全 文 ：第 41卷　第4 期 厦门大学学报(自然科学版) Vol.41　No.4
　2002年 7 月 Journal of Xiamen University (Natural Science) Jul.2002　
文章编号:0438-0479(2002)04-0481-06
福建省桫椤科植物的分子分类学研究
收稿日期:2001-11-20
作者简介:陈鹭真(1977-),女 ,硕士研究生.
陈鹭真 ,李振基 ,周涵韬
(厦门大学生命科学学院 , 福建 厦门 361005)
摘要:桫椤科科下等级设立长期以来存在一定的争议.以福建省内 5 种桫椤科植物刺桫椤(Alsophila spinulosa
(Hook.)Tryon)、黑桫椤(Gymnosphaera podophylla (Hook.)Copel.)、针毛桫椤(G.metteniana (Hance)Tagawa)、粗齿桫椤
(G.hancockii(Copel.)Ching)、牛姆林桫椤(G.niumulinensis Li , Chen et Deng)(新拟)为材料 ,采用改进的 CTAB 法获得
了纯度较高 ,得率高 , 片段完整(片段大小均大于 23 kb)的基因组 DNA , 并运用 RAPD技术对这 5 种桫椤进行了遗传
多样性分析.从 40 个 10-mer随机引物中筛选 30 个有效引物 ,并利用这 30 个有效引物共扩增出1 073条 DNA 带.利用
UPGA 法对桫椤科的 5 个种的种间亲缘关系进行聚类分析 ,得出 5 个种的 DNA分子分类系统图.结果表明 , 可以分为
针毛桫椤 、刺桫椤和黑桫椤 3 组 ,平均遗传距离为 0.61 , 符合属间的关系 , 从而确定了 RAPD 技术用于桫椤科植物分
子分类研究的可行性.结合前人在形态解剖学方面的工作 ,提出这 5 种桫椤科植物可以分为 3 个类群 , 即刺桫椤类 、
黑桫椤类和针毛桫椤类 ,并提供了 3 个类群的检索表.
关键词:桫椤;RAPD;分子分类
中图分类号:Q 753 文献标识码:A　　　　　　　　　　　　　　　
　　桫椤科(Cyatheaceae)植物是地球上的最古老的
蕨类植物 ,在地球上已有 2亿多万年的历史 ,中生代
侏罗纪时期生长繁茂 ,但由于第四纪冰川的侵袭 ,桫
椤的生存受到严重影响 ,分布范围大大缩小 ,仅在一
些低纬度的生境中生存.由于桫椤科植物具有古老
性和孑遗性 ,它对研究物种的形成和植物地理区系
具有重要价值 ,在《国家重点保护野生植物名录》中 ,
桫椤科植物被列为国家二级保护植物;在《濒危野生
动植物种国际贸易公约》(CITES)中桫椤科植物被列
为附录Ⅱ物种;在《森林法》第三十八条制定的《国家
禁止 、限制出口的珍贵树木名录》中 ,全部桫椤被列
为限制出口的树种.目前 ,在我国主要分布于台湾 、
福建 、海南 、广东 、广西 、贵州 、四川 、云南 、西藏等省
区的高湿 、荫蔽的生境中.
目前野生桫椤面临着严重的威胁 ,包括毁林开
荒过程中受到的破坏 ,生态旅游过程中生境改变 ,环
境污染 ,药材与其他原因的采集与挖掘 ,一些种类甚
至没来得及被定名可能就被破坏了 ,因此野生桫椤
的资源调查 、多样性研究和保护 ,已经成了目前濒危
种类研究和保护的重要内容.
国内外对桫椤科植物已开展了较多的生物学研
究工作 ,工作大多集中在生态学[ 1～ 3] 、解剖学[ 4 ,5] 、
繁殖生物学[ 6] 、生理学[ 7]以及核型研究[ 8]等方面 ,对
桫椤科植物的分类主要通过形态比较 、细胞学观察 ,
包括核型观察等进行研究[ 4～ 18] ,但还未见应用分子
生物学方法对桫椤科植物进行分类的报道.本文通
过对福建省内的 5种桫椤科植物进行 RAPD分析 ,
从 DNA分子水平上探讨桫椤科不同种之间的遗传
关系 ,从而为进一步保护珍稀濒危的桫椤种类 ,有效
地利用常见的桫椤资源提供科学依据.
1　材料和方法
1.1　材　料
(1)桫椤科植物样品:实验用 5种桫椤科植物
嫩叶样品为:刺桫椤(Alsophila spinulosa (Hook.)Try-
on)、黑 桫 椤 (Gymnosphaera podophylla (Hook.)
Copel.)、针毛桫椤(G.metteniana (Hance)Tagawa)、
粗齿桫椤(G.hancockii (Copel.)Ching)、牛姆林桫
椤(G.niumulinensis Li , Chen et Deng)(新拟).除刺
桫椤采自位于东经 117°14′,北纬 24°56′的福建虎伯
寮国家级自然保护区的和溪乐土外 ,其余 4种桫椤
表 1　5 种桫椤科植物生境特征
Tab.1　Habitat characteristics of 5 species of Cyatheaceae
　　　种　　类 海拔/ m 土壤 年均温/ ℃ 年降水量/ mm 离沟谷距离/m 湿度/ % 光照要求
刺桫椤(Alsophila spinulosa) 255 砖红壤性红壤 20.4 2 000 1 ～ 5 100 耐荫
黑桫椤(Gymnosphaera podophylla) 660 山地红壤 17.5 1 700 1 ～ 3 100 弱阳性
针毛桫椤(G.metteniana) 580 山地红壤 17.5 1 700 5 ～ 10 80 ～ 90 耐荫
粗齿桫椤(G.hancockii) 580 山地红壤 17.5 1 700 5 ～ 10 80 ～ 90 耐荫
牛姆林桫椤(G.niumulinensis) 670 山地红壤 17.5 1 700 1 ～ 2 90 ～ 95 弱阳性
均采自位于东经 117°55′～ 117°57′,北纬 25°23′～ 25°
25′的永春县境内的福建牛姆林自然保护区核心区 ,
采集时间为2001年 3月 ,生境特征详见表 1.鲜样采
后保存在-70 ℃的低温冰箱中.
新拟的牛姆林桫椤高 60 ～ 100 cm ,地上无主干 ,
叶簇生 ,叶柄 、叶轴和羽轴栗黑色至深紫红色 ,叶片
卵状长圆形 ,长 30 ～ 60 cm ,宽 20 ～ 30 cm ,二回羽状
深裂 ,羽片约 12对 ,近对生 ,斜展 ,下部 2 ～ 3对羽片
有柄 ,羽片长 8 ～ 15 cm ,下部羽片深裂至近羽轴 ,上
部羽片浅裂 ,顶端长渐尖.叶脉羽状 ,不明显 ,叶纸
质 ,下面灰绿色 ,叶轴和羽轴上面被棕色鳞片.孢子
囊群圆形 ,沿中脉两侧排成 2 ～ 3行 ,无孢子囊群盖 ,
无隔丝.
(2)试剂:Taq DNA聚合酶 、单核苷酸(dNTPs)、
分子Marker 、CTAB等均为 Promega 公司产品;所用引
物(表 2)为 Operon公司产品;其它试剂均为国产分
析纯试剂 。
(3)仪器PCR仪:Biometra ,T3型;紫外分光光度
计:752型;电泳仪:BIO-RAD公司 ,Power300型;凝胶
成像系统:UVP 公司 ,GDS8000.
1.2　实验方法
(1)桫椤科植物 DNA的提取及检测
桫椤科植物总基因组的提取 ,采用改进的 CTAB
(cetyl trimethyl ammonium bromide ,十六烷基三甲基溴
化铵法)[ 20] .称取 0.8 g 桫椤的叶状体(去除维管
束),加液氮研磨成粉状 ,加入预热至 65 ℃的 CTAB
抽提缓冲液(1%β-巯基乙醇 ,2%CTAB , 1.4 mol/dm3
NaCl , 20 mmol/dm3 EDTA , 100 mmol/dm3 Tris-HCl ,
pH8.0)混匀 ,65 ℃恒温 1 h.加入等体积的氯仿∶异
戊醇(24∶1)抽提.于15 000 r/min离心 10 min ,取上
清液 ,加入 2/3体积异丙醇混匀 ,置于-20 ℃冰箱
中60 min.于 15 000 r/min离心 10min.弃上清液 ,沉
淀用 70%的酒精洗两次 ,待酒精挥干后 ,加入400μL
表 2　30 个有效引物对 5 种桫椤 DNA 的扩增情况
　Tab.2　Amplifications of 30 effective primers on 5 species of Cy-
atheaceae
编号 引物名 序列(5 ～ 3 ) 总带数 带数/样品
1 S11 GTAGACCCGT 21 4.2
2 S12 CCTTGACGCA 52 10.4
3 S13 TTCCCCCGCT 19 3.8
4 S15 GGAGGGTGTT 16 3.2
5 S17 AGGGAACGAG 41 8.2
6 S21 CAGGCCCTTC 55 11.0
7 S22 TGCCGAGCTG 40 8.0
8 S23 AGTCAGCCAC 50 10.0
9 S24 AATCGGGCTG 42 8.4
10 S26 GGTCCCTGAC 43 8.6
11 S28 GTGACGTAGG 11 2.2
12 S29 GGGTAACGCC 32 6.4
13 S49 CTCTGGAGAC 19 3.8
14 S51 AGCGCCATTG 31 6.2
15 S52 CACCGTATCC 48 9.6
16 S53 GGGGTGACGA 37 7.4
17 S54 CTTCCCCAAG 61 12.2
18 S55 CATCCGTGCT 40 8.0
19 S56 AGGGCGTAAG 38 7.6
20 S58 GAGAGCCAAC 29 5.8
21 S59 CTGGGGACTT 27 5.4
22 S61 TTCGAGCCAG 42 8.4
23 S62 GTGAGGCGTC 28 5.6
24 S63 GGGGGTCTTT 31 6.2
25 S64 CCGCATCTAC 28 5.6
26 S65 GATGACCGCC 30 6.0
27 S66 GAACGGACTC 41 8.2
28 S67 GTCCCGACGA 43 8.6
29 S68 TGGACCGGTG 36 7.2
30 S69 CTCACCGTCC 42 8.4
平均 35.8 7.2
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TE缓冲液溶解.加入 RNase 至终浓度为 50 ng/cm3 ,
置于 37 ℃恒温水浴 60 min.加入等体积酚∶氯仿∶异
戊醇(25∶24∶1)抽提两次 ,于 15 000 r/min 离心 10
min.取上清液 ,加入 1/10体积 3 mol/dm3 NaAc 和 2
倍体积的无水乙醇 ,置于-20 ℃冰箱中 90 min.于
15 000 r/min离心 10 min ,弃上清液 ,沉淀用 70%的
酒精洗两次.待酒精挥干后 ,加入 50μLTE缓冲液溶
解.
(2)RAPD反应
聚合酶链式反应(PCR)体系 Taq DNA聚合酶 1
U ,引物(5 μmol/dm3)2 μL , dNTPs (1 mmol/dm3)2.5
μL ,10×buffer2.5μL ,MgCl2(2mmol/dm3)2.5μL ,模板
DNA50 ng ,加超纯水至 25 μL.PCR循环设置为:94
℃变性 1 min , 36 ℃复性 1 min ,72 ℃延伸 2 min ,共
40个循环 ,然后 72 ℃延伸 7 min ,最后将结果置于 4
℃冰箱保存.然后做电泳观察.
(3)数据的统计与分析
按琼脂糖凝胶同一位置上 DNA带的有无进行
统计 ,有带的记为`1 (包括弱带),无带的记为`0 .
利用 UPGA(unweighted pair group average)统计软件对
所得数据进行统计分析.
2　结果与分析
2.1　DNA提取结果
提取的 5种桫椤科植物 DNA溶液.琼脂糖凝胶
电泳检测结果见图 1.
图 1　5种桫椤科植物 DNA 电泳检测图谱
(1 ～ 5 依次为:1.针毛桫椤 , 2.牛姆林桫椤 , 3.粗齿
桫椤 , 4.黑桫椤 , 5.刺桫椤;M 为λDNA/HindⅢ分子
量标记)
Fig.1　DNA electrophoresis examination of 5 species of Cy-
atheaceae
由图 1可知 , 5 种桫椤的 DNA 纯度较好 , DNA
的片段大小均一 ,长度均大于 23 kb ,有利于 RAPD
扩增.
2.2　引物的筛选及扩增结果
从 40个 10-mer随机引物中筛选出 30个有效引
物(表 2).引物的筛选是根据以下原则进行的:扩增
多态性引物的能力;条带强度;扩增条带数;多态性
位点数目和扩增的重复性.这 30个有效引物在 5种
桫椤中共扩增出 1 073 条 DNA 带 ,平均每个引物扩
增带数为35.8条 ,引物扩增得到PCR指纹图谱见图
2.并对DNA带型进行统计.
2.3　桫椤植物 RAPD聚类分析
利用 UPGA统计软件对 30 个有效引物在 5种
桫椤科植物 DNA 中扩增产生的共 1 073条 DNA带
进行分析.首先得到的是 5种桫椤科植物间的遗传
距离矩阵(表 3).遗传距离越大 ,其种间的亲缘关系
也就越远.在表 3的基础上进而作出 5个种的 DNA
分子分类系统图(图 3).从图 3 中可以清楚的看到 ,
5个种的遗传距离的远近.聚类分析的结果 ,可将 5
种桫椤科植物分为 3组 ,第 1组为针毛桫椤 、粗齿桫
椤;第 2 组为刺桫椤;第 3组为牛姆林桫椤和黑桫
椤.
表 3　5 种桫椤科植物种间的遗传距离矩阵
　　Tab.3　Genetic distance matrix among 5 species of
Cyatheaceae
针毛
桫椤
牛姆林
桫 椤
粗齿
桫椤
黑
桫椤
刺
桫椤
针毛桫椤 0
牛姆林桫椤 0.64 0
粗齿桫椤 0.49 0.60 0
黑桫椤 0.65 0.62 0.63 0
刺桫椤 0.56 0.64 0.63 0.64 0
3　讨　论
3.1　桫椤遗传距离之间的关系
从聚类分析的结果看 ,这 5种桫椤科植物平均
遗传距离为 0.61 ,可分为 3组.第 1组为针毛桫椤 、
粗齿桫椤 ,遗传距离是 0.49.第 2组为刺桫椤 ,和第
1组平均距离是 0.595.第 3组为牛姆林桫椤和黑桫
椤 ,其与前两组的遗传距离是 0.635.
桫椤科植物是真蕨中的一个独特的类群 ,因其
大多具有树状的自立茎 ,又称为树蕨.桫椤科植物基
·483·第 4期　　　　　　　　　　　　　陈鹭真等:福建省桫椤科植物的分子分类学研究
　图 2　桫椤科 5种植物的 DNA指纹图谱
(1～ 5依次为:1.针毛桫椤 , 2.牛姆林桫椤 , 3.粗齿桫椤 , 4.黑桫椤 , 5.刺桫椤;M为λDNA EcoRⅠ/HindⅢ分子
量标记)
　Fig.2　Genomic DNA fingerprints of 5 species of Cyatheaceae
genetic distance
　图 3　桫椤科 5 种植物的分子聚类图
(Gm:针毛桫椤 , Gh :粗齿桫椤 , As:刺桫椤 , Gn :
牛姆林桫椤 , Gp:黑桫椤)
　Fig.3 　DNA molecular dendrogram of 5 species of Cy-
atheaceae
部有多数不定根 ,或地下根状茎粗大 ,顶部密被鳞
片.叶大型且被毛或近基部有大鳞片 ,鳞片质坚厚.
叶片为二回或三回羽状 ,分离或少有连结.孢子囊群
圆形 ,有或无囊群盖[ 13] .目前 ,全世界约有该科植物
500种[ 14～ 17] ,中国已知有 20 余种 , 其中木桫椤属
(Alsophila)10 余种 , 黑桫椤属(Gymnosphaera)约 5
种 ,白桫椤属(Sphaeropteris)3种[ 12 ,13] .在福建省境内
已报道的有这 3个属共 6种 1变种植物[ 11 , 12] ,其中
厦门引种栽培的笔筒树[ 11]已不复存在 ,福建植物志
中报道的福建桫椤[ 12]已被并入小黑桫椤(即针毛桫
椤)[ 11] ,我们在永春牛姆林科学考察过程中发现一
新种 ,因此实际上福建目前有 2属 5种 1 变种桫椤
科植物.
长期以来 ,桫椤科科下等级的设立有一定的争
议.1810年 Brown根据孢子囊群盖的有无以及盖的
形状 , 将它划分为 Cyathea 、Hemitelia 和 Alsophila 3
属 ,1930年 Domin 把它们并为 1属 , Copeland(1947)
将桫椤科植物分成 7属[ 11] .近年来 Tyron对美洲桫
椤科植物研究之后提出 6属[ 14 , 16] ,受到广泛注意.
而Holttum(1957 , 1974 , 1981)认为所查明的桫椤科
植物的染色体数目都是 n=69 ,坚持合并为 1属[ 18] .
秦仁昌 1978年将中国的桫椤科植物分为木桫椤属
Alsophila 、白桫椤属 Sphaeropteris 和黑桫椤属 Gym-
nosphaera[ 12] ,夏群(1989)根据叶柄基部的鳞片和叶
轴背面两侧的气囊体的异同把桫椤科植物归为 2
属 ,即白桫椤属 Sphaeropteris和桫椤属Alsophila ,把黑
桫椤属并入桫椤属[ 11] .
我们从分子分类学的角度来研究桫椤科植物的
亲缘关系表明:5种福建所采集到的桫椤科植物的
遗传距离范围在 0.49到 0.64之间 ,遗传距离较近 ,
符合属间的关系.因此这里我们暂把它们分为 3个
类群 ,即刺桫椤类 、黑桫椤类和针毛桫椤类.刺桫椤
类自成体系毫无疑问 ,如秦仁昌 、吴兆洪等都将其作
为 1个属来处理[ 12 ,13] ,夏群也提出桫椤亚属(即木
桫椤亚属)的植物有孢子囊群盖 ,每个孢子囊能产生
16个孢子 ,而黑桫椤类植物无孢子囊群盖 ,每个孢
子囊能产生 64 个孢子[ 11] .我们注意到前者不仅在
形态上叶轴呈禾杆色 ,而且叶轴的质地很硬 ,后者绝
非如此.在孢子形态上它们也相差很大(待发表).
·484· 厦门大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　　2002年
表 4　福建桫椤科 3 个类群植物分类检索表
Tab.4　Classification of 3 groups of Cyatheaceae on morphology in Fujian
1.有囊群盖;每个孢子囊能产生 16 个孢子;叶柄和叶轴在新鲜时常为绿色 木桫椤类 Alsophila………………………………
1.无囊群盖;每个孢子囊能产生 64 个孢子;叶柄和叶轴通常黑色 、深紫褐色或棕色.
2.叶为一至二回羽状;能育小羽片与不育小羽片略呈二形;叶柄和叶轴通常黑色 、深紫褐色 ,小羽片边缘仅具疏钝锯齿
或波状圆齿 ,其相邻两组羽状脉的基部一对侧脉的基部一对侧脉通常在中部或上部联结子囊群无隔丝 ,分布于林内
光窗 ,地理分布范围在南亚热带以南 , 海拔高度偏低 2.黑桫椤类 Eugymnosphaera………………………………………
2.叶为三回羽裂;能育小羽片与不育小羽片不呈二形;叶柄和叶轴通常棕色 , 小羽片边缘羽裂至深羽裂 , 侧脉全部分
离 , 不联结;孢子囊群有隔丝 ,分布于阴暗生境 , 地理分布范围在南亚热带以南 ,海拔高度偏低
3.针毛桫椤类 Tripinnatopteris………………………………………………………………………………………………
　　进一步我们对传统的黑桫椤属进行讨论.它们
聚类分析的结果分别排在第 1组与第 3组 , 中间为
木桫椤类所断开.进一步从形态上对它们进行认真
比较 ,表明它们之间也可以较明显地分为2个类群:
针毛桫椤类和黑桫椤类.吴兆洪曾提及传统的黑桫
椤属可以分为 2个组 ,真黑桫椤组 Eugymnosphaera
的能 育小羽 片与不 育小 羽片 略呈 二形 , 而
Thysanobotrya 组的能育小羽片与不育小羽片明显二
形(我国不产)[ 13] .我们注意到针毛桫椤类的针毛桫
椤 、粗齿桫椤和未能采集到的光叶小黑桫椤变种的
能育小羽片与不育小羽片不呈二形 ,在分布范围上
它们处于中国桫椤分布的北界的广东 、广西中部以
北的几个省份和较高海拔的位置 ,在生境需求方面
它们更耐荫.因此在这里我们将它们分成针毛桫椤
类和黑桫椤类.这 3个类群的检索表如表 4.
3.2　桫椤科植物遗传多样性研究的意义
桫椤科植物均为珍惜的孑遗植物 ,因为其具有
较高的药用和庭园观赏价值 ,所以其遗传育种更受
到人们的关注.由于在野生状态下桫椤科植物的孢
子繁殖力不高 ,这样对桫椤的遗传育种研究更为重
要.对桫椤科植物的分子分类学研究 ,对桫椤资源的
保护和开发具有重要意义.另外 ,目前桫椤引栽幼株
的方法成活率虽然高 ,但若配以遗传育种的方法 ,能
够大大推广桫椤的种植.目前 ,有一些桫椤种类已经
得到试管苗 ,可以选择与之遗传距离相近的种类进
行培养.因此 ,桫椤科植物的亲缘关系的研究 ,可以
指导桫椤科植物的遗传育种 ,具有较大的现实意义.
RAPD反应采用合成的 10核苷酸随机引物 ,对
核基因组DNA进行 PCR扩增.它具有较大的丰富性
﹑高效性和灵敏性[ 20] ,理论上所检测的遗传变异可
反映整个基因组的变化 ,技术上简便易行 ,对所需设
备要求也不高 ,而且在条件控制得当时 ,也具有较高
的重复性.但是 RAPD技术只有在筛选到能特异扩
增的有效引物后 ,才能将它用于分子分类学的研究.
本实验结果表明在科下亲缘关系的研究结果与传统
的形态分类存在一定的差异 ,这与两种分类方法建
立的基础不同有关.汪小全等认为 RAPD方法应用
于种间乃至近缘属之间亲缘关系的研究 ,但有一定
的局限性[ 22] .这种差异有待于进一步研究.但通过
重复性实验得到的结果表明本实验能较为客观地反
映这 5种桫椤科植物的相互关系.为了建立一套更
客观的桫椤科植物的自然分类系统 ,我们还要从传
统分类学 、蛋白质水平 ,以及 DNA水平上 ,进一步开
展研究工作.
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Study on Molecular Taxonomy of 5 Species of Cyatheaceae in Fujian
CHEN Lu-zhen , LI Zhen-ji , ZHOU Han-tao
(School of Life Sciences , Xiamen University , Xiamen 361005 , China)
Abstract:The classification of the species of Cyatheaceae has been disputative for a long time.Genetic method of
RAPD was used to analyse the genetic distance of 5 species of Cyatheaceae in Fujian Province.Their DNAs were extract-
ed by the CTAB method.30 effective primers were screened from 40 arbitrary primers , and 1 073 DNA bands were am-
plified.Based on UPGA cluster analysis on DNA bands amplified by 30 primers , a DNA molecular dendrogram was es-
tablished.The 5 species of Cyatheaceae can be divided into 3 groups.Group A , B , C consist of Gymnosphaera metteni-
ana and G.hancockii , Alsophila spinulosa , and G.podophylla and G.niumulinensis , respectively.The 3 groups of
Cyatheaceas plants have been posed from the 5 species combining our molecular analysis with reported morphological and
anatomical results.
Key words:Cyatheaceae;RAPD;molecular taxonomy
·486· 厦门大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　　2002年