全 文 ：遗　传 HEREDITAS(Beijing)25(2):177 ～ 180 , 2003 　　 研究报告
杉科 、柏科的系统发生分析
———来自 28S rDNA序列分析的证据
李春香 ,杨　群
(中国科学院南京地质古生物研究所 ,江苏南京 210008)
摘　要:对杉科(Taxodiaceae)与柏科(Cupressaceae s.s.)的28S rRNA 基因的部分序列(约 630 bp)进行 PCR扩增 、序
列测定和系统发生关系分析 ,用简约法和邻接法构建的系统发生树基本一致。结果表明 , 杉科与柏科构成一个单
系群 ,支持将杉科 、柏科(Sciadopitys 除外)合并为一个科———广义柏科(Cupressaceae sensu lato)的观点。在广义柏
科中 , Taiwania 、Athrotax is分别形成一支系;Metasequoia 、Sequoia 、Sequoiadendron 关系较近 , 聚成一支系;Taxo-
dium 、Glyptostrobus、Cryptomeria 聚成一支系;柏科聚成一支系。这一分析结果与叶绿体基因序列的分析结果相吻
合 ,但是由于 28S rRNA基因的进化速率较慢 , 尚不能分辨上述各个支系之间的系统演化关系。
关键词:28S rDNA;杉科;柏科;系统发生;替代速率
中图分类号:Q949.66　　　文献标识码:A　　　 文章编号:0253-9772(2003)02-0177-04
Phylogenetic Relationships among the Genera of Taxodiaceae
and Cupressaceae from 28S rDNA Sequences
LI Chun-Xiang ,YANG Qun
(Nanjing Inst itute of Geology &Pa laeontology , Chinese Academy of S ciences , Nanjing 210008 , China)
Abstract:DNA sequences from 28S rDNA were used to assess relationships between and within traditional Taxodiaceae
and Cupressaceae s.s.The MP tree and NJ tree generally are similar to one ano ther.The results show that Taxodiaceae
and Cupressaceae s.s.form a monophyletic conifer lineage excluding Sciadopitys.In the Taxodiaceae-Cupressaceae s.s.
monophyletic group , the Taxodiaceae is paraphy letic.Taxodium , Glyptostrobus and Cryptomeria forming a clade(Taxo-
dioideae), in which Glyptostrobus and Taxodium are closely related and sister to Cryptomeria;Sequoia , Sequoiadendron
and Metasequoia are closely related to each other , forming another clade(Sequoioideae), in w hich Sequoia and Sequoia-
dendron are closely rela ted and sister to Metasequoia;the seven genera of Cupressaceae s.s.are found to be closely related
to fo rm a monophyletic lineage(Cupressoideae).These results are basically similar to analy ses from chloroplast gene data.
But the relationships among Taiwania , Sequoioideae , Taxodioideae , and Cupressoideae remain unclear because of the slow
evolution rate of 28S rDNA , w hich might best be answered by sequencing more rapidly evolving nuclear genes.
Key words:28S rDNA;Taxodiaceae and Cupressaceae s.s;phylogeny;substitution rate
　　传统分类中的杉科 、柏科(金松属 , Sciadopitys
除外)应合并为一个科 ———广义柏科(Cupressaceae
sensu lato)。这一观点不仅得到形态解剖学研
究[ 1 ～ 5] 的支持 ,分子系统学研究也提供了重要的证
据[ 6 ～ 11] ,然而 ,目前的分子系统学研究主要为叶绿
体基因序列的分析 ,而有关核基因序列的分析较少。
收稿日期:2002-04-02;修回日期:2002-07-18
基金项目:中国科学院“百人计划” 、国家杰出青年基金(49725204)资助
作者简介:李春香(1969-),女 ,山东人 ,博士 ,助研 ,主要从事植物分子系统学方面的研究。 Tel:025-3282286 , E-mail:lichunxiang@sina.com
DOI :10.16288/j.yczz.2003.02.014
S tefanovic et al.[ 9] 曾用 28S rRNA基因序列探讨了
整个松柏类植物的系统发生关系 ,但他们的分析仅
涉及了杉科 、柏科几个属 ,分类群数目也较少 ,没能
进一步阐明其内部各类群间的系统演化关系 。本研
究通过增加分类群的数目来进一步探讨它们之间 ,
以及其内部各属之间的系统关系。
1　材料 与方 法
1.1　实验材料
本文用于系统演化分析的分类群如表 1 ,其中 9
种植物的 28S rRNA 基因的部分序列是本研究测定
的 ,序列数据已输入美国生物信息中心(NCBI)的基
因库(GenBank)中 ,其他的序列取自 GenBank。
1.2　总 DNA提取
总 DNA 的提取采 用 CTAB (Cetylt rimeth-
ylammonium bromide)方法[ 12 ～ 13] 。
1.3　序列测定
1.3.1　引物设计
扩增 28S rRNA 基因片段所用引物 ,参照 Ste-
fanovic等[ 9] 的引物设计;引物的序列为:5′-AGC ,
ATA ,TCA ,CTA ,AGC ,GGA ,GG -3′和 5′-TTG ,
GTC ,CGT ,GT T , TCA , AGA , CG -3′,扩增的基因
片段为 630 bp(Taxodium distichum ,落羽杉中的长
度)。
表 1　用于系统发生分析的分类群及其序列资料
Table 1　Taxa and sequence data used in phylogenetic analysis
　　　　种　名 GenBank 号码 来源或参考文献
Ath rota xis cup ressoides＊ AY034040 Tasmania , Aust raliab
Ath rota xis laxi folia＊ AY034041 Tasmania , Aust raliab
Ath rota xis selaginoides＊ AY034042 Tasmania , Aust raliab
Ca locedrus decurrens U90707 Stefanovic et al.[9]
Chamaecyparis lawsoniana U90704 Stefanovic et al.[9]
Cryp tomeria japon ica U90703 Stefanovic et al.[9]
Cunninghamia lanceolata U90699 Stefanovic et al.[9]
Cupressus funebris＊ AY034047 Zhongshan Botanical Garden , Nanjing , Chinaa
Fokien ia hodginsii＊ AY034046 Zhongshan Botanical Garden , Nanjing , Chinaa
Glyptostrobus pensi li s＊ AY034043 Nanjing Forest ry Universi ty , Nanjing ,Chinaa
Juniperus communis U90705 Stefanovic et al.[9]
Metasequoia glyptostroboides＊ AY034044 Moudaoxi , Hubei , Chinab
Platycladus orien tal is＊ AF376132 Zhongshan Botanical Garden , Nanjing , Chinaa
S equoia sempervirens U90701 Stefanovic et al.[9]
S equoiadend ron giganteum ＊ AY034045 Yosemite National Park , Mariposa , USA b
Thuja orienta lis U90706 Stefanovic et al.[9]
Taxodium dist ichum U90702 Stefanovic et al.[9]
Taiwania cryptomeroides U90700 Stefanovic et al.[9]
S ciadopitys ver ticil lata U90698 Stefanovic et al.[9]
Ced rus deodara U90680 Stefanovic et al.[9]
　＊本项研究测定的序列 , a:样品采自大学校园或研究所的栽培树 ,b:样品采自自然居群。
　＊Sequence determined in this study , a:plant materials w ere sampled in the arbortum of the univerities and institutes ,b:from natural populations.
1.3.2　PCR扩增
扩增反应在 Perkin Elmer GeneAmp PCR Sys-
tem 9600 上进行 。反应体积为 50μL ,其成分为:
2μL DNA 模板(约 4ng , 由 Gel Doc 图像分析仪测
得),2.5mmol L M gCl2 ,0.1 mmol L dNTPs , 1×缓
冲液 , 0.1 μmol L 引物 , 1.25U Taq DNA 聚合酶
(Sangon 公司), 1μg μL BSA , 5%DMSO 。扩增程序
为:94℃预变性 2min。94℃ 0.5min;60℃, 1min;
72℃, 1min;共进行 40 个循环。最后 72℃延伸
7min 。扩增产物经 1.0 %琼脂糖电泳后用 Gel Doc
图像分析仪观察。
1.3.3　序列测定
序列测定在ABI 377 DNA自动测序仪(PE公司)
上完成 ,分别从正反链测序 ,所用引物为扩增引物。
1.4　序列分析
用 CLUS TAL X软件[ 14] 进行对位排列。对位
排列后的序列 ,用 PHYLIP[ 15] 和 MEGA[ 16] 软件进
行系统发生分析和遗传距离计算 。
178 遗　传 HEREDITAS (Beijing)2003　　　　　　　　　　　　　　　　25卷　
图 1　用 28S rRNA 基因序列构建的杉科 、柏科系统发生树
A:采用简约法构建的严格一致树;B:采用邻接法构建的严格一致树。
各分支上的数值为抽样自展值(2000次重抽样分析)。
Fig.1　The phylogeny trees of Taxodiaceae and Cupressaceae s.s.based on 28S rRNA gene sequence
A:Maximum parsimony st rict consensus t ree;B:Neighbor joining st rict Consensus t ree.
Numbers on each branch are the bootst rap values(2000 replications).
2　结果 与分 析
首先分别以 Sciadopitys verticillata , Cedrus deo-
dara作为外类群构建系统树。结果 ,简约树和邻接树
均显示杉科与柏科构成一个单系群 ,其中 Cunning-
hamia是其基部类群 ,但是某些分支类群的抽样自展
值较低(本文未列出分析结果)。为了分析杉科
(Cunninghamia 除外)与柏科内部各属之间的关系 ,
我们参考 Kusumi 等[ 11] 的分析方法 ,即用 Cunning-
hamia作为外类群进行系统发生分析 ,所获得的系统
发生树如图 1。图 1表明 ,两种方法(简约法和邻接
法)构建的杉科与柏科系统发生树的树形结构基本一
致 ,杉科与柏科构成一个单系群。在杉科与柏科组成
的单系群中 ,柏科聚成一支系(柏木亚科 , Cupres-
soideae),简约法和邻接法的抽样自展值分别为 90%
和98%。杉科中的 Metasequoia 、Sequoia 、Sequoiaden-
dron关系较近 ,聚成一支系(红杉亚科 ,Sequoioideae);
Taxodium 、Glyptostrobus 、Cryptomeria 关系较近 ,聚成
一支系(落羽杉亚科 ,Taxodioideae);在用 NJ方法构建
的系统发生树中 ,这两个支系的抽样自展值均较高 ,
分别为 81%, 100%;密叶杉属(Athrotaxis)的三个种
聚成一支系(密叶杉亚科 , Athrotaxidoideae)。这一分
析结果与叶绿体基因序列的分析结果基本一致 ,如
rbcL
[ 6] 、matK [ 10] 、chlL 、trnL-trnF IGS区和 trnL 内
含子[ 11] 等分析。但是 28S rRNA 基因序列分析不能
分辨上述各个支系之间的系统发生关系。简约法和
邻接法构建的杉科 、柏科系统发生树除了个别分支上
的抽样自展值的差异外 ,主要的差异是关于密叶杉属
(Athrotaxis)三个种之间的关系 。简约树上显示 A.
cupressoides(小叶密叶杉)和 A.selaginoides(黄枝密叶
杉)的关系较近 ,但支持率较低 ,而邻接法构建的系统
树上显示 A.cupressoides和 A.laxi folis(密叶杉)的关
系较近 。邻接法的分析与叶绿体基因序列的分析结
果相吻合[ 8 ,11] 。
3　讨　　论
由于 28S rRNA基因序列分析未能揭示杉科 、柏
科各个支系之间的系统发生关系 ,我们探讨了 28S
rRNA基因序列的进化速率(见表 2)。表 2显示 28S
rRNA基因是已经研究过的杉科 、柏科植物中进化速
率最慢的基因(DNA片段),其总替代速率仅为 rbcL
的 1 3 , chlL trnL -trnF IGS区的 1 5 , ITS2区的1 9 ,
ITS1区的 1 30(比较所用 Glyptostrobus 、Cryptomeria
的 ITS1 、ITS2的序列由我们研究小组测定 ,序列数据
179　2 期　　　　　　　　李春香等:杉科 、柏科的系统发生分析———来自 28S rDNA序列分析的证据
已经输入 NCBI 的基因库中 ,序列号为 AF387522 、
AF387525),加上所分析的片段较短 ,因此未能分辨杉
科 、柏科各个支系之间的关系 。尽管 rbcL 基因的总
替代速率也较慢 ,非同义替代速率更慢(见表2),但由
于所用的片段较长 ,因而提高了分辨率 ,可用于杉科 、
柏科部分属的系统关系研究[ 6] 。而 matK 、chlL 、trnL
-trnF IGS区及 trnL 内含子基因的替代速率均较
快:如 matK 总替代速率是 rbcL 的 2.7倍 ,非同义替
代速率是 rbcL 的 11倍 ,而且其片段较长 ,因而具有
较高的分辨率 。基因系统发生分析结果显示 ,除了简
约树上个别分支上的支持率略低外 ,可以揭示了杉
科 、柏科各个属之间的系统关系[ 10 ～ 11] 。
表 2　杉科 、柏科几种基因替代速率的比较a
Table 2　Subsitution rate for several genesa in
Taxodiaceae and Cupressaceae s.s
基因 长度b 总替代速率c 非同义替代速率c
28S rRNA 643 0.0068±0.0034
f rxC 705 0.0090±0.0037 0.0020±0.0020
rbcL 1395 0.0081±0.0024 0.0016±0.0016
matK 1533 0.0217±0.0040 0.0176±0.0053
t rnL F 319 0.0325±0.0103
t rnL 内含子 506 0.0141±0.0054
I TS1 611 0.2006±0.0209
I TS2 222 0.0581±0.0171
　a.Cryp tomeria 与 Glyptostrobus 相比;b.在 Cryptomeria中的碱基
对数目;c.Kimura-2 参数遗传距离。
杉科 、柏科的系统分类研究一直是裸子植物研
究的热点之一 ,将杉科 、柏科独立成科的观点 ,已经
遭到来自各方面资料的挑战 ,而杉科 、柏科内各属的
系统关系也存在着诸多分歧。本研究分析结果表明
杉科与柏科为一个单系群 ,支持杉科与柏科(金松属
除外)合并为广义柏科的观点 。而传统分类中的柏
科只是广义柏科中的一个支系(或柏木亚科);
Metasequoia 、Sequoia 、Sequoiadendron 聚成一支系;
Taxodium 、Glyptostrobus 、Cryptomeria 聚成一支
系 , Taiwania 、Athrotax is 也分别形成一支系 。这
一分析结果与叶绿体基因序列的分析结果基本一
致 ,但由于 28S rRNA 基因在广义柏科内的进化速
率较慢 ,加上本研究所分析的片段较短 ,因而未能揭
示广义柏科内各个支系之间的关系 ,今后应当选择
进化速度较快的 rDNA序列以进一步研究。
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