全 文 ：鉴别
阳春砂与几种常见姜科伪充品的 R A P D 分析
广州中医药大学 ( 51 04 0 5 )
王培训 黄 丰 周 联 曹柳英 梁瑞燕 徐鸿华 刘军民
摘要 本文采用随机扩增多态 DNA (凡钾D )技术研究了姜科植物几种常见的中药材 。 结果显示 ,
扩增结果具有良好的分辨性 。 阳春砂与海南砂 、 绿壳砂 、缩砂 、草果 、 益智仁 、 白豆翘 、 草豆翘等常见的姜
科近缘伪充品之间呈现明显指纹差异 , 呈现多态性的引物占所选的 12 . 17 % ,根据这些多态性可进行鉴
别 。 不同产地的阳春砂 凡钾D 指纹基本一致 。 用 NJ 方法构建了分子系统树 , 揭示阳春砂与绿壳砂 、海
南砂亲缘关系较近 , 而与草豆范 、草果等关系较远 ,此结果与传统的分类方法基本一致 。
关键词 阳春砂 RA P D
本文运用 RA p D 方法对阳春砂及其常见的 肠 q 酶 、 随 机 引 物 ( 上 海 s an go ) , 琼 脂 糖
姜科植物伪充品进行了鉴别分析 ,并根据各样 ( P~ ega )
,其余试剂均为国声分析纯 。
品的多态性关系用 NJ 方法分别构建了分子 系 1 . 3 主要仪 器 低温 高速离心机 ( eB e k rn an
统树 ,推测各样 品的遗传关系 。 GS 一巧 R ) ; 紫外 / 可 见 光分 光 度计 ( hP ~ ac ia
1 材料和方法 4 0( 刃 ) ;凝胶成像仪 ( UV P GD s7 日X )G ) ;低温恒温
1
.
1 材料 见表 1。 式电泳仪 ( L KB ) ;P C R 仪 (PE 24X() ) 。
1
.
2 试剂 irT s( B . M . ) , SD (S eS vr a) , M ar ke r (本 1 . 4 D NA 提取 称取 0 . 3 9 各 中药 材样 品的
文所用 Makr er 均为加拿大 M BI 的 10 帅 ND A 玻璃砂研磨 ,采用我们改进 的高盐 、 低 pH 法〔’ 〕
I a 司d e : lP u s ,从上至下为 3《X旧 , 2仪X〕 , 150 , 120 , 获得总 DN A o
10 3 1
,
90
,
80
,
70 刀叉〕, 5的 , 4加 , 3X() , 20 , 10 ) , 1 . 5 DN A扩 增 反 应体积 为 2 5 拌l 。 其成分
表 , 各样品基质 、收集时间及样品纯度
样品 收集时间 比值( A溯 / A卿 )
31951以270
巧68田23
1
. 春砂仁 (广东佛冈 ) J如叨加咖 沉Z肠3um 肠ur .
2
. 春砂仁 (广东潘龙 ) J七叨爪 2叨 2 玩 l如 , 助 ur .
3
. 春砂仁 (广州中医药大学药圃功功。胭翻 诉 Z如 s , 肠 ur .
4
. 春砂仁 (云南文山 )注砌功理绷 司如 , 肠叮 .
5
. 春砂仁 (广东广宁冲砌胭抓 访之如 s , 助 ur .
6
.春砂仁 (广西防城川功。阴习爪 1滋如 , 助 u r .
7
. 春砂仁 (广东阳春 )注 m o m之抓 乞应如 , 肠 t甘 .
8
. 绿壳砂 (广东广宁冲砌 m王抓 之成扮创训 助 n u . v ar . %。瓜八如山 T . L . Wu et eS nj e
9
. 缩砂 (云南省药品检验所 )由朋翻如 为田吐九如泛d朗 W al .
10
. 海南壳砂仁 (海南海 口 ) J如叨加训 如呼之钾欢此 T . L . Wu .
1
. 海南土砂 (海南海 口 )击朋 m之如 c h i爬出 15 Ch un xe T . L . W l l .
12
. 牛枯缩砂 (广东阳春 ) A爪。爪 um n u『记 。甲 , Eln l
13
. 草果 (广州市药材公司 )注用。~
st
, 肋 C犯 v o s t e t玩~14 . 益智仁 (广州市药材公司 )脚 i俪 叫向 Z如 死 q .
巧 . 爪哇白豆范 (海南屯昌 ) J七叨功翻 c。林户冗 unt 洲 adn xe Maont
16
. 泰国白豆范 (泰国 )击肋洲朋 拓叹诩 hn 巧 e er xe G昭 e l l p
17
. 草豆范 (云南德宏芒市 )柳 ihaz 肋鹅理训瓜俪 Hay at a
9 8一 3
97 一 1 1
92一 9
98一 5
96一 9
98一 8
9 8一 8
9 8一 9
9 6一 5
9 8一 8
9 8一 4
9 7一 5
9
一 3
9
一 3
98一 4
98一 5
97
一 4
中药材第 23 卷第 2期 2X( X) 年 2月
DOI : 10. 13863 /j . i ssn1001 -4454. 2000. 02. 011
为 :M 薛犯 2 .5川 (5 2U no FL ), 引物 2 川( 5 拌mo F
L )
,
B SA I 风 ( 25 岁 L ) , 4 种 d人T p 0 . 25 沁
( l X()
mo
F L )
,
10 x b u fe
r 缓 冲液 2 . 5 风 (无
M g
+ +
)
,
2
.
0 U aT q 酶 , 50 gn 样品 。 循环参数为
94 ℃ , 3 而 n ; 94 ℃ , l 而n ; 3 9℃ , 4 5 5 ; 7 2 ℃ , 60 5 ;
35 个循环 。 7 2℃ , 3 ~ 。
1
.
6 扩增产物检侧 取扩 增 产物 10 川; 于
1
.
5%琼脂糖凝胶上 用 1 x TA E 电泳缓冲液电
泳 ,用 E B 染色 3 0 而 n 于凝胶成像仪上进行分
析 。
1
.
7 数据分析 电泳图谱中每 一条带代表一
个引物结合位点 , 根据分子迁移率及其有无进
行统计 : 有带计为 1 , 无带计为 0 。 任意两个样
本间的遗传差异用遗传距离指数 D 衡量 。
F = Z N x y/ Nx 十 哑 D = 1一 F 为共享度 , N x 、
N y 分别为第 x 和 y 个体拥有 的 凡钾 D 标记数 ,
Nxy 为 x 和 y 个 体共享 (所有 引物 所得 ) 的
RAp D 标记数 。 采 用 hP iln 3 . 5 软件包 的 NJ
(N ie gh l刃 r 一oJ iin g )软件进行分析 ,建立种系发生
图 。
2 结果
2
.
1 P C R 扩增 结果及 RA P D 标记 在本研究
中 ,所用样 品均为原产地干 品 , 所得 DN A 纯度
大多较低 (见表 1 ) , 但经过稀释等处理后并 不
影响反应的进行图 。 本实验所得 DN A 指纹图
多态性有以下几个特征 : ( 1) 各地产阳春砂的指
纹图基本一致 (图 I A ) 。 ( 2 )在部分引物的扩增
’ 下 , 阳春砂与其他样品呈现出不同的指纹图 (图
2 )
。 在所采 用的 1巧 个 引物中 , 能在阳春砂及
其常见伪充品之间呈现多态性 、条带清晰 、 重复
性好的引物为 14 个 , 占 12 . 17 % 。 表 2 列 出了
这 14 个引物 , 由之此生成的指纹图标记的分子
量大多在 30 一 2 (XX〕坤 范 围 内 。 14 个引 物共
获得 108 个 片 断 , 产 生 多 态 的 有 69 个 占
63
.
89 %
。 从以上分析结果可看出 , 凡锣D 技术
显 示了 良好的分辨率 , 所选引物能将阳春砂与
常见的伪 冒品区分开 , 阳春砂及其常见 的伪充
品各 自均表现 出其独特的 凡密 D 标记 。 另外 ,
我们发现 ,来自广东潘龙 、我校药圃及广东广宁
的三个样品在少数引物的扩增下与其他产地的
.
72
图 1 不同产地阳春砂的指纹图
A
. 引物 5 12 ACA CGT GC GT
B
. 引物 53 0 CT C AT CCCA C
1
. 广东佛冈 2 . 广东潘龙 3 . 广州中医药大学药圃
4
. 云南文山 5 . 广东广宁 6 . 几西 防城 7 . 广东阳
春 8 . M akr e r
图 2 阳春砂及其常见伪充品的指纹图
1
. 春阳仁 (云南文山 ) 2 . 春砂仁 (广西 防城 ) 3 . 春
砂仁 (广东阳春 ) 4 . 绿壳砂 5 . 缩砂 6 . 海南壳砂
仁 7 . 海南土砂 8 . 牛枯 缩砂 9 . M ar ker 10 . 草果
1 益智仁 12 . 爪哇 白豆笼 13 . 泰 国白豆范 14 .
草豆范 引物 53 7 GCA CC C n U T
阳春砂之间呈现 了一定的多态性 (图 lB ) 。 曾
有报道指 出 ,不 同产地 的阳春砂其主要化学成
分含量有一定差别闭 , 这些差 别是否 由于 基因
的改变而致 ,有待进一步研究 。
2
.
2 多态性的遗传分析 按 1 . 7 中的公式进
行了计算 。 由于不 同产地的 阳春砂 所得 DNA
指纹图基本一致 ,故以 7 号样 品 (广东阳春 )为
阳春砂的代表 ,和其他 1 个样品间的遗传距离
进行计算 ,结果见表 3 。
从 聚类图 中可看 出 , 阳春砂 ( 7号 )与绿壳
中药材第 23 卷第 2 期 2 (XX) 年 2 月
表 2
引物
引物序列其 PCR 扩增结果 0
.
14 1 1 8
14 益知仁
扩增带型数 多态性带数 序列
R 面 er 阮 ( 】u e n e e 阳春砂
田 0
日7
日 8
翎
发m
发以
s 207
别叭
别 50
豁76
51 0
51 2
513
肠 55
N u n让祀 r of N u l t止吧 r of
翻 P断d e ba nds 州扣拍币 hi el纽1( 1 5
7 5
13 11
13 1 2
9 6
7 8
7 3
7 3
6 3
7 5
53
7 2
7 3
6 3
6 3
C T T C G AC G AC
C ACC C G门兀汀
T A GG G ACC GT
T GC CCC GT C了、
,
C GA GA G气CT C
C 八C z、G AG CG A
C CCA CCC 陀 T
1℃G Dg CG (G 二T
r浅A GA C CC CC
CCA AGC 代芜 C
C T AG C CGI℃T
A〔:A GGT G CG I ,
C G z、CGA CA AG
A GC C AG CCCA
8
. 绿壳砂
海南壳砂仁
海南土砂
牛枯缩砂
17
. 草豆范
总数 oT 以
表 3
108 69 l 4
图 3 聚类图
根据 几钾D 分析的数据 , 用 NJ 法得到 系统树 ,遗传距离
(各样品到上一进化分支点 的距离 )标注在每一分枝上
1 个样本间的遗传距离 ( D )
7 8 9 10 1 1 12 13 14 1 5 1 6 17
7
8 0
. 《巧32
9 0
.
1980 0
.
2 103
10 0
.
07 69 0
.伪 19 0 . 20 《 )
11 0
.
4 74 9 0
.
4 743 0
.
46 3 7 0
.
47 49
12 0
.
4505 0
.
5X( X) 0
.
48 94 0
.
4 225 0
.
2以巧
13 0
,
4 05 1 0
.
4 135 0
.
4 1 12 0
,
427 2 0
.
35 83 0
.
42 86
14 0
.
4 17 1 0
.
42 86 0
.
4 1 58 0
.
32 34 0
,
4 19 0 0
.
34 39 0
,
33科
1 5 0
.
505 5 0
.
42 1 1 0
.
4 39 0
.
4839 0
.
4 25 1 0
.
375 7 0
.
3333 0
.
3伪5
16 0
.
5伪 8 0 . 437 8 0 . 4 196 0 . 3394 0 . 4 356 0 . 38 10 0 . 32 14 0 . 3 103 0 . 3589
17 0
.
548 7 0
.
5X( X) 0
.
47 2 6 0
.
3568 0
.
4 828 0
. 如86 0 . 35以 0 . 3 810 0 . 37 30 0 . 387 4 0 . 饭刀的
砂 ( 8 号 )首先 聚在一起 , 二者 的外观及 间呈 现
了一定形态也非常类似 ,从形态学和遗传学的
角度来看皆说明二者亲缘关系最近 。 阳春砂 ( 7
号 )与海南壳砂仁 ( 10 号 )及缩砂 ( 9 号 )亲缘关
系也较近 ,而阳春砂与草豆范 ( 17 号 ) 、 草果 ( 13
号 )及泰国白豆落 ( 16 号 )之 间亲缘关系较远 。
两个海南砂 ( 1 1 、 12 号 )聚在一起且 与阳春砂 ( 7
号 )的亲缘关系近于益智仁 ( 14 号 )及爪哇 白豆
落( 巧 号 ) 。 以上结果 与形态学 的方法 基本一
致。
中药材第 23 卷第 2 期 2〕沉) 年 2 月
注 : 本研究为 国家中医药管理局科研基金 ( 95 0 37 9) 及广东
省自然科学基金资助课题
参 考 文 献
1 王培训 ,等 . 植物中药材总 DN A 提取方法的 比较 .
中药新药与临床药理 , 19 9 , ( 1 ) : 17
2 王培训 ,等 . 凡钾D 在商品中药鉴别中若干问题的探
讨 . 中药新药与临床药理 , 19 9 , (2) : 113
3 广州中医药大学 中药资源研究室 . 中药资源开发
利用研究论文集 . 广州 :广东科技出版社 , 19 6
( 19 9
一 1 1 一 0 1 收稿 )
·
73
A刀 al yis of A川刃 m un v i如 s um s户改 i se a n d 剐叨 e
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几吧 e pr ir snt hw ile it 15 ovib o us ly 山晚 r 云。 n l ad ul et r a n st . hT e o aer 12 . 17 pe cer nt of p n l l l e sr ihw hc a ppe ar 间 , 旧。甲比m . We c an
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s h o w 呀 山价化nt elr iat ons hi ps 玩Vt 陀e n A川。洲训 ” 汉如um 助ur . s户戈ies 田l d het ir ad td t e r田 l t s ,
仆e 慨己 t c re at 司 协 印丘w ar e is 田 1日」丈〕即us the 加id it o几目 m e d led s .
K e y w or ds A侧洲朋 `讼娜 , ; 几钾 D ; DNA
高山大戟的生药鉴定
解放军北京军 医学院 ( 10( 刃 7 1 ) 赵奎君 杨 隽
摘要 报道高山大戟 召砚切声切动记 st raC瓜州的生药性状 、 根横切面组织构造和粉末特征 、薄层色谱鉴别
研究结果 。 文中附有生药组织构造图 、 粉末特征图及薄层色谱图 。
关键词 高山大戟 组织构造 粉末特征 薄层色谱
高 山大戟 ,又名搜 山虎 、一把香 , 为大戟科
植物高山大戟 E叩彻 r乙ia st arC 入那坛 oB is . 的干燥
根 ,在滇西北地区使用 ,有较好的止血 、 止痛 、生
肌的功效 , 用于 胃痛 、 跌打损伤 、疮疖及外伤出
血等症 〔’ 〕。 为配合该药的开发应用及质量标准
制定 , 我们对其进行了生药鉴定研究 。
1 实验材料
高山大戟 E 王切方习 br at 对 r配瓜协 oB is s . 采 自云
南丽江 ,并经笔者鉴定 。
2 药材性状
块根纺锤形或圆锥形 , 长 7 一 巧 Cm , 直径 2
一 6 c m 。 外皮黑褐色 ,具纵皱纹 , 中上部具细密
环纹 。 质轻 ,断面黄 白色 , 粉质 ,具大理石 样纹
理 。 气微臭 ,味微苦 。
3 显微鉴别
3
.
1 根 (直径 1 . 3 。 m )横切面 木栓层 4 一 20
列木栓细胞 , 呈扁平长方形 。 皮层 4 一 18 列薄
壁细胞 ,其中偶有厚壁细胞散在 ;另有乳汁管轴
向分布 。 韧皮部束呈三角形 , 筛管明显 ;其间亦
有乳汁管 。 形成层环波状 , 束间形成层常只分
生韧皮部束 。 木质部导管呈密集径 向排列 , 每
,
74
.
列导管 巧 一 45 个 ,有 的两列导 管在 内侧聚成 1
列 ,导管长径 23 一 75 脚 , 短径 17 一 59 拼m ;薄壁
细胞为木质部的主要部分 。 木内异型维管束散
在 ,其形成层 呈类圆形 至长 圆形 , 内侧 为韧皮
部 ,外侧为木质部 , 异型维管束的维管系统不发
达 ,形成层主要 分生大量薄壁细胞 。 木纤维 成
束或散在 , 分布在木质部 内侧 的薄壁组织 中及
导管旁 。 纤维 直径 n 一 24 拌m , 壁较 薄 , 非 木
化 。 薄壁细胞中含淀粉粒 。 (图 1、 2)
3
.
2 粉末 ( l) 木纤维细长 ,有的呈扭曲状 , 末·
端渐尖 , 斜尖或钝 圆 , 长约至 2 . 5 拌m ,直径 9 -
23 脚 ,壁厚 2 一 8补m ,非木化 ,胞腔狭小或较大 ,
纹孔及孔沟不明显 。 ( 2 )厚壁细胞偶见 ,呈长方
形 、长 圆形或长多角形 ,有 的一端平截 ,长 46 -
1印 四 , 直径 26 一 80 拼m ,纹孔及孔沟稀疏 ,层纹
不明显 。 ( 3) 导管主为梯纹及 网纹导管 ,偶见梯
状具缘纹孔导管 ,直径 12 一 27 样m ,导管分子较
短 。 (4) 淀粉粒单粒类 圆形 , 稀卵形 , 直径 5 -
38 哪 , 脐点点状 、裂缝状 、三叉状或星状 ,层纹
不明显 。 复粒较多 , 由 2 一 8 分粒组成 。 半复粒
稀少 。 ( 5 )无节乳汁管较少 ,直径 43 一 71 脚 ,壁
中药材第 23 卷第 2期 2侧叉)年 2 月