全 文 ： 鉴别
伞形科常用中药品种 rDNA序列特征及其标记方法研究
赵国平 1 ,钱三旗 2 ,新关稔 3 ,石川隆二 3
(1.暨南大学医学院 ,广东广州 510632;2.暨南大学生命科学学院 ,广东广州 510632;3.日本弘前大学农
学生命科学部 ,青森 036-8561)
　　摘要　目的:探讨伞形科 27种常用中药指纹图谱鉴定的分子特征标记 , 探索筛选标记方法。方法:扩增伞形
科 27种植物的 rDNA序列 ,限制性内切酶消化 , 聚丙烯电泳 ,其中 6个品种测定 rDNA序列。结果:PCR获得的 rD-
NA序列片段包括 ITS1、 ITS2、5.8S全长序列以及 18S、26S部分序列。将 PCR产物经限制性内切酶 M SPⅠ消化后的
电泳图 , 27个品种出现了 16种特征性图谱 , 其中有 11个品种的图谱与其他品种不相同;经限制性内切酶 H aeⅢ消
化后出现 5种特征性图谱 , 其中有 3个品种的图谱不与其他品种相同。 6个品种经测序 , 获得了长度为 652 ～ 656
bp的基因序列。根据 rDNA序列构建的相似系统树 , 限制性内切酶消化电泳图相同的三组品种 , 序列相似度高。
结论:rDNA序列特征是伞形科中药鉴别的有效分子标记 , 序列测定法优于限制性内切酶切片长度多态性的分子标
记方法。
关键词　中药;rDNA;标记方法
中图分类号:R282.71　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2006)11-1148-06
基金项目:国家自然科学基金项目(批准号 30271618)
　　生物类药材物种的多样性是由基因的多态性决
定的。核基因组的 rRNA基因 (rDNA)及其间隔区
ITS序列 ,近几年常用于中药品种的鉴定以及被子
植物系统与进化研究 〔1, 2〕 ,被实践证明是研究药材
道地性 、药用植物生态多样性十分有用的基因片段 。
伞形科药用植物中有许多属于临床常用药 ,研究伞
形科常用中药的分子特征标记及其标记方法 ,对于
用分子生物学手段进行中药鉴定具有重要意义。本
课题采用 18 ～ 26S rDNA分子标记识别伞形科常用
药用植物品种 ,研究其在中药品种鉴定中的价值 。
1　材料与方法
1.1　材料来源　用于 DNA提取的材料为伞形科 7
属植物的新鲜或硅胶干燥的叶片 。来源见表 1。
1.2　总 DNA提取 　总 DNA的提取方法为改良的
　　表 1 　DNA提取材料来源
No Taxon
提供及鉴定人 No Taxon 提供及鉴定人
1 毛当归 Angelica pubescens(江苏南京) 刘启新
2 重齿当归 Angelica biserra ta(四川江油) 洪恂
3 骨缘当归 Angelica cartilag ina ta(吉林长春) 洪恂
4 拐芹 Angelica polymorpha(江苏南京) 刘启新
5 黑水当归 Angelica am urensis(江苏南京) 刘启新
6 杭白芷 Angelica dahurica sav. cv. hang-
baizh i(浙江杭州) 刘启新
7
兴安白芷 Angelica dahurica sav. va r. dahu-
rica(河南洛阳) 刘启新
8 白芷 Angelica dahurica(四川绵阳) 洪恂
9 川白芷 Angelica dahurica var. nepetoides(四川重庆) 洪恂
10 祈白芷 Angelica dahurica sav. cv.qiba izh i(河南洛阳) 洪恂
11 峨嵋当归 Angelica omeiensis(四川重庆) 洪恂
12 岷当归 Angelica sinensis(甘肃兰州) 洪恂
13 圆当归 Angelica archange lica(江苏南京) 刘启新
14 可食当归 Angelica edulis(日本新泻) 原田幸雄
15 北白芷 Angelica ursine(日本新泻) 原田幸雄
16 仙台当归(1)Angelica acutiloba subsp. iwa-
wensis(日本中津轻) 原田幸雄
17
仙台当归 (1)Angelica acutiloba subsp.
iwawensis(日本黑石) 原田幸雄
18 狭叶当归 Angelica anomala(日本黑石) 原田幸雄
19
管鞘当归 Angelica pseudoslinum (江苏南京) 刘启新
20 紫花前胡 Angelica decursiva(江苏南京) 刘启新
21
白花前胡 P eucedanum praeruptorum(江苏宜兴) 谈献和
22 山芹 O stericum siebold ii(江苏南京) 刘启新
23 大齿山芹 Ostericum grosseserra tum(江苏宜兴) 刘启新
24
マルバトオウキ Ligustium hulten ii(日本黑石市) 原田幸雄
25 羌活 Notopterygium incisum(四川成都) 刘启新
26 明党参 Changium sm yrn ioides(江苏宜兴 ) 谈献和
27 峨参 Anthriscus sy lvestris(江苏宜兴) 谈献和
28 欧当归 Levisticum officina le(江苏南京) 刘启新
1148 中药材第 29卷第 11期 2006年 11月
CTAB法 (Roge rs＆Bend ich.1988)。
1.3 　引物设计与选择 　 rDNA的扩增引物根据
Bungard＆N ichdson1996的论文设计〔3〕 , rRNA f和
rRNA r一对引物。 rRNA f连接 18S rRNA基因 3′端上
游 26 ～ 30个碱基处 ,其序列为 5′TGAAGTCGTAA-
CAAGGTTCCG 3′;rRNA r连接 26S rRNA基因 5′端下
游 30 ～ 33个碱基处 ,其序列为 TCGCTTATTGATT-
GATATGCTTAAACTCAG。
1.4 　 rDNA的扩增和纯化 　 rDNA采用 rRNA f+
rRNA r　进行整段扩增。扩增程序为:94℃, 3 m in;
94℃, 1 m in;55℃, 1 m in;72℃, 2 m in;30个循环 。
72℃, 5m in。 4℃保存。扩增反应在 PE公司的 9600
型 PCR仪上进行 ,反应体积均为 60μl,内含 1×Taq
缓冲液 (50 mmo l /L tris2HC l, pH8.3), 0.25g /L
BSA , 2mmo l /L M gC l2 , 1.5UTaqDNA聚合酶 , dATP、
dGTP、dCTP、 dTTP各 200 μmo l /L(美国 Promega公
司产品 ), 10 ～ 20 ng总 NDA ,引物 rRNA f、 rRNA r各
12.5 pmo ls。 PCR产物经W izard PCR Preps Purifica-
tion System(Promega)纯化后使用 。
1.5 　酶切与聚丙烯电泳　酶切反应体系 20 μl,其
中 10×NeB 2 μl, PCR扩增产物 100 ng,限制性内切
酶 MSP Ⅰ或 H aeⅢ 200μmo l /L, 加水至 20 μl。置
37℃恒温箱 3.5 h。
聚丙烯凝胶采用 30%Acry lam ide 6.65 m l, 10×
TBE 2.5m l, APS 0.25m l, TEMED 0.025m l, H2O
15.575m l,凝胶作成 4 h后使用。将酶切反应液 10
μl注入电泳槽中 , 100V电压电泳 2 h, EB染色 , UV
灯光下照相 。
1.6 　克隆与测序　选择重齿当归与可食当归 、杭
白芷与黑水当归 、骨缘当归与紫花前胡等三组经两
次酶切后电泳图谱仍然相同的药用植物 ,将上述品
种 PCR的 rDNA片段进行克隆后测序 ,以提高测序
的质量 。
克隆是将 rDNA的 PCR产物与载体基因 PB lue-
script Ⅱ SK(+/-)溶液相混合 ,在 DNA连接酶的作
用下 ,在 16℃恒温箱中水浴 12 h以上 ,与经前培养
的大肠杆菌相混合 ,在掺有氨苄青霉素的培养皿中
37℃培养 18 h以上 。采用 Q IA K it分离纯化 Plas-
m idDNA。
测序反应依据双脱氧终止法 (Sange r, et al.
1977)原理 ,在上述 PCR仪上进行。反应体系 10
μl,测序引物为 M13IRD800 forw ord和 Reve rs,反应
程序为 95℃预变性 5 m in, 95℃变性 30 s, 50℃退火
30 s, 70℃延伸 1m in。 30个循环后 4℃保存 。测序
采用手动测序 ,在 LIC-4000测序仪上进行。每个样
品正向 、反向测序各 2次 ,将四次所测结果进行认真
校对 。
2　结果与讨论
2.1　 rDNA序列片段限制性酶切片长度多态性特
征　经限制性内切酶 MSP Ⅰ和 H aeⅢ完全消化后 ,
聚丙烯电泳 , EB染色 , UV灯光下照相 ,形成了各自
的 DNA标记的特征图。 (见图 1、图 2)
由图 1可以看出 ,经 MSPⅠ消化后 , 27种植物
的 rDNA获得了 16种具有特征性的图谱 。其中重
齿当归 、黑水当归 、可食当归 、北白芷 、兴安白芷 、川
白芷 、祈白芷具有相同的图谱 ,骨缘当归与紫花前
图 1　伞形科常用中药 rDNA的 PCR产物
经 MSP Ⅰ消化后的聚丙烯电泳图谱
1149 中药材第 29卷第 11期 2006年 11月
图 2　伞形科常用中药 rDNA的 PCR产物
经 HaeⅢ消化后的聚丙烯电泳图谱
胡 、白花前胡具有相同图谱 ,杭白芷与白芷 、大齿山
芹与山芹 、拐芹与岷当归各具有相同图谱 ,管鞘当
归 、毛当归 、狭叶当归 、峨嵋当归 、圆当归 、ミヤマト
オウキ、マルバトオウキ、羌活 、欧当归 、明党参 、峨
参等 11种植物各自具有特征性图谱。由图 2可知 ,
经 HaeⅢ消化后 ,获得了 5种具有特征性的图谱 ,其
中重齿当归 、アマニユウ、エゾニユウ、峨参具有相
同图谱 ,岷当归 、羌活 、明党参各自具有特征性图谱 ,
其余品种的图谱相同 。
2.2 　部分品种的 rDNA序列和相似系统树　重齿
当归与可食当归 、杭白芷与黑水当归 、骨缘当归与紫
花前胡等 3对六种植物 rDNA的 PCR产物 ,从 MSP
Ⅰ和HaeⅢ两种内切酶消化后电泳图谱上 ,仍然不
能获得各自特征性的分子标记 。将上述 6种植物
rDNA序列进行克隆测序 ,获得了 652 ～ 656 bp的碱
基序列 ,排成一行总长度为 660 bp。 6种植物的 rD-
NA测序结果见表 2。运用 So ft DNASIS2.0排序并
建立相似系统树(见图 3)。
图 3　重齿当归等 6种植物相似系统树
2.3　从 rDNA碱基序列解析聚丙烯电泳图谱　限
制性内切酶 MSPⅠ识别并内切的特征序列为 C′
CGG , HaeⅢ识别的特征序列为 CG′CC。运用 DNA-
SIS2.0软件中的 Restriction Site功能找出经过测序
的 3对 6种植物 rDNA序列中 MSPⅠ 、HaeⅢ酶切的
位置 ,并据此计算酶切片段条数 、酶切片段长度(见
表 3)。
据表 3可以看出 ,以上 6种植物的 rDNA扩增
产物经 MSPⅠ消化后出现的片段条数 、酶切片段长
度与 聚丙烯电 泳结果 一致 , A.cartilaginata 与
A.decursiva都是 4条带 ,在 3条片段的长度上各有
1bp的差异;A.amurensis与 A.hangbaizhi都是 5条
带 ,在 2条片段长度上分别有 1bp、 2bp的差异;
A.biserrata与 A.edulis都是 4条带 ,在 2条片段的长
度上各有 1bp、5bp的差异。上述 6种植物的 rDNA
序列经 HaeⅢ消化后的片段条数 , DNASIS2.0分析
的条数与经聚丙烯电泳后我们肉眼所能看到的条数
不相等 。如 A. cartilag ina ta 、A.decursiva 、A .amuren-
　　表 2 　重齿当归等 6种植物 rDNA序列
10 20 30↓ ITS1 5′→ 40 50 60
A.cartilag ina ta TAG-TGAACC TGCGGAAGGA TCATTGTCGA ATCCTGCAAT AGCAGAATGA CCCGCTAACA
A.decursiva . . . . G. . . . . - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A.am urensis . . . . G. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A.hangba izhi . . . . G. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A.biserra ta . . . . G. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A.edulis . . . . -. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
70 80 90 100 110 120 130
CGTTAACAAT TTGGGCGAGC GTCGGGGGGC CTCGGTCTCC TGTCTTCGAA TCCCTGGTAG GTGGCCACTC
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1150 中药材第 29卷第 11期 2006年 11月
续表
140 150 160 170 180 190 200
CCGGGTGGTC ACTGGCCTGC AAAATCATTC GGGCGCGGAA TGCGC-AAGG ACCTTAAAAC TGAATTGTAC
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210 220 230 240← ITS1 3′ ↓5. 8S→ 260 270
GTCCGTATCC CGTTCGCGGG CACCGGCGTC ATTCCAAAAC ACAACGACTC TCGACAACGG ATATCTCGGC
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280 290 300 310 320 330 340
TCTCGCATCG ATGAAGAACG TAGCGAAATG CGATACTTGG TGTGAATTGC AGAATCCCGT GAACCATCGA
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350 360 370 380 390 400 ↓ ITS2 5′
GTCTTTGAAC GCAAGTTGCG CCCGAAGCCA CTAGGCTGAG GGCACGCCTG CCTGGGGTGT CACGCATCGT
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→420 430 440 450 460 470 480
ATTGCCT-GC AGACCACTCA CACCTGAGAA GTTGTGACGG TTTGGGGCGC AAATTGGCCT CCCGTACCTT
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490 500 510 520 530 540 550
GTCGTGCGGT TGGCGGAAAA ACGAGTCTCC GGCGACGGAT GTCGGACCAT CGGTGGTTGT GAAAGACCCT
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. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T. . T. . . . . . . . . . . T. . . . . . . . . . . CGA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T. . . . . . . . . . . . . . T. . . . . . . . . . . CGA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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1151 中药材第 29卷第 11期 2006年 11月
续表
560 570 580 590 600 610 620
CTTGTCTTGT CGCGCGAGTC CTCGTCATCT TAGCGAGCTC CAGGACCCAT AGGCAGCACA CACTCTGTGC
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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← ITS2 3′↓26S→ 640 650 660　　670
GCTTCGACTG TGACCCCAGG TCAGGCGGGA CTACCCG……
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　　表 3 　重齿当归等六种植物 rDNA经 MSPⅠ 、HaeⅢ内切后的片段长度多态性(据 So ft DNAS IS2. 0分析)
品种及 rDNA总长
MSPⅠ (C′CGG)
切点(bp. 5′-3′) 片段长度(bp) 片段数(条)
H aeⅢ (GG′CC)
切点(bp.5′-3′) 片段长度(bp) 片段数(条)
A.cartilag ina ta(653bp) 130, 221, 506 285. 147, 130, 91 4 87, 122, 143, 463 320, 190, 87, 35, 21 5
A.decursiva(654bp) 130, 222, 506 284, 148, 130, 92 4 87, 122, 143, 463 320, 191, 87, 35, 21 5
A.am urensis(652bp) 131, 223, 446, 508 223, 144, 131, 92, 62 5 88, 123, 144, 465 321, 187, 88, 35, 21 5
A.hangba izhi(653bp) 131, 223, 445, 507 222, 146, 131, 92, 62 5 88, 123, 144, 465 321, 188, 88, 35, 21 5
A.biserra ta(652bp) 131, 445, 507 314, 145, 131, 62 4 88, 123, 137, 144 508, 88, 35, 14, 7 5
A.edulis(656bp) 130, 444, 506 314, 150, 130, 62 4 87, 122, 136, 143 513, 88, 35, 14, 7 5
sis、A.hangbaizh均应出现 5条带 ,而聚丙烯电泳图
上只能看到 3条带;A.biserrata与 A.edulis均应出现
5条带 ,而在聚丙烯电泳图谱上只能看到 2条带 。
究其原因 ,主要是在聚丙烯电泳图上 ,因为 <35bp
的片段分子量太小 , EB染色 , UV照相难以显影之
故 ,并不能反映这些较短的基因片段不存在。
2.4 　测序与酶切电泳方法在药用植物品种鉴定中
的作用评估　直接测序法能够分析出目标基因序列
中 1bp及其以上的特征性差异 ,结果精确 。因此 ,直
接测序法不仅广泛应用于属以上高级分类阶元的分
子系统学研究〔4-7〕 ,也被用于属内种间 、种下群 、居群
间低级分类阶元的分子标记和分子系统学研究 〔1〕。
选择适当的基因片段进行测序分析 ,是药用植物分
子标记十分有效的方法。
限制性酶切片长度多态性分析 ,目前有限制性
片段长度多态性 (RFLP)、PCR扩增的特定片段的
限制性位点分析 (AFLP)、随机扩增多态性分析
(RAPD)等 ,也是利用比较物种间 DNA分子的遗传
多样性的差异来进行遗传标记鉴别 〔8〕 ,并且取得了
成功 。但 RFLP实验技术步骤繁琐;RAPD实验条件
苛刻 ,任何条件的改变都将影响实验结果 ,对实验结
果的主观判断也较强。本文选用 rDNA扩增产物 ,
采用 MSPⅠ和 HaeⅢ进行酶切 、聚丙烯电泳 ,实验结
果应是客观的 ,可重复的 。经过 2次酶切电泳 ,获得
了 21种电泳图谱 。但还是未能达到每一个品种获
得一个特征图谱的要求 。特别是骨缘当归 、紫花前
胡与白花前胡 ,川白芷与祁白芷 、兴安白芷 ,黑水当
归与杭白芷 ,重齿当归与可食当归等 ,最后不得不应
用测序方法找出各品种的序列特征。因此可以认
为 ,从中药品种 DNA分子标记的准确性 、彻底性而
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言 ,测序法应优于酶切电泳法。
参 考 文 献
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(2006 - 04 -10收稿)
M olecular Character isticM arkerM ethod of 27 Breeds of Common
Umbe lliferae Chinese H erbM edicinal P lants by Sequencing rDNA
ZHAO Guo-P ing1 , QIAN San-q i2 , M ino ru N iizek i3 , L iuni Ish igagawa3
(1.M edica l Co llege, Jinan University, Guangzhou 510632, China;2.Co lleg e o f Life Sc ience, Jinan University, Guangzhou 510632,
Ch ina;3.Facu lty o f Agricultural and L ife Sc ience, H irosak i Un ive rsity, H iro sak i 036-8561, Japan)
Abstrac t　Objective:To probe am o lecularm arke rme thod o f accrediting finge rprinting o f 27 k inds o f commonUm belliferae Chi-
nese he rb m ed icina l p lants by sequencing rDNA. Method:The rDNA sequences o f the 27 b reeds o f comm onUmbelliferae Ch inese he rb
m ed icina l p lants w ere am plified, and w ere d ige sted by re striction endonuc lease, and w ere seperated v ia po lypropy lene e lec trophoresis,
at la st 6 b reeds o f them we re sequenced. Results:The rDNA sequence fragment w e gained concluded ITS1, ITS2, 5.8S com plete se-
quence and 18S, 26S part sequence. On the e lec trophoresis m ap of PCR produc ts d ige sted by restric tion endonuc lease MSP Ⅰ , 27
breeds appeared 16 kinds o f characteristic m ap, 11 o f them differ from o thers;and PCR products d ige sted by restriction endonuc lease
H aelll, the re appeared 5 kinds o f cha racte risticm ap among 27 b reeds, 3 o f them differ from o thers. The sequenced resu lt of 6 breeds
showed genes w ho se leng th extented from 652bp to 656bp w ere acqu ired. These sequence s of 3 breeds which showed the sam e e lec tro-
pho resis m ap after dige sted by restric tion endonucleaseH ae lll exhib ited g reat sim ila rity acco rding to sim ilar phy logene tic tree construc-
ted on rDNA sequence. Conc lusion:The rDNA sequence cha rac te r is effec tivem o lecularm arker for classify ing the differen tUmbe llerae
Ch inese herb m ed icina l plants. And them e thod of sequenc ing rDNA su rpa ssed that of restriction fragm ent long po lymo rph ism (RFLP).
K ey words　Chine se he rb m ed icina l p lant;rDNA;M arkerm e thod
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