全 文 ：真藓科(Bryaceae)植物 RAPD反应体系的建立
赵建成1 , 　李文强1 , 　黄士良2 , 　李　琳1
(1.河北师范大学生命科学学院 ,河北 石家庄　050016;2.河北女子职业技术学院 应用技术系 ,河北石家庄　050091)
摘 要:真藓科植物的分子系统学研究是藓类植物研究中的新热点 , RAPD是分子系统学研究中被广泛采用
的一项重要技术.为了开展真藓科植物的分子系统学研究 , 通过单因素实验结合正交实验建立了适于该科植物的
RAPD最佳反应体系:dNTP为 0.2 mmol/ L , 随机引物 0.4μmol/ L , Taq DNA 聚合酶 1.25 U , Mg2+为 2 mmol/ L , 模
板 DNA 为 50 ng , 扩增体系为 25μL.确定扩增程序:95 ℃预变性 7 min;94 ℃变性 1 min , 36 ℃退火1 min , 72 ℃延伸
2 min , 40 个循环;72 ℃终延伸 7 min.并利用该体系从 200条随机引物中筛选出了 31 条高度多态性的引物.
关键词:真藓科;RAPD;分子系统学;PCR
中图分类号:Q 949.35　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-5854(2007)06-0810-04
真藓科(Bryaceae)是藓类植物中一个较大的类群 ,共计有 15 属 819种(含丝瓜藓属(Pohlia Hedwig.)
127种以及拟丝瓜藓属(Pseudopohlia R.S.Williams)2种等)[ 1] ,实际上的记载多达 1 200种以上 ,广布于世
界各地.我国先后记录有 11属 ,约 117种[ 2] .该类群常见于高寒山地林下 ,丘陵及平原的荫湿环境中 ,土生或
生于岩面薄土 ,少数种类生长于干旱半干旱荒漠 ,成为生物结皮层的重要成分.该科植物植株微小 ,形态变异
较大 ,因此在真藓科的经典分类中面临诸多问题 ,一些类群的分类地位存在很大的争议.近年来 ,一些研究者
开始从分子水平上探讨该科植物的分类与系统演化 ,并取得了一些进展[ 3～ 6] .开展真藓科植物的分子系统
学研究已经成为国内外研究者的共识.
RAPD(random amplified polymorphic DNA)是由Williams等于 1990年提出的一项分子标记技术[ 7] ,它
以 PCR技术为基础 ,用随机排列的寡聚脱氧核苷酸单链引物 ,扩增基因组中不同位点的 DNA ,进而得出等
位位点的多态性图谱.此技术操作简便 、成本低 、检测快速 ,目前已成功应用于遗传多样性检测 、遗传图谱 、品
种鉴定等多个领域[ 8] .尤其在分子系统学研究中 ,是一项重要的技术手段.但 RAPD也存在不明显的不足:
PCR易受到实验条件的影响 ,反应过于灵敏 ,反应体系的微小变化均可影响扩增结果 ,导致结果缺乏重复
性.但如果把条件标准化 ,也可以获得良好的实验结果[ 9] .但是 ,在真藓科植物分子系统学研究中尚未见采
用该技术的报道.本文中 ,笔者对真藓科植物的 RAPD反应体系进行研究 ,以期建立用于该科植物研究的标
准化 RAPD分析体系 ,为开展真藓科植物分子系统学分析 、遗传多样性评价以及品种鉴别等工作奠定基础.
1　材料与方法
1.1　材　料
新鲜标本由河北师范大学系统与进化植物学研究室标本上的孢子经实验室培养所得.干燥植物标本均
来自河北师范大学植物学标本室 ,凭证标本见表 1.
表 1　凭证标本
编号 学　　名 采集人 采集号
1 泛生丝瓜藓 Pohlia cruda 赵建成 030209c
2 双色真藓 Bryum bicola 刘永英 040034
3 大叶藓 Rhodobryum roseum 唐伟斌 018135
1.2　引物与试剂
Taq DNA 聚合酶 、dN TP 、琼脂糖由 BBI
公司提供 ,植物基因组 DNA 抽提试剂盒 、随机
引物由上海生工生物工程公司提供 ,其余试剂
均为分析纯.
收稿日期:2007-06-28
基金项目:国家自然科学基金(30670152);河北省自然科学基金(C2006000147)
作者简介:赵建成(1956-),男 ,陕西周至人 ,教授 ,主要从事苔藓植物生物学研究.
第 31卷/第 6期/
2007年 11月
河北师范大学学报/自然科学版/
JOURNALOFHEBEI NORMALUNIVERSITY/Natural Science Edition/
Vol.31 No.6
Nov.2007
DOI :10.13763/j.cnki.jhebnu.nse.2007.06.015
1.3　植物总 DNA 的提取
分别采用改良 CTAB法和基因组 DNA抽提试剂盒提取基因组 DNA ,并比较新鲜标本和干燥标本的提
取效果.CTAB法参照文献[ 10] ,试剂盒依使用说明操作 ,所提 DNA经 0.8 %含 0.5μg/L EB的琼脂糖凝胶
中电泳检测 ,紫外分光光度计测定其浓度和纯度(A260/A280).
1.4　PCR扩增
基础反应体系:dNTP 为 0.15 mmol/L ,随机引物 0.4μmol/L , Taq DNA 聚合酶 1.0 U , Mg 2+为 1.5
mmol/L ,模板 DNA为 80 ng ,扩增体系为 25μL.初始扩增程序:95 ℃预变性 7 min;94 ℃变性 1 min , 36 ℃退
火 1min;72 ℃延伸 2 min , 40个循环;72 ℃终延伸 7 min.在此基础上对模板浓度 、dNTP 浓度 、Taq DNA聚
合酶量等影响因素通过单因素和正交实验进行优化 ,扩增结果在浓度为 1.5 %含 0.5μg/L EB的琼脂糖凝
胶中电泳检测 ,用 UVI 凝胶成像系统扫描成像.
1.5　随机引物筛选
以优化条件对 200条随机引物进行筛选 ,选出扩增稳定多态性强的引物.
2　结果与分析
2.1　基因组 DNA 提取结果
提取的 DNA经琼脂糖凝胶电泳检测结果显示(见图 1):CTAB法和试剂盒提取均可得到较为完整的基
因组 DNA ,其中新鲜标本提取效果明显好于干燥标本 ,得率也较高.紫外分光光度计测定 A260/A280在 1.7 ～
1.8之间 ,表明纯度也较高.CTAB法提取产物量大 、成本略低 ,但耗时较长 ,且需要起始物质量也较大 ,操作
步骤也较试剂盒提取繁琐.采用试剂盒提取效率和得率均较理想 ,所需起始物质量仅 50 mg ,藓类植物大多
植株微小 ,有的难以大量获得 ,这一点对珍贵标本和难获得标本极为重要.笔者认为采用试剂盒提取 DNA
既能保证 DNA质量又有利于合理使用标本 ,不失为一理想选择.
　　泳道 1 , 3 , 5为标本 01所提 DNA;泳道 2 , 4 , 6为标本 02 所
提 DNA;1 , 2所用为新鲜标本;3～ 6所用均为干燥标本;1～ 4
为试剂盒法提取;5 , 6为 CTAB法提取.
图 1　DNA经琼脂糖凝胶电泳检测结果
　　泳道 1 , 2所用模板浓度为 50 ng;3 , 4为 100 ng;5 , 6为 200
ng;1 , 3 , 5模板为CTAB法提取;2 , 4 , 6为试剂盒法提取.
图 2　PCR 扩增结果
2.2　PCR反应体系
2.2.1　模板浓度
以标本 01干燥样品所提 DNA 为模板 ,采用基础体系对引物 S8进行 PCR扩增 ,扩增结果显示模板浓度
在 50 ～ 200 ng 之间均可扩增出主要条带 ,两种方法提取的 DNA 扩增结果相同.200 ng 浓度过高带型稍显弥
散模糊 ,50 ng 和 100 ng 扩增结果无显著差异(见图 2).模板浓度过高会使非特异性扩增增加 ,背景增加也不
利于观测统计.尽可能采用较低的模板浓度 ,一方面可以抑制非特异性扩增 ,另一方面也利于更有效利用标
本 DNA ,因此采用 50 ng DNA 作为模板.
2.2.2　dN TP浓度和酶量
dNTP 浓度和 Taq酶含量也是对 PCR反应影响较大的因素.笔者对不同 dN TP 浓度下的扩增结果进行
比较 ,发现其浓度过低或过高都会导致扩增效率降低 ,0.2 mmol/L 扩增效果较好(见图 3).不同酶量的结果
则反应出酶量加大扩增效率增高 ,但同时背景增加 ,因此应选择适量 ,最后在本研究体系中采用1.25 U 酶量
(见图 4).
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泳道 1～ 4dNT P浓度分别为 0.05 , 0.1 , 0.2 , 0.5mmol/ L.
图 3　不同 dNTP 浓度下的扩增结果
　　泳道 1～ 4所用 Taq酶量分别为 0.5 , 1.0 , 1.5 , 2.0 U.
图 4　不同酶量下的扩增结果
2.2.3　Mg2+和 dNTP 两因素正交实验
设计 Mg 2+和dNTP两因素正交实验 ,Mg 2+设 1.5 ,1.8 ,2.0 ,2.2 ,2.5mmol/ L 5个水平 , dNTP 设0.15 ,
0.2 ,0.25 mmol/L 3个水平 ,其中 2.0 mmol/L Mg2+与 0.2 mmol/L dNTP 组合扩增最好 ,带型稳定 ,条带清
晰 ,证实了单因素实验的结果(见图 5).
泳道 9为 2.0mmol/ L M g2+与 0.2 mmol/ L dNT P组合;11为空白对照;M 为 EcoR Ⅰ/ HindⅢ λDNA.
图 5　Mg2+/dNTP 两因素水平正交实验结果
2.2.4　最佳反应体系
经过优化所得最佳反应体系:dNTP 为 0.2 mmol/L ,随机引物 0.4μmol/L , Taq DNA 聚合酶 1.25 U ,
Mg2+为 2mmol/L ,模板 DNA 为50 ng ,扩增体系为25μL.扩增程序:95 ℃预变性7 min;94 ℃变性1 min ,36
℃退火1 min ,72 ℃延伸2min ,40个循环 ,72 ℃终延伸7 min.对多条引物的扩增结果确认该条件下可以获得
稳定的多态性图谱.
2.2.5　引物筛选
以标本 01 ,02 ,03基因组 DNA为模板 ,利用最佳反应体系对 200条引物进行筛选 ,筛选出 31条扩增稳
定 、多态性强可以用于构建真藓科分子指纹图谱的引物.图 6为部分引物对 02的扩增结果.
图 6　部分引物对标本 02 基因组 DNA 的扩增结果
3　讨　论
RAPD技术 ,即随机扩增多态性 DNA技术 ,又称任意引物 PCR.它的应用是基于这样的一个推理:对于
同一模板 DNA ,用同一引物扩增既可能得到相同的带谱(模板基因组间可能具有同源性),也可能得到不同
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的带谱.仅在某一特定模板中出现的条带就可作为该模板的分子标记.系统学是 RAPD研究最为迅速的领
域 ,许多作物都用 RAPD作过亲缘关系分析 ,大部分结果和形态分类结果相类似 ,仅有少数例外.因可操作
性强和成本低廉的原因一直受到广大研究者的青睐 ,被广泛应用.其反应稳定性受到众多因素的影响 ,但细
致的工作仍能得到具有高度重复性的结果 ,建立适用于不同实验室条件的反应体系尤为重要.在实验中更换
研究材料或者试剂都会带来变化 ,不同批次的试剂以及试剂的质量也会造成稳定性变化.因此 ,条件变化时
应当进一步优化体系 ,以确保扩增图谱的一致性和可信度.同时 ,扎实的预实验 、足够的重复和合理的对照也
能帮助研究者及时把握和检测体系的稳定性.
在对实验体系进行研究的同时笔者也对扩增程序进行了研究 ,发现不同型号 PCR仪因性能差别明显不
同 ,并无推广价值 ,提示研究者在从事试验时最好采用同一台仪器以保证成功率.筛选适当引物是构建分子
指纹图谱的首要任务 ,笔者在研究中筛选出的 31条富有高度多态性的引物为构建真藓科植物分子指纹图谱
提供了可靠保障.
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Establishment of RAPD Reaction System on Family Bryaceae(Musci)
ZHAO Jian-cheng1 , 　LI Wen-qiang1 , 　HUANG Shi-liang2 , 　LI Lin1
(1.College of Life S cience , Hebei Normal University , Hebei S hijiazhuang　050016 , China;
2.Department of Applied Technology , Hebei Women s Vocat ional College , Hebei Shijiazhuang　050091 , China)
Abstract:The molecular systematics of Bryaceae is a new focus on the study of moss.RAPD has been widely
used fo r molecular sy stemat ics , and it s an important technique in the field.The test w as designed to develop the
research of the molecular systematics of Bry aceae.The optimum RAPD reaction system w as obtained from the
single factor level experiment and orthogonal test.The results showed that the sui table program was one cycle at
94 ℃7min , 40 cycles at 94 ℃1 min ,36 ℃1min ,72 ℃2min and one cycle at 72 ℃7 min.In the RAPD sy stem
of Bryaceae the optional concentration of template DNA was 2 mg/L ,primer 0.4μmol/L , dNTP 0.2 mmol/L ,
Mg2+ 2 mmol/L , Taq DNA polymerase 1.25 U , total volum 25μL .On the basis of this 31 polymorphic primers
showing genetic differences among Bryaceae were screened from 200 random primers.The study built a solid
foundat ion fo r molecular sy stemat ics of Bryaceae.
Key words:Bryaceae;RAPD;molecular systematics;PCR (责任编辑　柴　键)
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