全 文 ：第 28卷　第 4期
　2010 年 12 月　 　 　
四川农业大学学报
Journa l of Sichuan Ag ricultural Univ ersity
　 　 Vol.28　No.4
Dec.2010
　　收稿日期:2009- 07- 25
基金项目:国家重点基础研究 973计划(2007CB108907);　国家自然科学基金项目(31072077)。
责任作者:张新全(E-mail:zhangxq@sicau.edu.cn)
doi:10.3969/ j.issn.1000-2650.2010.04.014
披碱草属物种 AFLP体系优化
陈仕勇 , 马　啸 , 齐晓芳 , 张新全
(四川农业大学动物科技学院 , 四川 雅安　625014)
摘要:试验对内切酶 EcoRⅠ和 MseⅠ的用量和酶切时间 、预扩和选扩过程中模板稀释倍数以及扩增引物浓度分别
进行了优化 ,并采用了 Bassam 法和 Sanguine tti银染法进行了比较分析。结果表明:采用 3U EcoRⅠ 和 MseⅠ 这两
种酶在 37 ℃下酶切 3 h , 预扩模板稀释 10 倍和 1.5 ng/μL 引物进行预扩 ,选扩模板稀释20 倍和 2 ng/μL 引物进行
选扩 ,采用 Bassam 法进行银染 ,能够得到较好的试验结果 , 为 AFLP 进一步在披碱草属中的应用提供了参考。
关键词:披碱草属;扩增片段长度多态性标记(AFLP);银染;体系优化
中图分类号:S543.024　　文献标志码:A　　文章编号:1000-2650(2010)04-0467-04
Optimization of AFLP in Elymus(Poaceae)
CHEN Shi-yong , MA Xiao , QI Xiao-f ang , ZHANG Xin-quan
(Colleg e of Animal Science and Technolog y , Sichuan Agricultural Univer sity , Yaan 625014 , Sichuan , China)
Abstract:The key factors affecting the AFLP analy sis in E lymus we re opt imized , including the
digesting time and the content of the EcoR Ⅰ and MseⅠ , di luted rat io and concentrations of prim-
ers in the pre-amplification and selective amplification.Furthermore , the me thods of Bassam and
Sanguinet ti silver staining w ere also compared in the staining quality .The optimal reaction sy stem
of AFLP w ere established , which including digest wi th 3 uni ts of each enzymes at 37 ℃ for 3 h ,
pre-amplification perfo rmed w ith templates diluted 10 t imes and 1.5 ng/μL primers , select ive am-
plification performed wi th templates diluted 20 times and 2 ng/μL primers , as w ell as stained wi th
Bassam silver staining .The results could apply fo r the fur ther study on A FLP in E lymus.
Key words:E lymus;AFLP;silver staining;optimiza tion
　　披碱草属(Elymus L.)是禾本科(Poaceae)小
麦族(T ri ticeae)一个重要的多年生属 。该属物种主
要分布于全球温带地区 , 中国包括了大约 12 个物
种 ,主要分布于华北 、西北及青藏高原地区[ 1] 。该属
中的很多物种都是优良的牧草资源 ,如老芒麦(E.
sibiricus L.), 垂穗披碱草(E.nutans Griseb.)
等[ 2] 。同时 ,很多物种还是草原和草甸的主要物种 ,
部分物种濒临灭绝 ,如短芒披碱草[ E .brev iarista-
tus(Keng)Keng f.] 、无芒披碱草[ E.submuticus
(Keng)Keng f.]等[ 3] 。该属物种在畜牧业生产及
生态建设中发挥了重要作用 ,具有非常重要的经济
效益和生态效益 。
扩增片段长度多态性标记(Amplified fragment
length polymorphism ,AFLP)是 1993年由荷兰科学家
Zabeau和 Vos发展起来的一种分子多态性检测方
法[ 4] 。它具有多态性高 ,检测效率高 ,重复性好等优
点 ,是一种较为理想的标记 ,目前在种质资源评价 、
遗传连锁图谱的构建等方面得到了很好地运用[ 5-6] 。
虽然目前荧光 AFLP 在应用中体现出了高多态性
及稳定性[ 7] ,但是由于仪器 、成本等条件限制 ,银染
方法仍然是目前常用的方法 。本研究拟在前人的基
础上对披碱草属 AFLP 标记及银染体系进行优化 ,
使其能够快速 、经济 ,为该标记更好地在该属物种的
遗传评价及系统分类研究中应用提供参考 。
　　　 四川农业大学学报 第 28卷
1　材料和方法
1.1　供试材料
试验选用披碱草(E.dahuricus Turcz.)和垂穗
披碱草(E.nutans Griseb.)材料各 2 份 ,材料来源
详见表 1。
表 1　供试材料
Table 1　The materials used in the study
种质编号
Accession No. 种名Species 来源地Orig in
P I 639852 Elymus dahuricus Turcz.甘肃夏河　　　
P I 499612 Elymus dahuricus Turcz.青海西宁　　　
Y0672 Elymus nutans Griseb. 新疆塔什库尔干
Y0685 Elymus nutans Griseb. 新疆塔什库尔干
1.2　AFLP分析
1.2.1　DNA提取及检测
试验采用 CTA B法提取样品的 DNA[ 8] , 0.8%
的琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计上检测其浓度
和纯度。
1.2.2　酶切
试验采用 EcoR Ⅰ和 Mse Ⅰ在 37 ℃下进行双酶
切。酶切体系 20 μL :4 μL DNA (50 ng/μL), 2μL
10×Buffer Tango , ddH2O 补齐。酶量设置 2 U 、3
U 、4 U (5 U/μL),酶切时间设置为 3 、4.5 、6 h进行
比较 。酶切产物在 1%琼脂糖凝胶中检测 。
1.2.3　连接
连接体系为 30μL:20μL 酶切液 , 0.2μL(5 U/
μL)T4 连接酶 , EcoR Ⅰ接头 1 μL (5 pmol/μL),
MseⅠ接头 1 μL (50 pmo l/μL),3 μL 10×Ligation
Buffer ,ddH 2O 补齐 。连接程序为 37 ℃ 1 h ,65 ℃
灭活 10 min 。连接产物在 1%琼脂糖凝胶中检测。
1.2.4　预扩增
预扩体系 20 μL:稀释模板 5 μL , Taq 酶 0.4
μL (2.5 U/μL), 10 μL PCR 混合液(500 μmol/ L
dN TP each , 20 mmo l/L Tris-HCl , 100 mmol/ L
KC l , 3 mmol/L M gCl2), ddH2O 补齐 。引物用量设
置为 20 、30 、40 ng (50 ng/μL),酶切连接产物稀释
倍数设置为 1∶1 、1∶5 、1∶10。扩增程序:94 ℃30
s ,56 ℃ 1 min , 72 ℃1 min , 24 个循环。预扩产物
在 1%琼脂糖凝胶中检测。
1.2.5　选择性扩增
选扩体系 20 μL:稀释模板 5 μL , Taq 酶 0.4
μL (2.5 U/μL), 10 μL PCR混合液(组分同上),
ddH2O补齐。引物用量设置为 20 、30 、40 ng (50
ng/μL),预扩产物稀释倍数设置为 1∶10和 1∶20 。
扩增程序:94 ℃ 30 s , 65 ℃30 s(每个循环降 0.7
℃),72 ℃ 1 min , 13 个循环;94 ℃ 30 s , 56 ℃ 1
min ,72 ℃1 min , 23个循环 。选扩产物在 1%琼脂
糖凝胶中检测。所有 PCR反应均在 PTC-200 PCR
仪上进行(以上生化试剂和引物分别购自北京天根
生化公司和上海生工)。
1.2.6　电泳及银染
选扩产物采用 6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分
离 ,80 W电泳 2 h ,同时分别采用 Bassam 法和 San-
guinet ti银染法进行比较分析[ 9-10] 。
2　结果与分析
2.1　双酶切结果
试验对供试材料 DNA 的酶切进行了酶量和酶
切时间的优化。在 20 μL 体系中 ,不同酶量进行酶
切后电泳检测的效果相当 ,但 2 U 酶量相对较小 ,
酶切可能不充分;酶量为 3 U 和 4 U 时 ,酶切相对
充分 ,片段大小集中在 200 ～ 2 000 bp ,且呈弥散态
(图 1)。本试验最后选择 3 U 量进行双酶切。在 3
U酶量条件下不同酶切时间处理的电泳检测效果
差别不大 ,本研究选用进行 3 h双酶切(图 2)。
　　1 ～ 2:2 U;3 ～ 4:3 U;5 ～ 6:4 U;1 , 3 , 5:
P I639853;2 , 4 , 6:Y0685.
图 1　不同酶量酶切结果
Figure 1　Results of digest of different amount of enzymes
　　1 ～ 2:3 h;3 ～ 4:4.5 h;5 ～ 6:6 h;1 , 3 , 5:
P I639853;2 , 4 , 6:Y0685.
图 2　不同酶切时间结果
Figure 2　Results of digest of different times
468
第 4 期 陈仕勇(等):披碱草属物种 AFLP 体系优化 　　　
2.2　预扩增结果
预扩增分别进行连接产物稀释倍数及引物浓度
的优化。当连接产物的稀释倍数为 1∶10 、1∶5 、1
∶1时 ,扩增结果检测相当 。为获得相对清晰的选
扩结果 ,选择稀释倍数高的 1∶10进行稀释(图 3)。
在20 μL 体系中 ,引物量为 20 ng 和30 ng 时预扩片
段大小合适 ,均在1 500 bp 以下 ,条带集中在500 bp
左右(图 4)。但二者的预扩产物在选扩检测中 , 30
ng 的扩增效果明显好于 20 ng(图 5)。
　　1～ 2:1 ∶10;3 ～ 4:1 ∶5;5 ～ 6:1∶1;1 , 3 , 5:
PI639853;2 , 4 , 6:Y0685.
图 3　不同稀释倍数的预扩结果
Figure 3　Results of pre-amplification of
templates with dif ferent diluted times
　　1～ 2:1 ng/μL;3 ～ 4:1.5 ng/μL;5～ 6:2 ng/μL;
1 , 3 , 5:PI639853;2 , 4 , 6:Y0685.
图 4　模板稀释 10 倍不同引物浓度的预扩结果
Figure 4　Results of pre-amplification of different
concentrates of primers with templates diluted 10 times
2.3　选择性扩增结果
选择性扩增也进行了预扩产物稀释倍数及引物
浓度的优化 。在 20μL 体系中 ,当引物为 40 ng 时 ,
选择性扩增条带较清晰明显(图 5)。预扩产物分别
稀释 10倍和 20倍进行选扩 ,琼脂糖电泳检测其扩
增的效果相当 ,选择性扩增的片段均集中在 100 ～
1000 bp之间 ,符合 AFLP 分析的要求 ,但稀释 20
倍的模板扩增出的条带稍清晰(图 6)。
　　1:1 ng/μL+1 ng/μL;2:1 ng/μL +1.5 ng/μL;
3:1 ng/μL+2 ng/μL;4:1.5 ng/μL+1 ng/μL;5:1.5
ng/μL+1.5 ng/μL;6:1.5 ng/μL+2 ng/μL.
图 5　预扩和选扩中不同引物浓度组合对
Y0685 的选扩结果(E-AAC/M-CAC)
Figure 5　Results of pre-and selective amplification with
different concentrate combinations of primers for Y0685
(E-AAC/M-CAC)
　　1 ～ 4:1∶10;5 ～ 8:1∶20.
图 6　引物组合 E-AGC, E-AGG, E-ACA , E-AAC/M-CAC
分别对 Y0685不同稀释倍数预扩模板的选扩结果
Figure 6　Results of select ive amplification of different
dilute times of pre-amplification templates with primer pairs
E-AGC, E-AGG, E-ACA , E-AAC/M-CAC for Y0685
2.4　银染比较分析
试验比较了两种银染方法 , Bassam法所需时间
较长 ,银染后背景较浅 ,条带对比明显 ,长期保存效
果不变(图 7)。Sanguinet ti法所需时间短 ,操作过
程简单 ,但是银染后的胶板背景颜色较深呈黄色 ,条
带对比不明显 ,而且不宜长期保存 ,长时间存放后条
带变得较浅 。在本试验中 Bassam 法效果较好 ,可
以在试验中采用。
3　讨论
AFLP 试验技术的影响因素很多 ,除了应具备
高质量的模板 DNA 外 ,模板 DNA 的双酶切 、酶切
片段扩增及扩增结果的电泳分离等几个环节都直接
影响着试验的结果 。
目前 AFLP 双酶切试验中常用的是 EcoR Ⅰ和
MseⅠ两种限制性内切酶 。其中酶切时间和酶的用
469
　　　 四川农业大学学报 第 28卷
　　1:PI639853;2:Y0672;3:P I499412;4:Y0685.
图 7　E-AGC, E-AGG, E-ACA/M-CAC引物组合对
4 份供试材料选扩的 Bassam法银染结果
Figure 7　Results of Bassam silver staining of
selective amplif ication with E-AGC , E-AGG,
E-ACA/M-CAC for four materials
量是最重要的参数。一般两种内切酶的总量不超过
酶切体积的 1/10[ 11] 。在本研究中 , EcoR Ⅰ和 Mse
Ⅰ的量总和为 1.2 μL 低于酶切总体积的 1/10 ,且
酶切效果较好。同时 ,酶切时间过长或过短都会影
响试验结果 ,过长导致酶切过量 ,酶切片段太小而影
响连接过程。如果酶切时间过短则会导致酶切不充
分 ,会影响样品的一致性以及 PCR扩增的多态性
等。在本研究中在 3 U 酶量条件下不同酶切时间
处理的琼脂糖电泳效果差别不大 ,本研究选用 3 小
时酶切 ,结果表明了该处理的效果较好 。
AFLP 标记对扩增模板的浓度不很敏感 ,少数
的模板量也可以扩增出清晰的结果[ 12] 。本研究中
采用了 100 ng 的模板 DNA 量也得到了较好的结
果。同时 ,在本研究中不同稀释倍数模板的扩增产
物在琼脂糖上的检查效果大致相当 ,但在进一步的
扩增中如果稀释倍数过小会导致电泳条带的模糊不
清。
电泳和银染都直接影响最后 AFLP 图谱质量 。
凝胶制备中凝胶质量取决于尿素质量 ,如果质量不
好易产生拖尾 ,条带不清楚较模糊 。电泳中胶板最
好保持适当温度 ,点样前需要进行预电泳使胶板温
度升高。电泳的电压太高会导致散热不均引起条带
弯曲 ,而电压太低会增加电泳时间 ,条带易扩散。本
研究采用 80 W 恒功率进行电泳较稳定。目前 ,
Bassam 法和 S anguinet ti银染法是常用的两种银染
方法 ,两种方法在不同物种的多种标记中也进行过
比较分析 ,效果因不同标记类型而异 ,同时也可能与
实验人员对方法的掌握改进及经验等有关[ 13-14] 。但
是 Bassam 法在 AFLP 中应用较多 ,其要点的是染
色后的漂洗时间要恰当(一般 5 ～ 10 s),时间太短则
显影背景太深 ,时间太长则银离子被洗去 ,显影的条
带较浅 。显影时 ,显影液须预冷 ,这样可以降低显色
的速度 ,使染色更加均一。
参考文献:
[ 1] 　郭本兆.中国植物志:第 9卷 3分册[ M] .北京:科学出版
社 , 1987:6-15.
[ 2] 　王世金 , 李健华.小麦族植物作为牧草种质资源的初步评价
[ J] .草业学报 , 1993 , 2(1):60-79.
[ 3] 　国家林业局 , 农业部.国家重点保护野生植物名录:第一批
[ J] .植物杂志 , 1999(05):4-11.
[ 4] 　Vos P , Hogers R , Bleeker M , et al.AF LP:A new tech-
nique for DNA f ingerprint ing [ J] .Nucleic Acids Research ,
1995 , 23(21):4407-4414.
[ 5] 　Muyl le H , Baert J , Bockstaele Van E , et al.Iden tif icat ion of
molecular markers linked w ith crow n rus t(Puccinia coronata
f.sp.lo li i)resi stan ce in perennial ryeg rass(Lol ium perenne)
usin g AFLP m ark ers and a bulked segregant approach [ J] .
Euphy tica , 2005 , 143:135-144.
[ 6] 　彭燕 , 张新全 , 刘金平 , 等.野生鸭茅种质遗传多样性的
AFLP分析[ J] .遗传 , 2006 , 28(7):845-850.
[ 7] 　赵翀 , 刘法央 , 郭玉霞 , 等.AFLP 荧光标记和银染技术的比
较分析[ J] .甘肃农业大学学报 , 2007 , 42(2):125-129.
[ 8] 　Doyle J J.DNA protocols fo r plants– CTAB total DNA is o-
lati on [ M ] // Hewi tt G M , John ston A.Molecular tech-
niques in taxonomy.Berlin:Springer-Verlag , 1991:283-
293.
[ 9] 　Bassam B J , Caetano-Anollé s G , Gressh off P M.Fast and
sensi ti ve silver s taining of DNA in polyacry lamide gels [ J] .
Anal Biochem , 1991 , 196:81-84.
[ 10] 　Sanguin et ti C J , Dias Neto E , S impson A J.Rapid silver stai-
ning and recovery of PCR p roducts separated on polyacry lam-
ide gels [ J] .Biotechniques , 1994 , 17(5):914-921.
[ 11] 　萨姆布鲁克 J , 弗里奇 E F , 曼尼阿蒂斯 T .分子克隆实验指
南[ M] .金冬雁 , 黎孟枫 , 译.2 版.北京:科学出版社 ,
1992:262.
[ 12] 　刘秀菊 , 任俊云, 宗绪晓 , 等.蚕豆 AFLP 技术体系的建立
与优化[ J] .植物遗传资源学报 , 2007 , 8(2):153-158.
[ 13] 　关海涛 , 徐世昌 , 郭玉华.两种聚丙烯酰胺银染方法的比较
[ J] .沈阳农业大学学报 , 2006 , 37(1):86-87.
[ 14] 　任民 , 贾兴华 , 蒋彩虹 , 等.Bas sam 和 S an guinett i银染方法
在 SRAP 和 T RAP 标记中的比较研究[ J] .生物技术通报
2008(1):113-116 , 121.
(本文审稿:周永红;责任编辑:秦碧雯;英文编辑:刘益平)
470