全 文 ：一种高效提取虎耳草科植物基因组 DNA的方法
张得钧1 ,2 , 高庆波1 ,2 , 段义忠1 ,2 , 张发起1 , 2 , 陈世龙1＊
　(1.中国科学院高原生物适应与进化重点实验室　中国科学院西北高原生物研究所 ,青海西宁 810001;2.中国科学院研究生院 ,北京 100039)
摘要　[目的]探索从虎耳草科植物中提取DNA的有效方法。[方法]采用改进的CTAB 法 ,从 11种虎耳草科植物中提取DNA。以提取的
DNA为模板 ,利用通用引物“ psbAF”和“ trnHR”对虎耳草科植物叶绿体 DNA psbA- trnH片段进行 PCR扩增。[结果] 通过该方法提取的
DNA纯度较高 ,质量较好。用所得DNA进行 psbA-trnH扩增的产量高 ,可用于后续的测序等分析。对山地虎耳草的 PCR产物纯化后进
行测序 ,得到 262 bp的序列。将其与GenBank中的虎耳草属其他植物的 psbA- trnH序列进行比对分析 ,证实该序列为目标 psbA-trnH片
段的区域。[结论]该方法可有效去除次生物质对DNA的干扰 , 提取的基因组 DNA 可用于叶绿体 psbA- trnH 测序分析和其他遗传学
分析。
关键词　虎耳草科;基因组 DNA提取;psbA- trnH
中图分类号　Q781　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2008)16-06673-02
An High-effective Method of Extracting Genomic DNA from Saxifragaceae Plants
ZHANGDe-jun et al　(Key Laboratory of Adaptation and Evolution of Plateau Biota , Northwest Institute of Plateau Biology , ChineseAcademy of Sci-
ences , Xining, Qinghai 810001)
Abstract　[ Objective] The research aimed to explore the effective method of extracting DNA from Saxifragaceae plants.[ Method] DNA was extracted
from 11 species of Saxifragaceae plants by using the modified CATB method.With the extracted DNA as template , the universal primers “ psbAF” and
“ trnHR” were used to make PCR amplification on psbA- trnH fragment in chloroplast DNA from Saxifragaceae plants.[ Result] DNA with higher purity
and better quality was obtained by this method.The yield of PCR amplification on psbA- trnH with the obtained DNA was high and it could be used in
analysis such as the subsequent sequencing.The PCRproducts of Saxifraga montanaH.Smith were purified and sequenced, and a sequence with the size
of 262 bp was obtained.It was compared with psbA- trnH sequence in other plants Saxifraga L.on GenBank website, which proved that this sequencewas
target region of psbA-trnH sequence.[ Conclusion] This method could wipe off the disturbance of secondary substances to DNA and the extracted genomic
DNA could be used in sequencing analysis of chloroplast psbA- trnH and other genetic analysis.
Key words　Saxifragaceae;Extraction of genomic DNA;psbA- trnH
基金项目　国家自然科学基金资助项目(30670130)。
作者简介　张得钧(1975-),男 ,青海乐都人 ,在读博士 ,助理研究员 ,
从事植物学研究。 ＊通讯作者。
收稿日期　2008-03-21
　　虎耳草科(Saxifragaceae)植物是双子叶植物 , 80属 ,约有
1 200种 ,广泛分布于全球 ,主产温带 。我国约有 28属 ,约 500
种 ,南北均产 ,主产西南 ,该科大部分植物均具有重要的利用
价值 ,被广泛应用于农业生产和人民生活中 。山梅花
(Philadelphus incanus)、虎耳草(Saxifraga stolonifera)、溲疏
(Deutzia scabra)、西南绣球(Hydrangea davidii)、岩白菜(Berge-
nia purpurascens)、八仙花(Hydrangea macrophylla)等植物可美
化环境 ,为常用园艺观赏植物 。虎耳草 、黑蕊虎耳草(S .
stolonifera)、岩白菜 、落新妇(Astile chinensis)、华金腰(Chrysos
pleniumsinicum)、七叶鬼灯檠(Rodgersiaaesculifolia)、尖叶茶
子(Ribesmaximowiczianum)等均具有药用价值 ,如黑蕊虎耳草
中岩白菜素没食子酸酯类对丙型肝炎丝氨酸蛋白酶有抑制
作用[ 1] ;尖叶茶 子提取物对蕃茄早疫病菌 、西瓜枯萎病
菌 、苹果炭疽病菌 、黄瓜腐霉病菌 、玉米小斑病菌 、小麦赤霉
病菌 、甘薯黑疤病菌均具有强烈的抑制作用 ,是一种潜在的
新型杀菌剂[ 2] ;七叶鬼灯檠 、羽叶鬼灯檠(R.pinnata)等的叶
和根均具鞣质 ,可提制烤胶。此外 ,虎耳草科岩白菜属的所
有植物均具有药用价值[ 3] 。
DNA分子标记试验和其他许多分子生物学试验一样 ,是
从研究生物个体的基因组 DNA开始的 ,能否得到高质量的
基因组DNA成为 DNA分子标记技术关键的一步 。目前有多
种DNA 提取方法:CTAB 法 、高盐低 pH 法 、SDS 法[ 4] 、苯酚
法[ 5]和试剂盒法[ 6]等;但对于植物体内含有大量影响高质量
DNA分离的酚类 、多糖等次生物质的虎耳草科植物来说 ,采
用常规的方法很难提取出高质量的DNA ,而试剂盒法成本相
对较高 ,因而需要改良常规的分离方法。目前 ,针对虎耳草科
植物DNA的提取方法研究十分缺乏。因此 ,笔者选取虎耳草
科具有药用价值的植物为研究材料 ,在 Doyle等提取 DNA方
法[ 7]的基础上对其进行适当改进 ,建立了一套经济高效的DNA
提取方法 ,并对获得的DNA进行了 psbA-trnH片段的扩增。
1　材料与方法
1.1　材料　供试材料为采集于青海 、西藏 、四川等地区的 11
种虎耳草科植物 ,植物名称 、采集地点见表 1。
1.2　主要提取试剂配方　BI 缓冲液:100mmol/L Tris-HCl pH
8.0 ,1.4 mol/L NaCl ,25 mmol/L EDTA 。3×CTAB 缓冲液:100
mmol/L Tris-HCl pH 8.0 ,1.5 mol/L NaCl ,25 mmol/L EDTA , 3%
CTAB 。5 mol/L NaCl;CI:氯仿/异戊醇(24∶1);异丙醇;β-巯基
乙醇;PVP;75%乙醇 。
1.3　DNA的提取　参照Doyle等的方法[ 7]并作适当改进 ,进
行基因组DNA的提取。提取步骤如下:在灭菌好的研钵中
加入 0.1 ～ 0.5 g硅胶干燥的叶片 ,再加少许液氮和 PVP干粉
后进行研磨 ,使其成粉末状;将粉状物转入 2.0 ml离心管后 ,
加入 1 ml 65 ℃预热的BI提取缓冲液 ,放入 65 ℃水浴恒温震
荡箱中 10 min左右;取出于 4 ℃10 000 r/min离心 10 min ,弃
上清液。加入 1 ml左右 65 ℃预热的 3×CTAB 提取缓冲液和
12μl β-巯基乙醇 ,放入 65 ℃水浴恒温震荡箱中 60 min左右 ,
每隔 10 min将离心管拿出后来回摇匀;取出加入等体积的
CI ,缓慢摇晃离心管 10 min ,使内含物充分混匀后形成乳浊
液 ,放入冷冻高速离心机中 4 ℃10 000 r/min离心 10 min使
其分层 ,然后将上清转入 1.5ml离心管;重复上一步 ,用等体
积的 CI再抽提 1次 ,并把抽提液转入另一离心管;在抽提后
的水相中加入 1/2体积的 5mol/L NaCl和 2/3体积-20 ℃保
存的异丙醇后 ,将离心管中的混合液轻轻摇匀 , -20 ℃静置
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2008, 36(16):6673-6674, 6728　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　李菲菲　责任校对　马君叶
DOI :10.13989/j.cnki.0517-6611.2008.16.047
3 ～ 4 h或过夜;4 ℃10 000 r/min离心 10 min后倒出上清液 ,
收集沉淀;用 75%的乙醇对沉淀进行清洗 ,10 000 r/min离心
6 min ,收集沉淀;重复上一步 2～ 3次 ,然后将沉淀放入 37 ℃
恒温箱或室温下进行风干;加入 100μl TE或三蒸水 ,加入适
量RNase至终浓度为 10μg/ml(37 ℃水浴 30 min左右);取出
于-20 ℃保存 ,备用。
表 1　材料来源
Table 1 Material source
材料编号及泳道号
Material No.
and lane No.
分类群
Taxa
采集地
Collection
site
　　　　1 羽叶鬼灯檠
Rodgersia pinnata
四川茂县
Mao County in Sichuan
2 三脉梅花草
Parnassia trinervis
西藏聂拉木
Nyalam in Tibet
3 岩白菜
Bergenia purpurascens
西藏林芝
Linzhi in Tibet
4 山地虎耳草
S.sinomontana 青海大武Dawu in Qinghai
5 蓖齿虎耳草
S.umbellulata var.pectinata 西藏昌都Changdu in Tibet
6 爪瓣虎耳草
S.unguiculata 青海大里加山Dalijia Mountain in Qinghai
7 小芽虎耳草
S.gemmigera var.gemmuligera 青海达日Dari in Qinghai
8 唐古特虎耳草
S.tangutica 青海大武Dawu in Qinghai
9 红虎耳草
S.sanguinea Franch. 青海久治Jiuzhi in Qinghai
10 小伞虎耳草
S.umbellulata 西藏加查Jiacha in Tibet
11 朗县虎耳草
S.nangxianensis 西藏错那Cuona in Tibet
1.4　DNA样品的鉴定
1.4.1　DNA样品检测 。琼脂糖电泳检测:取提取的DNA样
品 2μl ,加 2.0μl的溴酚蓝指示剂 ,琼脂糖凝胶浓度为1%(含
EB);在DYY-5型双稳电泳仪下 ,使用 100 V左右的恒定电压
电泳 30～ 40min;电泳缓冲液为 pH值 8.0的 1×TAE;于Bio-
RAD凝胶成像系统上观察并照相 ,以检测成功率。
1.4.2　植物叶绿体 DNA psbA-trnH 片段的PCR扩增。采用
通用引物 “psbAF”(5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC -3′)和
“trnHR”(5′-CGCGCATGGTGGATTCACAAATC -3′)扩增叶绿体
片段 psbA-trnH[ 8] ;扩增反应在 Biometra thermal cycler PCR扩
增仪上进行 。PCR反应总体积为 25 μl ,内含 2.5 μl的 10×
PCR缓冲液(含 1.5 mmol/LMgCl2), 0.3μl 10mmol/L dNTP ,正
反引物(5 pM)各 1.25 μl , 0.2 μl(1.25 U)Taq DNA 聚合酶 ,
18.5μl双蒸水和 1 μl(10～ 20 ng)的总 DNA模板。PCR扩增
的反应程序为:94 ℃预热 4 min ,接以 32个循环的 94 ℃加热
变性 50 s ,56 ℃低温退火 50 s ,72 ℃适温延伸 60 s ,最后 72℃
延伸 4 min结束。
进行PCR产物检测:对 PCR产物在 1%琼脂糖凝胶中电
泳 ,拍照 。
2　结果与分析
2.1　提取 DNA的纯度 、浓度　DNA在凝胶电泳上呈现清
晰 、整齐的条带 ,且电泳图谱拖带较少 ,DNA分子量较大(图
1),说明所提DNA纯度较高 ,质量较好。
图1　虎耳草科 11种植物 DNA凝胶电泳检测
Fig.1　Detection of DNA gel electrophoresis of 11 species of Saxifra-
gaceae
2.2　psbA-trnH片段的扩增　用改进的 CTAB 法提取的
DNA为模板 ,以通用引物“psbAF”和“ trnHR”进行 psbA-trnH
片段的扩增 ,扩增结果见图 2。图 2表明 ,改进的 CTAB法提
取的DNA质量较好 ,用所得DNA进行 psbA-trnH扩增的产量
高 ,能很好地用于后续的测序等分析。
图 2　虎耳草科植物11种植物 psbA-trnH扩增产物
Fig.2　psbA-trnH amplification products of 11 species of Saxifra-
gaceae
2.3　序列分析　对山地虎耳草的 PCR产物纯化后进行测
序 ,得到了长度为 262 bp的序列 。经与Genbank中调取的虎
耳草属的其他植物 psbA-trnH 序列比对分析 ,证实该序列为
目标 psbA-trnH片段的区域。
3　讨论
由于虎耳草科植物体内含有较多的酚类 、多糖等次生代
谢物 ,用常规的 CTAB 法不能获得较高质量的基因组 DNA 。
因此 ,笔者在Doyle等提取方法的基础上 ,对其进行了适当改
进。主要改进的地方有以下几个方面:一是将植物叶片加入
液氮研磨后 ,在 65 ℃水浴锅中先用 BI 缓冲液洗去大部分多
糖和其他次生物质。二是酚类物质是芳香族环上的氢原子
被羟基或功能衍生物取代后生成的化合物 ,广泛分布于植物
体内 ,是植物体内重要的次生物质之一。酚类物质经氧化后
易与 DNA共价结合引起褐变 ,使 DNA 失活[ 9] ,而 β-巯基乙
醇 、PVP为抗氧化剂 ,可有效防止酚类物质被氧化。鉴于此 ,
在提取过程中 ,加入了PVP粉 ,并将 β-巯基乙醇的用量由常
规的 8μl增加至 12μl。三是在提取介质中采用 3%CTAB 而
不是通常用的 2%CTAB 。提高 CTAB 的浓度 ,一方面可有效
地裂解细胞膜 ,使细胞内含物充分释放出来;另一方面 ,核酸
与CTAB 在不同的盐浓度下选择性地生成沉淀[ 10] 。同时用
高浓度NaCl和异丙醇进行沉淀处理 ,最终达到分离多糖和
核酸的目的 。四是应用 RNase降解RNA ,防止RNA对提取物
的污染。五是在用 75%酒精清洗沉淀时 ,最好事先对酒精进
(下转第 6728页)
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30 000kg/hm2 ,或腐熟的人粪尿 15 000 ～ 22 500 kg/hm2 、过磷
酸钙 225 kg/hm2 和硼砂 11.25 kg/hm2 做底肥。每公顷大田
(土)应准备 1 200～ 1 500 m2 苗床。苗床地整好后 ,在播前先
浇清粪水以保持土壤湿润 ,待土壤吸水后再松土平整播种。
3.1.2　种子处理。播种前进行种子精选 、晒种 、消毒;播时用
敌克松粉剂 1 g加水拌种 ,或用百菌清 、广枝灵拌种防虫害。
3.1.3　播种。一般在 9月 5日左右 ,播种时将种子拌入适量
细泥沙混匀 ,分 3 次撒播 ,达到稀播匀播 ,一般播种量为
4 500～ 5 250 g/hm2 。播后用秸秆覆盖苗床 ,当种子发芽子叶
伸出(未展开)时揭去覆盖物 ,并随时保持土壤湿润。
3.2　苗床管理
3.2.1　早匀苗 、早定苗 。苗多 、苗密的地方 ,在 2片真叶时进
行 1次疏苗;拔去病虫苗 ,保证苗齐 、苗壮。
3.2.2　追肥促苗。追肥按前促 、中稳 、后控的原则进行 ,且
在间苗 、定苗后追施 。如遇天旱 ,匀苗后可用稀释的清粪水
泼施 1次;2～ 3叶时 ,施清粪水15 000～ 22 500kg/hm2 ,或用尿
素 37.5 ～ 45.0 kg对清粪水 15 000～ 22 500 kg/hm2 泼施;3 ～ 4
叶时 ,看苗施肥 ,如秧苗叶片发黄 ,应及时追肥。而叶片嫩
绿 ,生长正常 ,则可适当少施或不施;移栽前 4～ 6天 ,用 30～
45 kg尿素对清粪水 15 000 ～ 22 500 kg/hm2 施 1次“送嫁肥” 。
3.2.3　控苗 、炼苗 。幼苗长到 2 ～ 3 片真叶时 ,苗床地用
1.5%的多效唑粉剂 750 g对水 750kg/hm2 喷施 1次控苗;炼
苗主要是防止苗床过湿而形成高脚苗 ,可采用深沟高厢 ,追
肥时适当少用水 ,雨水多时改用尿素 37.5～ 45.0kg/hm2 直接
撒施 ,也可用灰肥吸湿。
3.2.4　去杂除劣。4 ～ 5叶期 ,拔除叶色 、株型不一致的异
型苗。
3.2.5　病虫害防治。苗床地的虫害主要有菜青虫 、蚜虫 、跳
甲 、地老虎 、蟋蟀 、蝼蛄等 ,一般用 2.5%的敌百虫粉 、1.5%的
1605粉 、甲敌粉 、氧化乐果 、抗蚜威或杀灭菊脂等防治菜青
虫 、蚜虫 、跳甲等;用甲敌粉 、敌百虫等配成毒饵诱杀地老虎 、
蟋蟀 、蝼蛄等。毒饵配制:用甲敌粉 200 ～ 250 g拌油枯渣或
鲜菜碎叶 1.5～ 2.0 kg ,撒施于苗床;防蟋蟀可用 90%的晶体
敌百虫 50 g ,温水溶化后与 2kg麦麸和 0.5kg油枯混合 ,再滴
少量菜油炒香配制后撒于苗床上 。
3.3　大田移栽
3.3.1　整地。 ①及时晒田:稻田在水稻黄熟时及时开沟排
水 ,做到谷黄田燥 ,确保按时移栽 。②翻犁:要求细犁 20 ～ 25
cm深 ,同时开沟做厢 、碎土 ,厢宽根据土质的排水性能好坏
而定 ,一般不超过 7 m ,土质粘重 、排水性较差的土壤 ,厢宽不
超过 3 m。开沟方向应有利于整个繁殖区田块排水 ,每一块
地除厢沟外 ,都要开中沟 、边沟 ,达到沟沟相连 、块块相通。
3.3.2　基肥施用 。用总肥量的 50%～ 60%作基肥 。施有机
肥 15000 ～ 22 500kg/hm2 ,磷肥 375～ 420kg/hm2 ,氯化钾 135～
195 kg/hm2 ,硼肥约 11.5kg/hm2 ,混匀后施于沟 、穴中作基肥。
3.3.3　栽植。窝行距 30 cm×50 cm ,每窝 3～ 4株;行向应尽
量与常年风向垂直;在 5 叶 1心时移栽。为确保移栽质量 ,
起苗前 1天检查苗床湿度 ,如湿度不够应将苗床浇透 ,以保
证起苗时带土不伤根系。起苗时去除病 、虫 、杂苗 ,并按大小
苗分级移栽 ,边起苗边移栽。根栽直 ,苗栽稳 ,不栽吊根苗和
隔夜苗。栽完苗及时浇施定根肥水 ,注意不要冲翻秧苗 。
3.4　大田管理　
3.4.1　查苗补缺 。返青成活后应结合去杂 ,逐厢 、逐行进行
查窝补缺 ,及时补上缺苗和除掉病 、杂苗 。
3.4.2　中耕施肥。第 1次中耕施肥应在幼苗成活后浅中耕
时 ,用 45～ 75kg/hm2 尿素对清粪水灌施;第 2次施肥在开盘
期 ,应结合中耕重施 ,入冬前根据秧苗长势施尿素 90 ～ 105
kg/hm2 ,或复合肥225～ 300kg/hm2 ,施后中耕培土。如冬季气
温高 ,生长迅速 ,有徒长现象 ,可用 1.5%的多效唑粉剂 11 250
g对水 11 250 kg/hm2喷施 1次。
3.4.3　花期管理 。主要是去杂除劣 ,在初花期 、盛花期或终
花期各清理 1次田间异型株和杂株 ,并将清除的杂株全部运
出繁殖区外作饲料或沤肥 ,以保证种子纯度 。
3.4.4　检疫。一般在苗期 、青荚期请当地植物保护检疫部
门进行检疫。
3.4.5　病虫防治 。越冬前主要防治菜青虫 、蚜虫和跳甲;开
春后重点防蚜虫和菌核病。盛花前后 ,用 70%甲基托布津
1 000倍液 ,或 50%多菌灵 500倍液喷施 1～ 2次防治病虫害。
3.5　成熟收获　成熟后的种子应全部按照田块进行单收 、
单晒 、单藏 ,防止人为或机械混杂 ,严格杜绝非该品种的种子
混入 。收获的种子用近红外分析仪进行品质分析 ,同时进行
纯度检验 ,不合格种子全部作为杂种子处理 。将所有合格种
子进行精选加工 、均匀混合后 ,包装作为杂交油菜生产用种。
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(上接第 6674页)
行预冷 ,防止DNA的机械损伤 ,以提高DNA的得率 。
　　通过检验 ,说明该方法可有效地去除次生物质对 DNA
的干扰 ,提取的基因组 DNA 可用于叶绿体 psbA-trnH 测序
分析和其他的遗传学分析。
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