全 文 ：2014 年 9 月
第 28 卷 第 3 期
阴 山 学 刊
YINSHAN ACADEMIC JOUＲNAL
Sep． 2014
Vo1． 28 No． 3
五种松科植物提取物抑菌效果的比较分析*
武 月 红1，解 玉 梅2
(1．包头师范学院 生物科学与技术学院，内蒙古 包头 014030;
2．总装备部装备指挥技术学院士官学校 门诊部，北京 102249)
摘 要:本实验采用滤纸片扩散法测定了五种松科植物的乙醇提取物对三种细菌性病害大肠杆菌 (
Escherichia coli) 、金黄色葡萄球菌( Staphylococcus aureus) 、枯草芽孢杆菌( Bacillus subtilis) 和三种真菌病害青
霉菌( Penicillium ) 、葡萄灰霉菌( Botrytis cinerea) 和黄曲霉( Aspergillus flavus) 进行了抑菌效果的对比和分
析。用液体悬浮培养法分别测定了五种松科植物的乙醇提取物对三种细菌的最小抑菌浓度( MIC) 。实验结
果表明:五种松科植物的乙醇提取物对供试细菌均表现出有较强的抑菌作用，其中油松提取物的抑菌作用最
强、樟子松次之，其他三种松科植物提取物的抑菌作用较弱;对三种供试真菌的抑菌效果油松和樟子松表现一
定的抑菌效果，其它几种植物抑菌作用不明显。不同部位的乙醇提取物对不同细菌的最小抑菌浓度( MIC) 则
表现较大差异。
关键词:植物提取物;抑菌作用;最小抑菌浓度
中图分类号:O949． 66 + 5 文献标识码:A 文章编号:1004 － 1869(2014)03 － 0046 － 06
近几年来，国内外许多学者调查和研究了一些
植物提取物的抗菌、杀菌活性。张应烙等［1］通过井
冈山 47 种植物丙酮提取物对几种病原菌的抑菌生
物活性测定，发现山鸡椒、凹叶厚朴和深山含笑提取
物中含有农用抗菌成分，且抑菌谱较广，作为植物源
杀菌剂值得进一步研究。西北农林科技大学无公害
农药研究服务中心对西北地区 200 余种植物的杀菌
活性进行了初步筛选，综合分析认为，菊科和豆科植
物在植物源杀菌剂的研究中值得重视［2］。喻大昭
等以黄瓜灰霉病菌为供试菌，对 49 种植物粗提物进
行了生物活性筛选，结果表明，油茶和辣蓼粗提物的
抑菌活性较高，有必要进一步对其不同组分进行分
离、纯化、活性追踪，最终确定其主要活性组分［3］。
陈娇等通过 58 种植物提取液对葡萄霜霉病菌的游
动孢子囊萌发抑制率和接种叶圆盘的发病控制研
究，筛选出虎耳草，黄檀，马尾松，牡丹，刺槐 5 种具
有抑菌作用的植物提取液［4］。孙海峰等以龙胆斑
枯病菌为供试菌种，对 9 种中药乙醇提取物进行抗
龙胆斑枯菌活性试验，结果发现 9 种中药乙醇提取
物均有抑菌作用，其中蛇床子 、川楝子、知母 14d 最
低抑菌质量浓度小于 0． 1g /ml，具有较强的抗龙胆
斑枯病菌作用［5］。此外，伞形科、卫矛科、葫芦科、
桑科等植物的抗菌、杀菌活性均有过报道［6］。
为本实验选取的五种松科植物属于北方地区常
见的园林绿化树种，具有来源广泛、取材方便的优
势。通过其乙醇提取物对几种常见的引起植物细菌
和真菌病害的致病菌的抑菌效果探究，为筛选和开
发新型植物源杀菌剂提供思路;对提高松科植物的
经济价值，扩大其使用范围具有重要意义。
1 实验材料与设备
1． 1 供试植物
油松(Pinus tabulaeformis )、樟子松(Pinus syl-
vestris L． var． mongholica Litv)、白皮松(Pinus bun-
geana Zucc． ex Endl)、青杄(Picea wilsonii Mast)、白
64
* 收稿日期:2014 － 05 － 18
作者简介:武月红( 1975 － ) ，女，内蒙古呼和浩特人，硕士，副教授，研究方向为植物学、微生物学。
DOI:10.13388/j.cnki.ysajs.2014.03.011
杄(Picea meyeri Ｒehd． et Wils)(以上植物均采自内
蒙古包头市阿尔丁植物园)
1． 2 供试菌种
三种细菌性病害大肠杆菌(Escherichia coli)、
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢
杆菌(Bacillus subtilis)和三种真菌病害青霉菌(
Penicillium )、葡萄灰霉菌(Botrytis cinerea)和黄曲
霉(Aspergillus flavus)(包头师范学院微生物实验室
提供)
1． 3 化学试剂
牛 肉 膏、蛋 白 胨、NaCl、琼 脂 粉、NaNO3、
K2HPO4、KCl 、MgSO4 ． 7H2O 、FeSO4、蔗糖、乙醇、甘
油、蒸馏水、无菌水、双蒸水
1． 4 主要实验设备
高压蒸汽灭菌锅、索氏提取器、旋转蒸发仪、超
净工作台、恒温培养箱、恒温水浴锅、电子分析天平、
冰箱、显微镜、微波炉、打孔器、过滤器(含无菌滤
膜)、剪刀、移液枪、Peteroff － hauser 记菌器、血球计
数板、涂布器、接种环、镊子、试管、离心管(1． 5ml)、
滤纸、剪刀、封口膜、玻璃棒、三角瓶、烧杯、培养皿 、
酒精灯等。
2 实验方法
2． 1 菌种的活化
在超净工作台上分次以无菌操作将供试细菌从
试管斜面以划线法转接到牛肉膏蛋白胨管斜面固体
培养基、将供试真菌转接到察氏培养基试管斜面和
培养皿平板，每种细菌各接 5 管左右备用，每种真菌
分别接 5 管斜面和 5 个平板，操作中注意严格无菌
操作，同时要试做好相应的记号避免菌种混乱。细
菌转接好以后放入 37℃恒温培养箱培养 24 － 48 小
时使菌体达到最壮生长状态冰箱冷藏备用、真菌转
接好以后放入 28℃恒温培养箱，试管种待菌丝体成
熟长出孢子为宜，平板种待菌丝体铺满平板即可使
用，不用时冰箱冷藏。
2． 2 样品提取液的制备
在植物园内分别采取新鲜完好的油松(Pinus
tabulaeformis )、樟子松(Pinus sylvestris L． var． mon-
gholica Litv)、白皮松( Pinus bungeana Zucc． ex
Endl)、青杄(Picea wilsonii Mast)、白杄(Picea mey-
eri Ｒehd． et Wils)的叶片，参考晏卫红等方法［3］，无
菌操作，75%酒精消毒 60s ，0． 005%高锰酸钾溶液
消毒 30s，再用无菌水冲洗 3 次，自然烘干，得到样
品材料。
2． 2． 1 油松提取液的制备
将准备好的油松叶片用无菌剪刀剪碎，并准确
称取 100g，用无菌滤纸将其裹好并放入索氏抽提管
内，用 95%的乙醇回流抽提 2 小时。如此反复共提
取 500g整株植物，将 5 次提取液收集合并，放入旋
转蒸发仪，将提取液旋转蒸发蒸干，称干物质 5g 用
5ml无菌蒸馏水完全溶解即为 1g /ml 的样品提取
液，将原液通过无菌滤膜过滤以除去杂菌。实验时
还需要用无菌蒸馏水取一定量原液配成 0． 9g /ml、
0． 8g /ml、0． 7g /ml、0． 6g /ml、0． 5g /ml、0． 4g /ml、0．
3g /ml的稀释液，加原液一共 8 个浓度梯度，放无菌
离心管标识清楚，冰箱冷藏备用。
2． 2． 2 其它部位植物提取液的制备
将准备好的樟子松、白皮松、青杄、白杄，同上述
油松的提取液的制备方法一样，分别制备好整株植
物提取 1g /ml的原液，通过无菌滤膜过滤以除去杂
菌，实验时用无菌蒸馏水配成 0． 9g /ml、0． 8g /ml、0．
7g /ml、0． 6g /ml、0． 5g /ml、0． 4g /ml、0． 3g /ml 的稀释
液，放无菌离心管标识清楚，冰箱冷藏备用。
2． 3 抑菌活性的测定
2． 3． 1 细菌和真菌菌悬液的制备
细菌菌悬液的制备:分别选取经过 24 － 48 小时
培养后菌体生长状态最为旺盛的大肠杆菌、金黄色
葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各 1 － 2 管，在超净工作台
上无菌操作，注意做好标记。
以大肠杆菌为例:先往大肠杆菌试管斜面中倒
入 2ml左右无菌水，用灼烧灭菌的接种环轻轻刮动
斜面的菌种，反复震荡，直接得到较浓的菌悬液，在
显微镜下以 Peteroff － hauser 记菌器计数菌体个数，
经过稀释，调至浓度为含细菌菌体 106—108 个 /ml
的大肠杆菌菌悬液，冰箱冷藏备用。
金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌悬液制备方法
相同。
真菌菌悬液的制备方法基本相同，计数用血球
计数板在显微镜下数孢子数约为 108 个 /ml即可。
2． 3． 2 滤纸片的浸泡
用打孔器取直径 7mm的滤纸片，灭菌后将滤纸
片分别放入五种松科植物提取物的各个稀释梯度提
取液及对照无菌水中浸泡 2h，待用。
2． 3． 3 对比相同浓度下五种松科植物提取物对三
种供试细菌的抑菌活性
在超净工作台中严格按照无菌操作要求，把提
前配制好的牛肉膏蛋白胨固体培养基融化后倒入直
径为 90mm的平皿，冷却凝固后用移液枪分别吸取
74
三种供试细菌的菌悬液 0． 2ml，分散滴到平皿上，以
灭菌的涂布器涂布均匀，使菌悬液渗入到培养基中。
用无菌镊子分别夹取相同浓度下浸泡五种松科植物
提取液并基本沥干的滤纸片(无菌水浸泡的滤纸片
为空白对照)等距放在同一个平皿内，对比相同浓
度下五种松科植物提取物对三种供试细菌的抑菌活
性。共做八个浓度梯度，每个梯度做三组重复。置
恒温培养箱中 37℃下培养 24h 后，测量抑菌圈直径
大小，取其平均值作为实验结果。并将实验结果记
录。
2． 3． 4 对比相同浓度下五种松科植物提取物对三
种供试真菌的抑菌活性
方法基本同上，只是用无菌镊子分别夹取相同
浓度下浸泡五种松科植物提取液并基本沥干的滤纸
片(无菌水浸泡的滤纸片为空白对照)等距放入已
经培养好并且活化成功的真菌平板上(菌丝体密布
平板)，对比相同浓度下五种松科植物提取物对三
种供试真菌的抑菌活性。共做八个浓度梯度，每个
梯度做三组重复。置恒温培养箱中 28℃下培养 48h
后，测量抑菌圈直径大小，取其平均值作为实验结
果。并将实验结果记录。
2． 4 最小抑制浓度(MIC)的测定
用液体悬浮培养法测定五种松科植物提取物的
对三种供试细菌的最小抑菌浓度(MIC)，具体操作
过程如下:
取灭菌试管 8 管，用记号笔标注好，分别用移液
枪加入过滤除菌的五种松科植物提取物(浓度为
1g /ml)6． 5ml、6． 0ml、5． 5ml、5． 0ml、4． 5ml、4． 0ml、3．
5ml、3． 0ml，然后分别加入灭菌并冷却至 40℃以下
的液体牛肉膏蛋白胨培养基定容至 10ml。分别接
入不同供试细菌悬液 0． 2ml，混匀。以无菌蒸馏水
做空白对照，37 ℃下震荡培养，每隔 2 小时观察一
次，视培养液变浑浊为长出细菌，而培养液澄清为无
细菌长出。以供试菌能抑制生长的最低添加量为该
提取物的最低抑菌浓度(MIC)，分别将结果记录于
表 1 中。
3 结果与分析
3． 1 相同浓度下五种松科植物乙醇提取物
对三种供试细菌的抑菌活性比较
图 1:五种松科植物乙醇提取物对大肠杆菌菌的抑菌效果比较
图 2:五种松科植物乙醇提取物对金黄色葡萄球菌菌的抑菌效果比较
84
图 3:五种松科植物乙醇提取物对枯草芽孢杆菌的抑菌效果比较
图 4:五种松科植物乙醇提取物对青霉菌的抑菌效果比较
图 5:五种松科植物乙醇提取物对葡萄灰霉菌的抑菌效果比较
图 6:五种松科植物乙醇提取物对黄曲霉的抑菌效果比较
通过以上 6幅图可以看出，五种松科植物乙醇提
取物对三种被测试细菌和三种被测试真菌在一定浓度
下都表现出了抑菌作用，且在相同浓度下对细菌的抑
菌作用强于真菌。就三种供试细菌而言，在相同浓度
94
下，不同种植物提取物对供试细菌的抑菌作用表现为:
油松提取物 ＞樟子松提取物 ＞白皮松提取物 ＞青杄提
取物 ＞白杄提取物;对供试真菌的抑菌作用表现最强
的也分别是油松、樟子松、白皮松。
3． 3 最小抑菌浓度的测定结果
表 1:五种松科植物提取物对三种供试细菌最小抑菌浓度比较
物 供试细菌
不同浓度下(g /ml)各提取物的混浊度比较
0． 30 0． 35 0． 40 0． 45 0． 50 0． 55 0． 60 0． 65
油松
樟子松
白皮松
青杄
白杄
大肠
杆菌
+ + + + + + + — — — —
+ + + + + + + + + — — —
+ + + + + + + + + + + — —
+ + + + + + + + + + + — —
+ + + + + + + + + — —
油松
樟子松
白皮松
青杄
白杄
金黄色
葡萄
球菌
+ + + + + + + + + — — —
+ + + + + + + + + + + — —
+ + + + + + + + + + + + + —
+ + + + + + + + + + + + + —
+ + + + + + + + + + + + + —
油松
樟子松
白皮松
青杄
白杄
枯草
芽孢
杆菌
+ + + + + + + — — — —
+ + + + + + + + + — — —
+ + + + + + + + + + + — —
+ + + + + + + + + + + — —
+ + + + + + + + + + + — —
注:“ +”多表示菌生长多，“ －”表示无菌生长。
通过表 1 可以看出，五种松科植物乙醇提取物
对供试细菌的最小抑菌浓度差异较为明显，油松的
抑菌效果最好，对三种供试细菌的最小抑菌浓度均
为 0． 5g /ml，即当提取液浓度大于 0． 5g /ml 时，表现
较强的抑菌作用。樟子松的提取物对三种供试细菌
的最小抑菌浓度为 0． 55g /ml － 0． 60g /ml，抑菌效果
居中;其他三种松科植物的最小抑菌浓度均高于 0．
60g /ml以上才能表现抑菌作用，对三种供试细菌的
抑菌作用都需要在较高浓度时才有所体现。
4 结论与讨论
通过五种松科植物乙醇提取物对三种供试细菌
和三种供试真菌进行抑菌实验结果表明:北方地区
常见的松科植物中，油松和樟子松叶片提取物具有
较强的抑菌作用，对三种供试细菌在较低浓度时就
表现出一定的抑菌作用，而其它三种松科植物对三
种供试细菌虽然表现出一定的抑菌作用，但是抑菌
作用需要在浓度较高时体现。
实验仅采用了乙醇做提取溶剂，因而不一定能
将极性和非极性较强的生物活性物质全部提取出
来。由于时间和条件限制并未做多种极性不同溶剂
之间的平行提取，今后如进一步研究应尽量采用各
种极性不同的溶剂做平行提取。
植物的活性成分与植物的生长情况和分布情况
有很大的关系，这会导致植物提取物的质量也会有
差别。本实验是用植物粗提物进行测试，但有些植
物样品中活性成分甚微，因而在供试浓度下未表现
较强的活性。另外，对于杀菌剂而言，有的在离体条
件下没有活性，但在活体植物上则表现出极强的抑
菌活性，实验仅初步进行了离体实验。这些在今后
的研究中应引起注意。
如何对北方地区广泛种植的其它松科或者其它
常绿植物进行药用提取物方面的进一步开发利用是
我们要进一步开展的课题。
〔参考文献〕
［1］何衍彪，詹儒林，赵艳龙．植物源农药的研究与应用［J］．
热带农业科学，2004，24(3):48 － 56．
［2］李园园，郝双红，万大伟，厉建燕，孙伟光，孟昭礼． 侧柏
乙醇提取物对 21 种植物病原真菌的抑菌活性．［J］西北
植物学报，2008，(5) :70 － 78．
［3］刘菲，蔡小宁，杨平，马军，贲爱玲． 32 种植物提取物对常
见植物病原真菌的抑制作用的研究［J］．安徽农业科学，
05
2009，(12) :116 － 121．
［4］包丽华，王林，张国盛，郭秀艳． 水蒸气蒸馏法提取臭柏
细枝叶精油的研究［J］．安徽农业科学，2009，(9) :125 －
131．
［5］沈萍，范秀容，李广武．微生物学实验［M］．北京:高等教
育出版社，2001，49 － 74．
［6］白洁，王艳梅，赵强．天山花楸全株抑菌作用的比较［J］．
食品科学，2007，28(9):125 － 127．
［7］Koenraadt，H．，Somerville，S． C．，Jones，A． L． Characteriza-
tion of mutations in the beta － tubulin gene of benomyl － re-
sistant field strains of Venturia inaequalis and other plant
pathogenic fungi［J］． phytopathology，1992，82(11) :1348 －
1354．
［8］耿剑锋，黑田克利，田中一久．洋葱油和大蒜提取物对灰
霉菌的作用效果［J］．中国蔬菜，2008，(5) :20 － 22．
［9］孟祥东，傅俊范，严雪瑞． 灰霉病菌生物防治研究进展
［J］．沈阳农业大学学报，2003，34(6):472 － 475．
［10］张佳，王莹，张峰等． 滤纸片法测定黄花蒿提取物对霉
菌的抑制活性［J］．湖北农业科学，48(5):1153 － 1154．
［11］Kawchuk，L． M．，Hutchison，L． J．，Verhaeghe，C． A．，
et al． Isolation of the β － tubulin gene and characterization
of thiabendazole resistance in Gibberella． pulicaris［J］．
Can． J． Plant Pathol，2002，24:233 － 238．
［12］王兴全，等． 苍耳提取物对番茄灰霉病菌抑制机理的研
究［J］．甘肃农业大学学报，2008，43 (6):107 － 110．
［13］Edlind，T． D．，Henry，K． W．，Metera，K． A．，et al． As-
pergillus fumigatus CYP51 sequence:potential basis for flu-
conazole resistance［J］． Med Mycol，2001，39:299 － 302．
［14］Sierrotzki，H．，Parisi，S．，Steinfeld，U．，et al． Mode of
resistance to respiration inhibitors at the cytochrome bc1
enzyme complex of Mycosphaerella fijiensis field isolates
［J］． Pest Management Sci，2000，56:833 － 841．
［15］李宏，姜怀春． 贯叶连翘总提取物对致病细菌的抗菌作
用［J］．广西植物，2007，27 (3):466 － 468．
［16］Takayuki，M．，Kaori，K．，Tomohiro，O．，et al． A two －
component histidine kinase of the rice blast fungus is in-
volved in osmotic stress response and fungicide action［J］．
Fungal Genetics and Biology，2005，42:200 － 212．
［17］卢婷，朴香淑． 连翘提取物抗氧化活性的研究进展［J］．
中国畜牧杂志，2009，45(15):57 － 60．
［18］程晓丽，肖晴，刘明星，颜学滔，杨务彬． 连翘乙醇提取
物对小鼠抵御伤寒沙门菌感染能力的研究［J］．中国药
师，2009，12(4):435 － 438．
［19］尹乐乐，曾耀英，侯会娜． 连翘提取物对脓毒血症小鼠
及体内 T淋巴细胞影响［J］．现代免疫学 2009，29(5):
392 － 396．
［20］胡文静，钱晓萍，涂云霞，沈泽天，禹立霞，刘宝瑞． 连翘
乙醇提取物抗肿瘤作用的实验研究［J］．南京中医药大
学学报，2007，23 (6):379 － 382．
Comparative Study on Antibacterial Effects
about Plant Extracts of Five Species Pinaceae Plants
WU Yue － hong1，XIE Yu － mei2
(Faculty of Biological Sciences and Technology ，Baotou Teachers College;Baotou 014030;
China Equipment Istitute Changping People＇s Liberation Army officer School;Beijing 102205)
Abstract:In this experiment Filter paper dispersion method was used to determine antibacterial effects about
the ethanol extracts of five species Pinaceae plants． The minimum inhibitory concentrations(MIC)of five species
Pinaceae plants were determined by the Liquid suspension culture method． The results show that the ethanol extracts
of five species Pinaceae plants have certain bacteriostatic activity on the tested bacteria ． Testing of bacteriostasis
shows that strongest bacteriostasis is the extracts of Pinus tabulaeformis．
Key words:Plant extracts;bacteriostasis;Minimum inhibitory concentration (MIC)
15