全 文 ：第 1 期
第 51卷第 1期
2012 年 1月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 51 No.1
Jan．，2012
收稿日期：2011－06－07
基金项目：国家自然科学基金（30800879）；浙江省重点创新团队资助项目（2009R50035）
作者简介：贾 庆（1985－），男，河北石家庄人，在读硕士，研究方向为林木遗传育种，（电话）18968150769（电子信箱）jiaqing2＠163．com；
通讯作者，卢泳全，副研究员，博士，主要从事植物分子生物学，（电子信箱）luyongquan＠126．com。
扩增共有序列遗传标记 （Amplified consensus
genetic marker，ACGM）是基于表达序列的保守性开
发的分子标记 ［1］，该标记的引物在表达序列的保守
区内 ， 引物本身就是表达序列的一部分 ， 因此
ACGM 引物的 PCR 扩增产物是表达基因序列的片
段。利用 ACGM标记不仅可以探明所研究物种之间
的多态性信息，而且可以获得大量目的基因的同源
片段。 本研究利用日本柳杉（Cryptomeria japonica）
MYB （Myeloblastosis）基因 ［2］、 CCCH－型锌指蛋白
（CCCH－type zinc finger protein）基因 ［3］、查尔酮合
成酶（Chalcone synthase）基因 ［4］和抗冻相关（cold－
regulated）基因 COR47 ［5］的 ACGM 引物，在 11 份杉
科材料中进行 PCR 扩增，对 PCR 产物测序和比对，
以探讨利用 ACGM 标记快速获得目的基因片段的
可行性。
1 材料与方法
1．1 引物序列及推测功能
4 对日本柳杉 ACGM引物序列及所在基因的功
能见表 1。
1．2 植物材料
杉科 7 个属的 11 份植物材料（表 2）于 2010 年
10 月采自杭州植物园裸子植物园区，用冰盒保存带
回实验室，采用 CTAB法提取植物叶片的 DNA［6］。
1．3 PCR扩增
PCR 反应体系为：DNA （25 ng ／μL） 2 μL，Taq
利用 ACGM标记发掘杉科功能基因
贾 庆，童再康，卢泳全
（浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地，浙江 临安 311300）
摘要：利用 4 对日本柳杉（Cryptomeria japonica）的扩增共有序列遗传标记（Amplified Consensus Genetic
Marker，ACGM）引物，在杉科 7 个属的 11 份材料中扩增出了 25 个 PCR 产物，测序、BLAST 比对和联配结
果表明，4 对引物的扩增产物分别与拟南芥和日本柳杉的 4 个基因（MYB 基因、CCCH－型锌指蛋白基因、
查尔酮合成酶基因、抗冻相关基因 COR47）具有较高的相似度性，推测这些 PCR 产物为这 4 个基因在杉
科物种中的同源基因片段。 研究结果表明 ACGM标记可被用于发掘其他物种的功能基因片段。
关键词：ACGM；杉科；功能基因；同源基因
中图分类号：Q949．66＋6 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2012）01－0177-05
Using ACGM Markers for Exploring Functional Gene Fragments in Taxodiaceae Species
JIA Qing，TONG Zai－kang，LU Yong－quan
（Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture， Zhejiang Agricultural and Forestry University，Lin＇an 311300，
Zhejiang，China）
Abstract： 4 amplified consensus genetic markers （ACGM） of Cryptomeria japonica were used to exploit novel functional gene
fragments． 25 PCR products were obtained from 11 species within Taxodiaceae family． The results of sequencing， BLAST and
alignment showed that the PCR products had high similarity with MYB gene， CCCH－type zinc finger protein gene， chalcone
synthesis gene and cold－regulated gene of Arabidopsis thaliana and C． japonica， respectively， thus were predicted as the ho-
mology gene of the corresponding gene． It was proved that ACGM could be used for exploring functional gene from different
species．
Key words： ACGM； Taxodiaceae； functional gene； homology gene
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2012.01.058
湖 北 农 业 科 学 2012 年
泳道 1－11 分别为 1－11 号材料的扩增产物，箭头所指的为回收
测序的条带片段
图 1 G1 在各材料中的 PCR 扩增产物
表 1 引物序列及相关基因功能
引物编号
G1
G2
G3
G4
正向引物（5′-3′）
GAAATGCGATGAAAGGGAAA
CTCAGATGTGTGGGCAAAGA
AAGGCACATTCTGAGCGAGT
GGACGCCAAGAGAAGAAAGA
反向引物（5′-3′）
TGTGATGCAGGTCCATTATGA
CGGATGAGTTCCGAATGTTT
TGTGGCAATTTATTGCATCATT
ACACACCACGCATACAATCC
所在基因
MYB 基因
CCCH-型锌指蛋白基因
查尔酮合成酶基因
抗冻相关基因 COR47
表 2 ACGM 在 11 份植物材料中的扩增结果
编号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
物种名称
落羽杉（Taxodium distichum）
池杉（T． ascendens）
北美红杉（Sequoia sempervirens）
海岸红杉（S． sempervirens）
柳杉（Cryptomeria japonica var． sinensis）
短茸柳杉（C． japonica cv． Araucarioides）
日本柳杉（C． japonica）
水杉（Metasequoia glyptostroboides）
杉木（Cunninghamia lanceolata）
台湾杉（Taiwania cryptomerioides）
水松（Glyptostrobus pensilis）
G1
259/75/94
254/75/94
－
－
265/75/95
263/75/95
262/75/95
255/75/83
247/73/88
－
259/75/87
G2
265/79/96
258/79/96
261/78/93
263/80/95
262/79/96
264/80/97
262/79/96
251/79/93
261/79/95
264/79/95
264/80/96
G3
－
－
－
－
250/69/57
255/69/57
255/69/58
－
－
－
－
G4
－
－
－
－
230/74/51
229/74/51
229/75/52
－
－
－
－
扩增结果（长度//bp/与拟南芥相应序列相似度//％/与日本柳杉相应序列相似度//％）
DNA polymerase（5 U ／μL， Takara） 0．2 μL，正反向
引物 （10 μmol ／μL） 各 1 μL，dNTPs （10 mmol ／ L，
Takara）1．6 μL，10×PCR Buffer 2 μL， 加 ddH2O 到
20 μL。 反应条件为：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性
30 s，55～58 ℃退火 30 s （根据引物调节退火温度），
72 ℃延伸 1 min，30 个循环；72 ℃延伸 5 min，4 ℃
保存。 取扩增产物 2 μL加 1 μL上样缓冲液，6％聚
丙烯酰胺凝胶电泳（80 V、3．5 h），参考许绍斌等［7］的
方法银染显色。
1．4 扩增产物的检测
上述 PCR产物聚丙烯酰胺凝胶显色后，切割目
的条带并参照李卫东等 ［8］的方法回收，取 2 μL 回收
产物做第二轮 PCR 扩增， 体系和条件与第一轮相
同。 取第二轮 PCR 产物 2 μL，于 1％琼脂糖凝胶电
泳，确定产物单一明亮后，由南京金斯瑞生物科技
有限公司测序。
2 结果与分析
4 对 ACGM 引物在 11 份杉科植物材料中的扩
增产物测序结果见表 2，将这些产物与拟南芥（Ara-
bidopsis thaliana） 以及日本柳杉相应基因的序列进
行 BLAST 同源性比对，并用 ClustalX 软件进行多序
列联配，用 GeneDoc 软件显示多序列联配的结果。
2．1 G1的 PCR产物分析
G1引物在 11份材料的 8份中获得了目标条带
（图 1）。测序结果表明，这些片段的长度为 247～265
bp， 与拟南芥 MYB 基因中的相应序列 （AMYB）
BLAST 比对的结果显示这些序列与 AMYB 的序列
相似度为 73％～75％， 推测这些 PCR 产物为 AMYB
在杉科物种中的同源基因片段。
应用 ClustalX 软件对实验获得的 8个测序结果
与已经公布的日本柳杉及拟南芥 MYB 基因相应序
列进行联配（图 2）。联配结果表明，实验所获序列与
日本柳杉 MYB 基因 （CMYB） 的相似度为 83％～
95％，说明扩增得到的序列为杉科各材料中的 MYB
基因片段。
2．2 G2的 PCR产物分析
G2引物在 11份材料中均有明显的扩增产物并
且均成功回收（图 3）。 测序结果表明这些片段长度
在 251～265 bp 之间。 与拟南芥 CCCH－型锌指蛋白
基因（ACCC－H）中的相应序列 BLAST 比对的结果
显示这些片段与 ACCC－H 序列相似度为 78％～
80％，推测这些 PCR产物为 ACCC－H 在杉科物种中
的同源基因片段。
应用 ClustalX 软件对实验获得的 11 个测序结
500 bp
250 bp
178
第 1 期
1、2、5、6、7、8、9、11 分别为 G1 引物在相应编号材料中的扩增产物序列；CMYB 为日本柳杉 MYB 基因的序列，AMYB 为拟南芥 MYB 基因
的序列
图 2 G1 扩增产物的多序列联配结果
果与已经公布的日本柳杉及拟南芥 CCCH－型锌指
蛋白基因序列进行联配（图 4）。联配结果表明，实验
所获序列与日本柳杉 CCCH－型锌指蛋白基因（CC-
CC－H）的相似度为 93％～97％。说明扩增得到的序列
为杉科各材料中的 CCCH－型锌指蛋白基因片段。
2．3 G3的 PCR产物分析
G3引物只在 11份材料中的 5、6、7 号 3 份材料
中有较为明显的扩增产物（图 5）。 测序结果表明 3
份材料扩增出的片段长度分别为柳杉 250 bp、短茸
柳杉 255 bp 和日本柳杉 255 bp。 BLAST 比对的结
果显示这 3 个序列与拟南芥查尔酮合成酶基因
（ACHS）的序列相似度均为 69％，推测这些 PCR 产
物为 ACHS在杉科物种中的同源片段。
应用 ClustalX 软件对实验获得的 3个测序结果
与已经公布的日本柳杉及拟南芥查尔酮合成酶基
因序列进行联配（图 6）。联配结果表明，实验所获序
列与日本柳杉查尔酮合成酶基因（CCHS）序列相似
度为 57％～58％，说明扩增得到的序列可能为 CCHS
的同源基因片段。
2．4 G4的 PCR产物分析
G4只在 11份材料中的 5、6、7 号 3 份材料中有
较为明显的扩增产物（图 7）。 测序结果表明 3 份材
料扩增出的片段长度分别为柳杉 230 bp、短茸柳杉
229 bp 和日本柳杉 229 bp。 BLAST比对的结果显示
这 3 个 片 段 与 拟 南 芥 抗 冻 相 关 基 因 COR47
（ACOR）中相应序列的相似度为 74％～75％，推测这
些 PCR 产物是 ACOR 在杉科物种中的同源基因片
段。
应用 ClustalX 软件对实验获得的 3个测序结果
泳道 1－11 分别为 1－11 号材料的扩增产物，箭头指的为回收测
序的条带片段
图 3 G2 引物在各材料中的扩增产物
500 bp
250 bp
贾 庆等：利用 ACGM 标记发掘杉科功能基因 179
湖 北 农 业 科 学 2012 年
5、6、7 分别为 G3 引物在 5、6、7 号材料中的扩增产物序列；CCHS 为日本柳杉查尔酮合成酶基因序列，ACHS 为拟南芥查尔酮合成酶基因序列
图 6 G3 扩增产物的多序列联配结果
1－11 分别为 G2 引物在 1－11 号材料中的扩增产物序列；CCCC－H 为日本柳杉 CCCH－型锌指蛋白基因的序列；ACCC－H 为拟南芥 CCCH－
型锌指蛋白基因序列
图 4 G2 扩增产物的多序列联配结果
与已经公布的日本柳杉及拟南芥相应抗冻相关基
因 COR47序列进行联配，结果如图 8所示。 联配结
果表明，实验所获序列与日本柳杉及拟南芥相应抗
冻相关基因 COR47（CCOR）的相似度为 51％～52％。
说明扩增得到的序列可能为 CCOR的同源基因。
3 讨论
利用 ACGM 标记克隆基因从原理上说属于同
源克隆，所以也依赖于同源序列。 随着各种生物尤
泳道 1－11 分别为 1－11 号材料的扩增产物，箭头所指的为回收
测序的条带片段
图 5 G3 引物在各材料中的扩增产物
500 bp
250 bp
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第 1 期
（责任编辑 向 闱）
5、6、7 分别为 G4 引物在 5、6、7 号材料中的扩增产物序列；CCOR 为日本柳杉 COR47 基因的序列； ACOR 为拟南芥 COR47 基因的序列
图 8 G4 扩增产物的多序列联配结果
其是模式生物的序列信息越来越多，这种克隆方法
的限制性也越来越小。而且由于 ACGM 标记利用的
是较为保守的编码区序列，所以在科属内的通用性
很高， 有些甚至可以在其他科属的植物中互用。
例如贺欣等 ［9］从卢泳全等 ［10］开发的 37 对禾本科
（Poaceae）ACGM 引物中筛选出了 18 对能在蝶形花
科（Papilionaceae）山蚂蝗属（Desmodium）植物中有
效扩增的 ACGM 引物。表明利用 ACGM 标记可以有
效地在不同物种中快速、 批量克隆功能基因片段，
在此基础上结合 RACE 等技术，可以快速获得目的
基因全长。
由于受生长周期的限制，很多木本植物的遗传
基础研究很薄弱，从而限制了分子生物学研究的进
一步开展，造成基因克隆等很多分子生物学技术不
能在木本植物中有效地应用 。 本研究所利用的
ACGM 标记是利用保守序列设计引物，它在作为标
记的同时， 也是一种通用性较高的同源序列引物。
因此该标记在对目标物种之间的多态性分析的同
时，还提供了这些物种的同源序列信息，为缺少生
物信息植物的基因克隆提供了一条捷径。
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泳道 1－11 分别为 1－11 号材料的扩增产物，箭头所指的为回收测序的条带片段
图 7 G4 引物在各材料中的扩增产物
500 bp
250 bp
贾 庆等：利用 ACGM 标记发掘杉科功能基因 181