全 文 ：文章编号: 1001-5280( 2001) 04-0048-04
AFLP分子标记及其在禾本科
作物遗传改良中的应用
伍春莲 ,孙　敏 ,王　颖 ,汪　洪
(西南师范大学 生命科学学院 ,重庆 , 400715)
摘　要: AFLP是一种最新发展起来的 DN A分子标记技术。它将 RFLP和 PCR相结合 ,能更好地
检测 DN A的多态性 ,被认为是迄今为止最有效的分子标记技术。禾本科作物与人类的生存和生活
密切相关 ,对其在 DN A水平上的研究具有重要的理论和实践意义。 本文就 AFLP的基本原理、基
本反应程序作一简要介绍 ,并着重论述 AFLP在禾本科作物遗传改良中的应用。
关键词: AFLP; 分子标记 ; 禾本科 ; 作物 ; 遗传改良
中图分类号: Q789　　文献标识码: A
　　禾本科 ( Gramineae, Poaceae )植物是种子
植物中的一个大科。它不仅有保持水土、绿化
环境的作用 ,而且具有重要的经济价值。其中
的水稻、小麦、大麦、玉米、高粱等作物在我国广
为栽培 ,是人类粮食的主要来源 ,同时也为工业
提供了丰富的原材料 [1]。
自 1980年 Bostein和 White等利用 RFLP
( Restriction Fragment Length Polymorphism ,
限制性片段长度多态性 )构建人类遗传连锁图
奠定分子标记研究的基础以来 ,分子标记技术
已走过了 20多年的历程 ,先后出现了 10余种
DN A分子标记技术。近年来 , RFLP, RAPD
( Random Amplified polymorphic DNA,随机扩
增多态性 DN A) , STS( Sequence Tagg ed Site,测
序的标记位点 )等 DN A分子标记已广泛应用
于禾本科作物的研究中 ,并取得了一些重要的
成果。 AFLP是在 RFLP和 RAPD的基础上发
展起来的 ,既具有 RFLP的可靠性 ,又具有
RAPD的方便性 [2, 3] ,被认为是迄今为止最有效
的分子标记。本文就 AFLP的基本原理、基本
反应程序以及在禾本科作物遗传改良中的应用
作一简要概述。
　　收稿日期: 2001-06-04
第一作者: 伍春莲 ( 1976-) ,女 ,四川彭州人 ,在
读硕士研究生。
1　AFLP技术的发展及其基本原理
AFLP ( Amplified Fragmen t Length Poly-
morphism,扩增片段长度多态性 )是 1993年由
Zebeau等发展起来的一种新的 DN A分子标记
技术 [ 2 ] ,并获欧洲专利局专利 [3 ]。 AFLP是 RFLP
与 PCR( Polymerase Chai n Reaction,聚合酶链式
反应 )相结合的一种技术 ,它具有 DNA用量少 ,
效率和分辨率高 ,可靠性好等优点。
AFLP的基本原理是对基因组 DNA限制性
酶切片段进行选择性扩增。具体操作为基因组
DNA经限制性内切酶双酶切后 ,形成分子量大
小不等的限制性片段 ,再将双链人工接头 ( artifi-
cial adapter)连接在这些 DNA片段的两端 ,形成
一个带接头的特异片段 ,并作为扩增反应的模
板。专用引物的结合部位是接头以及与之相连的
酶切片段中的几个碱基序列。专用引物由与人工
接头互补的核心碱基序列、限制性内切酶识别序
列和引物 3’端的选择碱基三部分组成。 这样就
只有那些两端序列能与碱基配对的限制性酶切
片段被扩增 ,扩增片段经过聚丙烯酰胺凝胶电泳
分离检测。
由于接头和引物是人工合成的 ,所以在不需
要事先知道 DNA序列信息的前提下 ,就可以对
酶切片段进行经典 PCR扩增 [ 4 ]。选择碱基包括 1
～ 10个数量不等的随机核苷酸序列 ,由此可以
调节 AFLP产物的条带特异性和数量 ,提供较多
48 CROP RESEARCH　　　　　　　　　　　　　　　 2001( 4)
的基因组多态性信息 ,也克服了 RAPD重复性
差的问题。 为了使酶切片段大小分布均匀 ,反应
中采用两个限制性内切酶 ,其中一个酶有多个切
点 ,另一个酶的切点数较少 ,因此 AFLP反应过
程中产生的主要是两个酶共同酶切的片段。采用
双酶切的原因主要是: ①多切点酶产生较小
DNA片段 ,切点数较少的酶能够减少扩增片段
的数目 ,因为扩增片段主要是多切点酶和切点较
少的酶组合产生的酶切片段 ,这样就可以减少选
择扩增时所需的选择碱基数 ;②双酶切可以对扩
增片段进行灵活调节 ,并防止形成双链造成的干
扰 ;③可以通过少数引物产生许多不同的引物组
合 ,从而产生大量不同的 AFLP多态性 DNA片
段。
2　AFLP的基本反应程序及分析
AFLP的基本反应程序包括模板 DN A制
备、酶切片段的扩增和扩增产物的凝胶电泳分析
3个步骤。
2. 1　模板 DNA的制备
高分子量 DNA的成功制备和避免部分降
解是 AFLP成功的关键。在制备过程中要注意避
免核酸酶及各种失活物质的污染。在用限制性内
切酶酶解时 ,一定要彻底 [5 ]。 DNA酶切完成后 ,
经加热让限制性内切酶失活 ,再把酶切片段连接
到特定的接头上 ,形成扩增反应的模板。 AFLP
的接头是一种人工合成的双链 DNA,长度一般
为 14～ 18个核苷酸 ,由核心序列和内切酶位点
特异序列两部分组成。 由于 EcoR I识别位点存
在于绝大多数真核生物基因组 DNA中 ,而 Mse I
可以产生比较小而稳定的酶切片段 ,因此 ,目前
EcoR I接头和 Mse I接头已广泛应用于 AFLP
多态性 DNA分析中。
2. 2　DNA扩增反应
酶切片段扩增反应和模板是酶切片段结合
位点中能够与引物上的选择性核苷酸适当配对
的核苷酸序列。引物是一种人工合成的单链寡核
苷酸 ,长度为 18～ 20个核苷酸 ,目前 AFLP扩增
中常用的引物为 Eco R I引物和 Mse I引物。选择
性扩增反应的条件与常规的 PCR主要的不同之
处是复性温度 ,其 PCR开始于高温复性 ( 65℃ ) ,
比常规 PCR反应的复性温度高 10℃左右 ,以获
得最佳选择性 ,以后复性温度逐步降低 ,一直降
到复性效果最好的温度 ( 56℃ ) ,然后在这个复性
温度下 ,完成其余的 PCR循环周期。
2. 3　凝胶电泳
AFLP反应中选择性扩增产物在 5%～ 6%
的变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离 ,形成
DNA指纹 ,凝胶经干燥、放射性自显影后即可进
行结果分析。目前 ,也有采用银染 [ 6 ]和荧光检测
法 [ 7 ] ,但各有其优缺点。
3　AFLP分子标记技术在禾本科作物
遗传改良中的应用
3. 1　构建遗传图谱
禾本科作物高密度图谱的构建为作物改良
奠定了理论基础。由于 AFLP可分析的数目相
当大 ,平均每块胶板中可以找出 8个多态产物 ,
而且可以定位于图谱上的部分所占的比例相当
高 ,因此被广泛应用于构建遗传图谱。Qi等 [8]
及 Beecker等 [9]构建了小麦高密度的 AFLP标
记遗传连锁图谱。法国 Yaye[10]一人利用 3个玉
米分离群体仅花费了 3个月的时间就构建了玉
米的 AFLP遗传图谱 ,共 1 032个 AFLP标记。
德国 Becker等 [9 ]则利用春大麦品种 Procter×
Nudinka杂种 F1创建的双倍体群体确定了 116
个 AFLP标记 ,补充到 RFLP遗传图谱上。
3. 2　遗传多样性分析和种质资源鉴定
作物的遗传变异为作物品种改良提供了可
能性 ,而对作物遗传多样性和种质资源进行准
确的评价则为此提供了理论依据。目前 AFLP
技术已广泛运用于禾本科作物遗传多样性和种
质资源的研究。
贾建航等 [12]利用 AFLP分子标记技术对
23个应用较广泛的玉米自交系进行了遗传多样
性分析。在 AFLP分析当中 ,共采用了 7个 EcoR
I/Mse I引物组合 ,每个引物组合扩增出的条
带数在 55～ 96条之间。利用以上 AFLP数据进
行了聚类分析 ,将 23个玉米自交系分为 3个群。
AFLP聚类图基本与系谱分析一致。通过
AFLP分析 ,找到了 3个玉米自交系的特异
AFLP产物 ,它们可应用于玉米自交系种子鉴
定。朱嘉辉从 2 000份水稻种质资源中随机选取
来源于不同生态区域的 200份材料 ,用 AFLP
技术研究其多样性 ,并根据分析结果提出了水
稻模式核心种假说。Blair利用 AFLP技术对 54
492001年 第 4期　　　　　　　　　　　　　作 物 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
份水稻品种的遗传多样性进行了分析 ,研究其
系统发育和分类 ,并与同工酶研究的结果进行
比较 ,发现不仅其结论一致 ,而且认为 AFLP
对研究品种的遗传变异和构建基因组图谱十分
理想 [14 ]。
AFLP的最适应用范围是 AFLP技术鉴定
品种指纹 ,检测品种的质量和纯度 ,辨别真伪十
分灵敏。美国先锋种子公司首先应用 AFLP技
术进行玉米自交系和杂交种的鉴定工作 ,建立
它们的指纹档案 ,保护品种专利。Yaye[10]用 1个
AFLP引物在玉米 2个基因型中发现 30条以上
的多态性条纹 ,十分适合于玉米基因型的鉴定。
Subudhi等 [13]也应用 AFLP对水稻进行种质分
类。 Smith[11 ]等人利用 AFLP技术对 44个玉米
自交系进行分析 ,将玉米自交系分成不同的类
别。Smith认为 , AFLP是一种很准确的方法 ,可
以将亲缘关系非常近的品种区分开。
3. 3　基因定位和基因克隆
AFLP的检出多态性高 ,一次可检测 50～
100条带 ,且可检出 DNA样品的细微差别 ,因
此特别适合于与近等基因系或目的基因紧密连
锁的分子标记。图位克隆 ( Map Based Cloning,
M BC)技术是分离未知产物基因的重要技术 ,
它的基本前提是基因定位 ,然后以紧密连锁的
分子标记为起点 ,通过染色体步行 ,最终克隆基
因。将 AFLP应用于禾本科作物基因定位和基
因克隆将为禾本科作物的遗传改良做出重要的
贡献。目前 ,许多学者正致力于应用 AFLP技
术进行基因标记及图位克隆。
Dwiekat等以小麦近等基因系为材料定位
了小麦抗麦蝇基因 H 6和 H16,并且分别找到
了与 H 5, H 6, H 10, H 16紧密连锁的 AFLP标
记 [16 ]。陈万权等 [15]借助大麦染色体 AFLP标记
遗传连锁和 M AP /QTL V3. 0作图软件 ,对大
麦的叶锈病的数量抗性基因 ( QTL)进行了定
位分析 ,明确了大麦部分抗性品种 V ADA对叶
锈病的潜育期由分别定位于染色体 1, 2, 6, 7上
离短臂末端 79, 186, 58和 117 cM处的 4个数量
抗性基因所控制。发现位于第 7染色体上的
QTL存在着病菌致病类型的专业化。
4　问题和展望
AFLP作为一种十分有效的 DN A指纹技
术 ,除了在禾本科作物的基因定位和基因克隆、
辅助选择育种、构建遗传图谱和指纹图谱以及
分析遗传多样性等方面得到广泛的应用外 ,
AFLP还可应用于作物优势群的划分 [17]和预测
杂种产量 [18 ]。与其他 DNA分子标记技术相比 ,
它不需要事先进行 DNA序列分析 ,引物合成
和核酸探针特征分析 ,检出的多态性稳定而不
受底物浓度、温度、扩增循环数等方面微小差异
的影响 ,也不需要进行繁琐的 Southern转移和
分子杂交 ,操作简便 ,可以在短时间内同时分析
大量样品。因此 , AFLP仍是目前最理想的分子
标记技术。虽然 , AFLP是一种专利技术 ,分析
试剂盒价格昂贵 ,实验涉及面广 ,对操作人员素
质要求较高 ,对 DNA的纯度和内切酶的质量
要求也较高 ,很难在普通实验室开展 AFLP研
究 ,目前在商业上的应用受到了很大限制。但
是 ,随着 AFLP技术的不断改进 , AFLP将具有
更广阔的应用前景。
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研究简报
早稻机播低位蘖再生稻研究取得初步成功
　　再生稻栽培在我国已有 1 700多年的历史。
20世纪 90年代初 ,我国进行了杂交中稻蓄留再
生稻的研究 ,取得了较好的效果。为促进水稻的
省工栽培 , 1995年笔者研制了“署华 2BD- 100
型水稻播种机”。利用该机播种早稻 ,收获后蓄
留低位蘖再生稻 ,穗粒数大大超过了手插的中
稻—再生稻 ,且生长季节短 ,具有较好的应用前
景。对这种栽培方式进行多年的研究表明 ,早稻
机播—低位蘖再生稻具有较大优势:一是早稻
机播规范化栽培 ,符合水稻生长规律 ,充分利用
低位蘖芽 ,增产潜力更大。二是选用早稻品种作
机播再生稻栽培 ,生育期短 ,能确保双季稳产高
产。三是机播时 (清明前后 )气温已稳定通过
12℃ ,适宜水稻生长 ,再生稻生长期气温高 ,日
照强 ,光合效率高 ,后期气温适宜 ,米质好 ,不受
寒潮和寒露风的危害。四是芽谷播在肥沃、通
气、温度适宜的表土层中 ,秧苗生长更健壮。五
是早稻机播种子入土浅 ,再生稻的低位蘖能长
出独立的根系 ,使再生稻长势旺 ,已发现每蔸再
生穗多达 47个 ,叶片数 5～ 6片 ,每穗粒数多达
319粒的植株。六是采用低桩收割 ( 13 cm) ,利用
秸秆还田 ,可以增加土壤有机质与磷钾含量。七
是省去全年育苗移栽等用工 13个左右 ,省种约
15 kg /hm
2
,每公顷可节约 4 500元。
2001年 ,笔者在长沙县高桥镇金桥村示范
早稻机播低位蘖再生稻栽培面积约 1 hm2 ,品种
为香两优 63和中优早 12号 ,再生稻每公顷蔸数
为 420万 ,每蔸平均 12穗 ,平均产量达到 6 000
kg /hm
2。
(周署华 ,何登骥 ,伏军 )　
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