2个外 ,补充位于 5. 8s上的 ITS2( 5 - GCT GCGT TCT TCATCGATGC- 3 )和
ITS3( 5 - GCATCGATGAAGAACGCAGC- 3 ) ,从而使 ITS1和 ITS2两个片段在正反方向测序以
保证测序的准确 .将扩增产物和引物送上海生工公司直接测序 .
1. 5　序列数据分析
根据在近缘类群中已有报道的序列资料确定核糖体 DNA两个非编码转录间隔区 ( I TS1和
ITS2)和 3个编码区 ( 18s、 5. 8s及 26s)的界限 .因最大空位 ( g ap)含多个碱基 , I TS序列的排序通过计
算软件调整并分类 .
表 1　 4个种的 ITS序列及其变化
Table 1　 ITS sequences and their variance of four species
ITS1 ITS2 Tota l
长度 177- 212 218- 237 396- 436
变异位点 102 77 179( 45. 5% )
信息位点 79 52 131( 30. 1% )
G+ C% 53. 8% ～ 59. 9% 61. 6% ～ 65. 7% 57. 7% ～ 62%
2　结果分析
2. 1　 IT S片段的长度和变异
本研究测定的 IT S序列长约 600bp(包括 5. 8S) ,有关序列详见图 1.序列长度、 G+ C百分含量及
序列间的变化见表 1.
4个种间 , IT S1长度在 177- 212bp之间变化 ,其中最大空位为 9bp( 118- 127bp) ; ITS2长度在
218- 237之间变化 ,最大空位 6bp( 243- 248bp, 360- 365bp) ,显然 ITS2长度大于 IT S1,但 ITS1的
变异大于 ITS2.
整个 ITS长度差异较大 ,其中白刺的 ITS片段最短 ( 396bp) ,而它的 G+ C含量最高 . G+ C百分
含量 ITS1从 53. 8% - 59. 5% , I TS2从 61. 6% - 65. 7% , IT S片段平均为 60% .
421第 4期 张颖娟等　西鄂尔多斯特有种四合木与同生境下蒺藜科三个种的核 rDNA IT S的序列比较研究
2. 2　 IT S序列的系统发育分析
根据图 1的序列 ,将空位处理为数据缺失 ,聚类结果显示为四合木与霸王关系较近 ,白刺与蒺藜
关系较近 .所测样品的核糖体内转录间隔区共有 179个变异位点 , 131个是具有系统发育的信息位
点 ,分别占总序列的 45. 5%和 30. 1% .其中 ITS1有 102个变异位点 , 79个具有系统发育信息的位
点 ; ITS2有 77个变异位点 , 52个具有系统发育信息的位点 .系统发育的位点主要分布在 IT S1片段
上 ; ITS片段除发生较频繁的缺失外 ,以碱基替换和转换为进化形式 .从 I TS2片段看 ,白刺与蒺藜的
序列几乎一致 ,表现出极强的亲缘关系 ;而四合木和霸王在 I TS1片段上更相近 .整个 ITS片段 4个
种之间的差异明显 ,这种高变异量反映了物种起源古老 ,各种间分化历史较长 ,相对较孤立 .
图 1　蒺藜科 4个属植物排序后的 ITS序列 (横线代表空格 ,点代表与第一个中相同的碱基 )
Fig. 1　 Aligned ITS sequence of 4 species o f Zygophylla ceae ( Ba rs= the gaps,
do ts= sam e sequences to th e first ta xon)
3　讨　论
3. 1　被子植物的 ITS长度比较保守 ,但核苷酸序列变化较大 ,能提供丰富的系统学信息 .研究表明 ,
被子植物 ITS1长度为 187- 298bp, ITS2长度为 187- 252bp,但 ITS1与 ITS2的相对长度和碱基变
422 内蒙古大学学报 (自然科学版 ) 2003年
化在不同的科属间变化较大 .如在 Caly cadenia、 Gentiana和 Winteraceae等〔 8～ 10〕科属的研究中 IT S1
的长度和变化较 ITS2大 ,而在 Maloideae、 Betulaceae和 Viscaceae等科中 ITS2的长度和碱基变化
较 IT S1大〔2, 4, 9〕 . I TS1和 ITS2序列的变异程度为探讨进化和物种形成等机制提供了有力证据〔 11〕 ,但
在不同的植物和不同的分类地位上 , ITS序列资料的价值不同 ,因为不同物种的起源时间和进化速度
不同 , IT S序列所含的信息也不同〔 5〕 .如对蔷薇科的苹果亚科 ( Maloideae) 19个属的研究 , IT S序列信
息位点比例为 27. 3% , 本研究 4个种的信息位点就达 30. 1% ,差异显著 ,可能反映了蒺藜科各属因
生存适应而产生的进化上的差异 ,同时反映了它们不同的进化过程 .但考虑到实验材料有限 ,蒺藜科
在这方面的资料较少 ,这些结果是否真正具有系统学意义 ,还需要进一步证实 .
3. 2　 ITS序列反映了系统进化的关系 ,相关的物种在 18s- 5. 8s- 26s rDN A有相似的分布和序列
组成 .有关蒺藜科系统位置和系统学的研究一直存在尚未解决的问题 ,尤其是四合木的分类地位 ,本
实验试图从分子水平上提供有关证据 .测定的 4种植物 I TS序列尤其是 I TS1序列显示出较大的差
异性 ,反映了各属间的相对孤立性 ,这和以往所做的形态学、胚胎学及等位酶的研究结果相似〔6, 13～ 15〕 .
马毓泉〔16〕对四合木系统地位研究表明其染色体为 2n= 28,是该科中较原始的类群 ,将它从霸王亚科
分出 ,成立新的四合木亚科 ;对四合木胚胎学特征研究提出它与蒺藜科具较近亲源关系 ,但又有明显
区别 ,“四合木是否从蒺藜科分出 ,值得进一步研究”〔17〕 .维娜〔 13〕对四合木和霸王茎叶解剖结构研究发
现二者有明显差异 ,以不同方式适应干旱环境 ,这些差异特征支持成立四合木亚科 .胚胎学研究发现 ,
白刺属在花药壁的发育、雌蕊结果、珠被绒毡层有无及果实的发育和类型等方面与蒺藜科其它属存在
明显的差异 ,白刺是该科中较为进化的类群 ,胚胎学特征支持将白刺属独立为白刺科 ( Nit rariaceae) .
染色体的研究表明 ,白刺的染色体数目为 2n= 24,核型为“ 1A”型 ,蒺藜染色体数目为 2n= 30,核型为
“ 1B”型 .本实验发现 ,四合木与霸王在整个 ITS片段上较相近 ,在 ITS1片段上与蒺藜相差很大 ,与白
刺却相近 ;白刺与蒺藜在 ITS2片段的序列只有一个碱基的差异 ,但在 ITS1片段上则相差较大 .这可
能反映了它们对干旱环境适应的共性和特性及不同的进化过程 .这 4个属在 I TS1、 ITS2和整个 ITS
片段的亲缘关系有所差别 ,我们从综合角度考虑 ,支持成立四合木亚科 .又如在 GenBank中 ,已将白
刺提升为白刺科 ,并将骆驼蓬属 ( Peganum )归入白刺科 .然而 ,目前未见 GenBank中有关这些属的
ITS序列报道 .因此 ,要根据分子证据分类蒺藜科 ,仍需做深入研究 .
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(责任编委　王迎春 )
A Comparison of IT S Sequences of Nuclear Ribosomal DN A
between Endemic Species Tetraena mongolica Maxim in ORDS Platean
and Th ree Species of Zygophyllaceae in the Same Habitat
ZHANG Ying-juan, YAN G Chi, CHEN Wen-lian
(Department of Ecology and Env ironmental Science, NeiMongol University , Hohhot 010021, PRC )
　　 Abstract: The phylog enetic relationships betw een T . mongolica and other th ree species of
Zygophyllaceae w ere ana lyzed based on thei r nucleotide sequences of the internal t ranscribed spacer
( I TS) o f the 18- 26s nuclea r ribo soma l DN A. The sequences w ere obtained by PCR technique. The
resul ts show ed that there w ere dif ferences in the leng th of sequences, contents of G+ C and numbers
o f va riable si te among the four species. The leng th of I TS1 sequences ranged from 177 to 212 bp
and IT S2 from 218 to 237 bp, Th e f ragments of ITS2 w ere longer than tha t of ITS1. The contents of
G+ C ranged from 57. 7% to 62% . Phylog enetic analy sis indica ted show ed that T . mongolica was
close to Z. Xanthoxy lum in systematic posi tion. Nitraria sibirica and Tribulus terrestris almost same
in the f ragments of ITS2, but di fferent in IT S1. Th e resul ts w ere simi lar to the achiev ements in the
resea rch o f morpho logy and anatomy. It reflected thei r univ ersality and peculia ri ty o f ev olutionary
process to fi t the env ironment.
Key words: nrDN A ITS; Tetraena mongol ica; Zygophyllum xanthoxylum; N itraria sibirica;
Tribulus terrestris; systema tic po sition
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