全 文 ：基于 rpl16-rpl14、GS序列的广义菊属
若干分类群亲缘关系研究
陈素梅 , 陈发棣 , 赵宏波 , 房伟民
(南京农业大学园艺学院 ,江苏南京 210095)
　　摘要:基于叶绿体 rpl16-rpl14基因间区序列和 GS基因序列对广义菊属(菊科 ,春黄菊族)部分属间关系进
行了探讨。结果表明 ,本研究涉及的所有分类群均归于一个单系统发生的广义菊属分类群(自展值 100%), 该单
系统发生分类群可进一步分为 3个狭义属分类群 ,即菊属(Dendranthema, 自展值 96%), 菊蒿属(Tanacenum, 自展
值 87%)和木茼蒿属(Argyranthemum,位于广义菊属分类群基部分支)分类群。表明上述基因区段可有效阐明属
水平的系统关系。尽管野菊的不同地理居群间或种间在形态学上存在较大差异 , 但基于上述基因序列未能很好
地区别其间的系统发生关系 , 推测其相互间的基因差异较小。有待于采用多种分子标记对该族更多的分类群展
开研究 ,特别是对属下水平分类群间的系统发生关系进行探讨。
　　关键词:菊科;春黄菊族;广义菊属;系统发生;rpl16-rpl14;GS
　　中图分类号:S682.1+10.1　　文献标识码:A　　文章编号:1002-1302(2007)06-0113-04
收稿日期:2007-05-29
基金项目:国家自然科学基金(编号:30400308);上海市农业重点攻
关项目(编号:农科攻字 2006-4-3)。
作者简介:陈素梅(1972—),女 , 江苏海安人 , 博士 ,讲师 ,从事花卉
分子生物学研究。 E-mail:chensumei72@hotmail.com。
通讯作者:陈发棣。 Tel:(025)84395231;E-mail:chenfd@njau.
edu.cn。
　　菊科春黄菊族———广义菊属 ,共有 12个亚族 ,
108个属 , 1 741个种 [ 1] ,多分布于地中海周围欧亚
与非洲地区 。该族大多数属是基于染色体基数 9的
多倍体 ,种间可以自然或人工交杂 [ 2] ,使得该属分
类群间的关系十分复杂。
形态学比较 、核型分析 、DAPI分带 、原位杂交等
曾被广泛用于春黄菊属及属下关系的研究 [ 3-4] 。然
而 ,这些技术应用于种内形态特征的差异 、种间形态
特征的交叉 、不同地理居群间甚至同一个种不同个
体间核型的差异[ 5]的研究具有一定局限性 ,诸如 ,
细胞学研究中的压片技术等人为因素的影响 ,加之
菊科遗传背景的复杂性均在很大程度上限制了这些
手段的有效利用 。近年来 ,利用各种基因序列如核
糖体 ITS(internaltranscribedspacers)领域 ,叶绿体
基因 matK、trnL-F、trnT-trnL以及 ndhF等基因与
基因间区对 Dorinicum、Castrilanthemum、Dendranthe-
ma、Centaureinae族地中海分布的春黄菊族植物系
统发生关系进行了探讨[ 6-10] 。此外 , RAPD和 ISSR
分子标记也被应用于野菊(Chrysanthemumindicum)
的研究[ 11] 。但迄今 ,该族属的界定尚不明确 ,遗传
背景的复杂性及多系统起源使得其种间关系的研究
特别困难 。因此 ,必须寻求新的分子手段来阐明该
族特别是低分类阶元分类群间的关系。
叶绿体基因 rpl16 -rpl14和 GS基因在低分类
阶元如不同居群(水稻)及种间和品种间(樱花)、属
水平(西番莲)的亲缘关系研究中十分有效[ 12-14] 。
本研究旨在利用这些分子标记对春黄菊族狭义属进
行界定 ,并探讨其在阐明种间甚至不同地理居群间
系统发生关系的有效性 ,为栽培菊花的起源和菊花
育种亲本的选配提供分子系统发生学依据。
1　材料与方法
1.1　材料
供试材料为春黄菊族 3个属 、6个种 、1个变种 、
5个地理居群野菊(表 1),所有材料均保存于南京
农业大学中国菊花种质资源保存中心。
1.2　方法
1.2.1　DNA提取 、基因间区的扩增 、亚克隆及序列
测定　取 0.5 g嫩叶 ,利用改进的 CTAB法提取基
因组 DNA[ 15] 。引物 PS-IDf(5′-AAAGATCTAGA
TTTCGTAAACAACATAGAGGAAGAA-3′)和 PS-
IDr(5′-ATCTGCAGCATTTAAAAGGGTCTGAGGTT-
GAATCAT-3′)用于扩增 rpl16 -rpl14领域 。 GSf
(5′-CACCAATGGGGAGGTTATGC-3′)和 GSr
—111—江苏农业科学　2007年第 6期DOI :10.15889/j.issn.1002-1302.2007.06.057
表 1　广义菊不同的分类群及其采集地点和染色体倍性
分类单元 来源 倍性
木茼蒿(Argyranthemumfrutescens) 日本千叶 二倍体
除虫菊(Tanacetumcinerariaefolium) 中国云南 二倍体
Tanacetumptarmiciflorum 日本千叶 a
小红菊(Dendranthemachaneti) 中国北京 四倍体
甘菊(D.lavandulifolium) 中国北京 二倍体
仪征野菊 [ D.indicum(YZ)] 中国江苏 四倍体
河南野菊 [ D.indicum(HN)] 中国河南 四倍体
贵州野菊 [ D.indicum(GZ)] 中国贵州 四倍体
南京野菊 [ D.indicum(NJ)] 中国南京 四倍体
浙江野菊 [ D.indicum(HZ)] 中国浙江 四倍体
神农香菊(D.indicumvar.aromaticum) 中国湖北 四倍体
　　注:a未知倍性。
(5′-CATCTTCCCTCATGCTCTTTGT-3′)用于扩增
GS领域 。PCR反应体系为 25μl,其中模板 DNA约
100ng, 10×Bufer2.5μl, dNTP2.0μl, ExTaq2 U,
25 μmol/Lprimer1 μl。反应条件为:95℃预变性 5
min;30个循环 ,每个循环 94℃变性 45s, 60℃退火
1 min, 72 ℃延伸 2 min;最后在 72 ℃延伸 10 min。
PCR产物用 1%琼脂糖凝胶进行电泳检测 ,利用 QI-
AEXII琼脂糖回收试剂盒 (Qiagen, Maryland,
USA)进行纯化回收 。纯化的 PCR产物克隆入 T-
载体 (pGEM-TEasyVector, Promega, Madison,
WI, USA),并转化 E.coliJM109 (TaKaRa, Otsu,
Shiga, Japan)。 DNA序列在 ABIPrism3100Genetic
Analyzer上完成(AppliedBiosystems, CA, USA),对
扩增片段的正义和反义链均进行了测序。
1.2.2　序列分析与系统树构建　对获得的序列借
助 BLAST与 GenBank中的序列进行同源性比较分
析 。序列比对采用 ClustalX1.81软件 [ 16] ,系统树的
构建采用 PAUP＊ 4.0b10软件[ 17] 。用邻近法构建
系统树:空位(gap)作为缺失状态 ,用自展法(Boot-
strapanalysis)检验系统树 ,自展数据集为 1 000次 。
分别以 Lycopersiconesculentum(DQ347959)和 Nicoti-
anatabacum(Z0004)的相应序列作为 rpl16 -rpl14
的外类群;Juglansnigra(AF169795)和 Adeniagum-
mifera(AY261533)作为 GS序列的外类群。 rpl16-
rpl14和 GS数 据组分析时 采取外类 群拼接
(DQ347959 +AF169795作为外类群 1, Z0004 +
AY261533作为外类群 2)。
2　结果
2.1　PCR产物片段长度多态性
BLAST结果表明 ,获得的序列与 GenBank中相
应序列高度同源。 rpl16-rpl14领域包括 rpl16 -
rpl14间区以及部分 rpl16领域(图 1A),各个分类群
间 PCR片段长度类似(图 2A)。 GS区段包括外显
子 Ⅶ 下游片段和外显子 XI上游片段及其间的内含
子区段 ,不同物种间 GS片段长度不同 ,狭义菊属片
段较长 ,而菊蒿属和木茼蒿属片段较短 ,缺乏内含子
X区段(图 1B、1C、图 2B)。
2.2　基于 rpl16-rpl14序列构建的系统树
邻近法构建的系统树 (treelength=104, CI=
0.961 5, RI=0.936 5, RC=0.900 5)显示:广义菊
属是一个单系群 (自展值 100%),包含狭义菊属
(Dendranthema)单系群(自展值 89%)。在狭义菊
属单系群中小红菊(D.chaneti),甘菊(D.lavandul-
ifolium)和南京野菊(D.indicumNJ)聚在一个支系 ,
具有中等自展值(62%),其他野菊地理居群和变种
则位于狭义菊属单系群顶部 。菊蒿属 (Tanacetum
cinerariaefolium, Tanacetumptarmiciflorum)和木茼蒿
属木茼蒿(Argyranthemumfrutescens)则为系统树的
基部分支 。木茼蒿位于系统树最基部。菊蒿属的两
个种处于邻近分支 ,但自展值低于 50%(图 3)。
—112— 江苏农业科学　2007年第 6期
2.3　基于 GS序列构建的分子系统树
邻近法构建的系统树(treelength=307, CI=
0.902 3, RI=0.743 6, RC=0.670 9)基本拓扑结
构与 rpl16-rpl14系统树类似 。除了春黄菊族单系
群和狭义菊属单系群外 ,菊蒿属两个种被聚入同一
个单系群(自展值 62%),木茼蒿属依然位于春黄菊
族单系群的最基部。但是狭义菊属内部种间或地理
居群间的相对位置有所变化(图 4)。
2.4　基于 rpl16-rpl14和 GS序列数据组构建的系
统树
　　基于 rpl16-rpl14和 GS序列数据组用邻近法
构建的系统树(treelength=417, CI=0.928 1, RI=
0.830 5, RC=0.770 8)的拓扑结构与基于单独序列
的拓扑结构相似 ,特别是与基于 GS序列构建的系
统树基本相同 ,但是自展值明显高于单独数据组 。
狭义菊属和菊蒿属的自展值分别高达 96%和 87%,
且互为姐妹群 ,自展值为 56%。木茼蒿属依然位于
春黄菊单系群的基部(图 5)。
3　讨论
3.1　染色体倍性由低倍到高倍的进化特征
除了二倍体甘菊外 ,所有的四倍体分类群均聚
入狭义菊属单系群 ,并处于系统树的上部。而二倍
体的木茼蒿则位于系统树的最基部 ,推测春黄菊族
的进化是一个由低倍到高倍的进化过程 ,这与先前
研究观点一致 [ 4] 。
3.2　rpl16-rpl14、GS序列在春黄菊族属的界定研
究中的有效性
狭义菊属曾被归并为广义菊属 [ 18] ,倒卵形 、薄
壁 、无绒毛菊果是菊属区别于其他属的明显特
征[ 1] 。该属主要分布于亚洲 ,特别是中国(紫花野
菊分布较广 ,在东欧 、俄罗斯及东亚都有分布)[ 1] 。
本研究亦表明狭义菊属聚为一个单系群位于广义菊
属单系群的内部 ,并位于系统树的上部 ,可能是春黄
菊族较进化的分类群。狭义菊属与菊蒿属间的关系
一直是争议的焦点 [ 19] ,原先归于菊属的很多种被划
入菊蒿属 ,使得该属成为春黄菊族的 “垃圾箱 ”[ 10] 。
但菊蒿属的羽状复叶和二回羽状复叶明显地区别于
菊属 , GISH研究结果亦表明菊属和菊蒿属的亲缘关
系较远[ 3] ,本研究结果也支持将菊蒿属单列出狭义
菊属 。木茼蒿是一类低矮的亚灌木或灌木 ,具少数
浅裂的羽状或二回羽状复叶 ,头状花序小 ,具三翼连
萼瘦果[ 20] ,原先仅限于 Macaronesia地区分布 ,现广
—113—陈素梅等:基于 rpl16-rpl14、GS序列的广义菊属若干分类群亲缘关系研究
泛分布于欧亚[ 21] 。 ndhF序列表明木茼蒿属归于菊
亚族 ,位于系统树的最基部(自展值 100%)[ 10] 。本
研究也发现木茼蒿位于春黄菊族单系群内 ,且位于
系统树的最基部 ,表明木茼蒿与春黄菊族的关系很
近 ,可能是春黄菊族中较原始的种。
3.3　狭义菊属单系群内部的系统发生关系
四倍体分类群均归于狭义菊属单系群。此外 ,
二倍体的甘菊也被归入这一单系群 ,先前的研究表
明甘菊是进化了的二倍体种[ 4] 。小红菊位于狭义
菊属单系群的基部 ,可能是狭义菊属中较原始的种 。
赵惠恩等[ 9]基于叶绿体基因的研究认为甘菊可能
是野菊的叶绿体供体 ,南京野菊归入上述两个种单系
群的原因可能是由于南京野菊与这两个物种共同演
化或与其发生了遗传物质的交换 ,具体原因尚有待进
一步研究证实 。不同地理居群野菊间并没能观测到
地理分布区隔化的趋势 ,推测野菊不同地理居群间遗
传物质的异质性较小 ,其相互间的亲缘关系有待于借
助分子信息多态更丰富的标记进一步探讨。
3.4　rpl16-rpl14、GS序列在春黄菊族低分类阶元
间系统发生关系研究中的局限性
尽管先前的研究表明 rpl16 -rpl14、GS序列在
属间 、种间或变种间以及不同地理居群间系统发生
关系的研究中十分有效。然而 ,该两个基因序列在
阐明野菊不同地理居群间关系时并不理想 ,这可能
与春黄菊族遗传背景的复杂性有关 。此外 ,这些基
因区段在不同科之间进化速度也可能不同 。
本研究仅对春黄菊族有限的分类群间系统发生
关系进行了初探 ,表明 rpl16-rpl14、GS两个基因区
段可作为春黄菊族属界定的有效标记 。综合运用该
领域与叶绿体多个基因领域或低拷贝核基因对春黄
菊族更多的分类群进行探讨 ,有望进一步阐明菊科
春黄菊族的系统发生关系 ,为栽培菊花的起源和育
种亲本的选配提供理论依据。
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(下转第 115页)
—114— 江苏农业科学　2007年第 6期
几个常见树种扦插生根过程中 POD、IAAO
活性及酚含量的变化
宋金耀 1 , 刘永军 2 , 宋　刚1 , 王桂峰 2 , 王贺山 2
(1.江苏农林职业技术学院生物工程系 ,江苏句容 212400;2.河北科技师范学院生命科学系 ,河北昌黎 066600)
　　摘要:以扦插易生根的柳 、杨(山海关杨)和不易生根的苹果 、李 、山楂等树种为试材 ,研究了扦插生根期间各
树种枝条内 POD、IAAO活性及酚含量的变化。结果表明 , POD、IAAO活性及酚类物质含量与树种枝条生根有密
切关系。在硬枝扦插中 ,易生根树种(柳)的 POD活性前期降低 ,后期升高 , 不易生根树种(李 、苹果)前期升高而
后期降低;易生根树种(柳)IAAO活性前期降低后期升高 , 不易生根树种一直表现升高趋势;酚类物质含量变化
与过氧化物酶活性变化呈相反的趋势 , 易生根树种前期升高 , 随之下降 ,然后再升高 , 不易生根树种规律性不强。
嫩枝扦插也有类似表现。
　　关键词:柳;杨;苹果;李;山楂;梨;扦插;生根;POD;IAAO;酚
　　中图分类号:S615.01　　文献标识码:A　　文章编号:1002-1302(2007)06-0115-04
(上接第 114页)
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　　有关植物离体枝条扦插生根的研究在国外报道
很多 ,尤其是对某些植物中存在的促进生根和抑制
生根物质的分析报告屡见不鲜 [ 1 -3] 。一般认为吲哚
乙酸是重要的发根激素 ,这在生产实践中已广泛应
用 [ 4] ,与此相关联的便是吲哚乙酸氧化酶(IAAO)
在植物组织中的活性不同时期具有不同的作用 ,
Bouilenne和 Bouilenne-Walrand[ 5] 1955年即提出
邻苯二酚可与生长素复合成生根素 ,认为酚类物质
是生根辅助因子 。目前已被认定有促根作用的酚类
物质有氯原酸 [ 6] 、儿茶酚[ 7] 、香豆酸 [ 8]等 ,并一致认
为酚可通过多酚氧化酶或过氧化物酶的作用而与
IAA结合发挥促根作用。关于过氧化物酶(POD)的
作用 , Garspar等将其视为生根标志之一 [ 9] ,并且 Pa-
checo等[ 10]在蓝桉离体枝条生根试验中发现 POD
有 2个高峰 ,第一个高峰出现在组织培养的第 1 d,
他认为该高峰与根的诱导有关;第二个高峰在第 10
收稿日期:2007-04-09
作者简介:宋金耀(1962—), 男 ,教授 ,主要从事植物酶学与植物生
理学研究。 Tel:(0511)87265816;E-mail:jysong@sina.com。
d左右 ,此时根已突破表皮 。 Moncousin根据葡萄离
体生根试验的结果 [ 11] ,提出植物离体生根过程的 4
个阶段:(1)诱发期 ,生化标志为酚含量升高而 POD
和 IAAO活性下降;(2)起始期 ,生化标志为酚含量
下降而 POD和 IAAO活性升高 ,这一点尤为重要;
(3)器官生成期 ,此期的表现是 POD和 IAAO活性
急剧降低;(4)生长期 ,这一期的 POD和 IAAO活性
以及酚含量表现无规律 。
先前试验 [ 12]证实 ,毛白杨和毛白杨嵌合体扦插
生根与否 ,与其体内 POD、IAAO活性及酚类物质含
量密切相关。扦插易生根成活的毛白杨嵌合体表现
与上述结果类似 ,而难成活的普通毛白杨却基本是
相反的趋势。本试验选择了扦插较易生根的杨(山
海关杨)、柳(垂柳)和不易生根的苹果 、李 、梨 、山楂
等几个常见树种(或品种)作为试验试材 ,对嫩枝扦
插 、硬枝扦插生根过程中插条的外部形态特征和内
部 3项生化指标的变化特点进行了比较分析 ,以明
确植物扦插生根的生理生化机制 。
—115—江苏农业科学　2007年第 6期