全 文 ：中药及天然药物 ·
促进天麻等兰科药用植物种子
萌发的真菌醋酶同工酶研究
中国医学科学院药用植物资源开发研究所 ( 10 00 9 ) 4 郭顺星 徐锦堂
提要 用 聚丙 烯 酞胺凝胶电泳枝术 , 对促进 天麻等 兰 科药 用植物种 子 萌发的 6 种真菌进行 了 醋酶
同工酶分 析 , 获 得 了各 自稳定的 同工酶谙 。 其 中 5 种 真菌的醋 酶与 已知 的 紫其 小 菇相 比 , 酶带数及迁
移率均有差异 , 故其 分类地位有待进 一步鉴定 。 同时对酶谱 变化 与真菌生 物 学特性 的相 关性进 行 了 阐
述。
关键词 同工 酶 ; 紫算小 菇 ; 天麻
同工酶是 基因表达的产物 , 可作为遗传学
上的一个生化指标 。 国内外利用酚酶同工酶谱 ,
进行亲缘关系分析 , 杂种优势预测 、 植物雄性
不育和基因定位等研究 , 展示了同工 酶分析 品
种差异及遗传规律的可靠性 〔` · “ 〕。 有关同兰科
植物共生的真菌 , 迄今未见同工 酶分析应用的
报道 。 对促进 兰科药用植物种子萌发有效 , 而
目前尚难以形成子实体的真菌之间醋酶同工 酶
进行研究 , 建立各 自的同工酶谱 , 了解其亲缘
关系 , 作为生产应用上评价菌种优劣的参考依
据 , 是非常必要 的 。
材料和方法
l 供试 菌株
从天麻 ( G Q材 r o d记 el at a ) 种子萌发的原
球 茎 中分 离的 02 , 03 , 04 号菌株 「3 〕 ; 自见血
清 ( L i娜 r i s o e r v o s a )及 细叶石解 ( D e o d r o -
b iu 阴 h a n c o c ik i) 种子萌 发的原球茎 中分离的
C 3
,
G 4号菌株 ; 、 以 紫 其 小 菇 ( M梦 e 。 。
0 5 0 u n d i e o l a ) 为 对照 〔络3 , 确定以上菌株 与对
照的亲缘关系 。 这些真菌对天麻 、 石解 、 白及
等 兰科药 用植 物种子 萌 发均有较好的促进作
用 。
2 样品制备
参照文献方法 〔 ` · 5 〕改进 , 先将斜面试管菌
种分别接于平板 P D A 培养基上 , 每菌种重复
8皿 , 置 25 ℃ 条件下培养 , 先后于培养 d9 、 18
d
、
28 d
、
37 d 时各取不同菌种 1皿 , 刮取表
面菌丝 , 加等量 T r is 一 甘氨酸缓 冲液 ( p H S . 3)
浸提 , 4 ℃下研磨成糊状 , 置 一 5 ℃ 冷冻 24 h,
然后于 4 oC下 2 5 0 0 r /m i n 离心 3 o m i n 。 取上清
液 加 40 % ( w / v) 蔗糖液 , 置 一 5 ℃ 保存 。
3 电泳条件
采 用聚 丙烯酸胺凝胶圆盘 电泳 , D Y Y -
m 4 型 稳压稳流电泳仪 , 上层胶浓度 4 % , p H
6
.
7 ; 样品分离胶浓度 7 . 6% , 州 8 . 9。 点样量
每管 50 卜 l, 0 . 1% 嗅酚蓝 作指 示剂 , 电极缓冲
液为 T r i s 一 甘氨酸系统 , 州 8 . 3 ; 电流强度每
管 2 m A , 电泳在 4 ℃条件下进行 , 当嗅酚蓝
迁移至距凝胶下端 cI m 处停止 电泳 。
4 染色方法
电泳完后脱下胶条 , 放入醋酶同工酶染液 ,
染色液 组成 : 0 . Z m ol / L 12 0 m l磷 酸 缓 冲液
( pH 6
.
2 ) 加入 12 o m 只坚牢蓝和 4 . s m l 用 5 0%丙
酮配制的 1 纬蔡醋乙酸 , 再加入 80 m l蒸馏水 ,
过滤后使用 。 染色时间以全部色带清晰 为止 。
然后用水冲去染液 , 50 % 乙醇固定 。
结果与讨论
l 同一菌株的醋酶同工酶
1
.
! 通过对促进天麻等兰科药用植物种子
萌 发 的 6 个菌 株醋 酶同工 酶测 定 , 结 果表明
( 附 图 ) , 同 一 菌 株柱同一时间测定 , 醋酶
同工酶带数 目、 迁移率及染色深浅基本一致 。 为
中国 药学杂志 19 91 年第26 卷第 9 期
了考查其酶谱的重复性 , 经过采用不同 电泳条
件测定 , 结 果只要在 相同条件下的同一菌株 ,
其酶谱均相同 , 谱带清晰整齐 , 并且重复性较
好 。 尤其是在菌 种培 养的某一时期 , 可获得能
够代表该菌株醋酶特点的稳定酶谱 , 而不同菌
株间的酷酶同工 酶谱差异较大 , 这同有关真菌
醋酶变化的报道 相一致 6[ · 7 」。
1
.
2 酚酶同工 酶是基因的产物 , 酶谱是基
因的表现型 , 其 酶谱具有较稳定的遗传特征 ,
所以醋酶被常用作检测生物遗传行为的一种生
化指标 。 每一菌株在其发育的特定时期 , 具有
较稳定的醋酶酶 谱 , 因而结合考查菌株的生 物
学特性 , 对不 同的兰科种子萌发菌进行酷酶同
工 酶分析 , 是一种有效的菌种鉴别方法 。
2 不同培养时间的酷酶同工酶谱见附图 。
2 一 l 酶带数 的变化
随着培养时 间的增加酶带数有所递增 , 如
0 2号菌培养 g d时为 2 条酶带 , 28 d时增至 9 条 ;
紫其小菇培养 g d时 为 2 条 , 28 d时增至 3 条 ;
04 号菌培养 g d时 3 条 , 28 d 时增至 6 条 。 但这
3个菌株酶带数分别在培 养的一定时间内趋于
稳定 。 另一种现象是 , 随着培养时间的增加 ,
酶带数有所递减 , 如 03 号菌培养 g e坦寸 3条 , 37
d 时减 至 l 条 ; G 3号菌培养 g d 时 4条 , 2 8
d 时减 至 2 条 , 37 d时则测不 出酶带 ; C 4 号
菌培养 g d时 5 条 , 3 7 d时减至 1条 。
2
.
2 酶带染色变化
染色深浅 , 标志着 酶活性的高低 。 随着培
养时间的增加 , 酶带染色深浅有所变化 , 从实
验中观察有 3 种现 象 : ( 1 )随着培 养时间的增
加有些菌株 酶带染色加深 , 如 02 号菌培养 g d时
所测的第 7 条带 (迁移率 0 . 4 4) 和 第 9 条带 (迁
移率 0 . 23 ) ;紫其 小菇 培养 9由寸的两条酶带均随
着培 养时间的增加染色加深 ; ( 2 )随着培养时
间的增加 , 染色深浅保持不变 , 如 04 号菌培 养
9d 时 出现的酶带至 37 d时均无染色深浅上的变
化 ; ( 3 )随着培养时间的增加 , 有些菌株 酶带
染色变浅 , 如 03 号菌靠近负极区的 1 条带 , G 3
靠近负极区的 3 条带 , G 4号 菌 迁移速度较快
的 3 条带 , 培养后期活性降低 。
2
.
3 酶谱变化与菌丝生长速度的关系
酶谱的变化结合供试真菌菌丝的生长特 点
可以得 出以下结果 : ( 1 )凡随着培 养时间的增
加 , 酶带数递增明显 , 且其 中有些带染色加深
的真菌 , 从生长 的菌落观察 , 在接种后培养的
初期菌丝生长较慢 , 随着培 养时间的增加 , 生
长速度逐渐加快 ; ( 2 )随着培 养时间的增加 ,
酶带数递减 , 其中有些酶带染色变浅的菌种 ,
均表现培 养的初期菌丝生长较快 , 随着培养时
间 的延长 , 生长明显减慢 ; ( 3 )在菌丝培 养期
间酶带数及着色基本无改变的菌种 , 其菌丝生
长保持一定速度 。
酶谱的变化和菌种生物学特性的这种相关
性 , 反映 了同工酶作为调节酶的类型 , 是受其
代谢产物的控制 。 当菌丝培养的前期生长速度
快 , 代谢旺盛 , 则表现 了带数多 、 活性高 , 而
后期代谢产物积 累时抑制同工酶的产生 , 表现
了带数递减和染色变浅 。 同时说明不同培养时
间 酶谱发生 改变 , 标志着生 物的发育过程是遗
传信息在时 间 、 空间顺序表达的过程 , 标志着勺
各阶段不同基因的活化水平 , 并且反映 出代谢
上 的差异 「8 · 9 〕。
3 不同菌株的酷酶同工酶谱
本实验所用的菌种 , 取 各 自培养期 中稳定
的醋酶同工 酶比较 , 紫其小菇 与 02 , 03 , 04 ,
G 3
,
G 4 号菌株之间 , 酶带数有一定差 异 ( 表
l )
, 有的菌株虽然酶带数接近或 相等 , 但其迁
移率有差异 (表 2 ) , 故 0 2 , 0 3 , o峨, G 3 , G 4
号菌株与紫其小菇为各异的菌株 , 其 亲缘关系
表 l 不同菌株醋酶同工酶稳定期的带数
号 酶带数株一例招切世39
表 2 不同菌株酷酶同工酶迁移率
一 -一- 一一-一一一漪 带苗株 下一万一不厂 丁一 丁 . 。 了 8 。沱.2一1冶
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紫其小菇 0 . 7 8
0 2 0
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03 一
0 4 一
( 二3 一
( ; 理 一
0
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7 3
0 70
0 5 6 一 一
0
.
5 7 0
.
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一 0 51 一一 0 . 4 7 0 . 3 0
0
.
60 一 一一 0 . 4 9 0 、 44
中国 药学杂志 19 9 1年第26 卷第 9 期
G 3 号菌株 G 4号菌株 0 4号菌株 , 紫其小菇 02 菌株
附图 菌株不同生长 天数酷酶同 工酶谱
嗓困. 一 浅 ; 〔夕凶 一深 ;
0 3菌株
咬左 l 一最 浅 .
及分 类地 位 , 有待进一步鉴定 。
. . . 一最深
由于同工酶是基因 水平上 的产物 , 为此在
培养条件严格一致时 , 各菌株酶谱 的不同 , 反
映 了分类地位上 的差异 。 如果两种未知菌在完
全相 同的条件下培养 , 酶谱相同 , 则表示是 同
一个种 ; 如果仅是特征性酶带相同 , 则只能初
步判断亲缘 关系相近 , 这在生物分 类上具有一
定意义 。 同时值得注意的是 , 酷酶同工酶谱的建
立 , 可为今后生产应用上评价这些促进 种子萌发
的真菌是 否退 化 , 提供 了较为可行的生化指标 。
参 考 文 献
[ l ] 朱婉华等 . 食用菌 198 6 ; ( 2 ) : 27
f Z ] 李继耕等 . 遗传学报 19 5 0 ; ( 7 ) , 22 3
[ 3 〕 徐锦堂等 . 中草药 29 8 0 ; 1 1 ( 3 ) : 12 5
〔4] 徐锦堂等 . 中国医学科学院学报 19 8 8 ; 10 ( 4 ) : 2 7 0
〔5 ] 张树政等编著 . 酶学研究技术 (上册 ) . 北京 : 科学出版 社 ,
19 87 : 8 6
产
[ 6 〕 李家慎等 . 中国食用菌 29 8 6 ; ( 2 ) : 2
〔7] 张厚铿等 . 中国食用菌 19 8 6 : (2 ) : 7
[ 8了 张志良等编著 . 植物生物化学技术和方法 . 北京 : 农业出版
社 , 19 8 6 : 92 1
〔9 1 余大线等编著 . 微生物学 ( 第二版 ) . 北京 : 科学出版社 , 19 8 5 : 4 87
雪兔子的挥发油和微量元素成分的研究
西北师范大学化学系 ( 73 0 7 0) 郑尚珍 余建华 `沈序 雄
提要 本文首 次报 道雪 兔子 中挥发油 和微量 元素的化学 成分 。 用 G C / M S / D S 联 用技 术 , 从该
植物挥 发油 中分 离出 14 3 种成分 . 鉴定 了 其中 63 种 , 其 中主 要成 分 是菇类 、 梭酸 脂 和含 氮化 合物 : 另
外 , 还用 原 子吸收分光 光度计 鉴定 了 16 种微童元 素
关键词 凤毛 菊属 : 雪 兔子 : 挥 发油 ; 微童 元素
雪兔子 ( S a “ s s u r e a g o s s g P板P h o r a D .
D o n ) 系菊科 ( C o m po s i t e ) 凤毛菊属植物 。
藏名 : 麦朵刚拉 。 草本 、 茎矮 、 花呈 白色棉毛
状 , 主要分布于青藏高原 海拔 4 0 0 一 5O0 0 m 的
积雪 地带 , 资源丰富 , 具有除寒 、 壮阳 、 调经
止血和祛痰等功效〔` J。 藏 胞主要用来治疗风湿
性关节炎 , 痈 疮肿毒 , 高山反应 等病症 2[] , 故
有 “ 高原宝药 ” 之称 。 该植物化学成分 , 至今
未 见报道 。 为了开发这一药用资源 , 我们对雪
兔 子的化学成分进行了系统研 究 , 本文仅报道
其挥发油和微量元素成分的研究工作 。
实验方法及结果
l 材料来源和试样制备
材料采自青 海省格 尔木地区的雪山上 , 由
本校植物分类所朱格麟研究员鉴定 。
材料全草2 . sk g , 置 于自制的 压力蒸馏器
中 , 经共 沸蒸馏 , 分离和干燥得到淡黄色挥发
油约 2 . 18 9 , 得率为0 . 08 7写。 置于冰箱中冷冻 ,
中国 药学杂志 19 91 年第 26 卷第 9 期
一 AB T R S AT C SO F O R I GIN L A AT R I C LE S
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中国药学杂志 19 91 年第 26 卷第 9 期
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T h e e h
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s t a b il i t y o f P o V id o n
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a e r os o l ( P IA ) w a s s tu d le d a t e o n s ta n t t e m ep
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·
T h e d a ta w
e r e t r e a te d b y e l
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r es u l t s s h o w e d t h a t th e d e e o m Po s l t io n of P IA f of
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lo w e d a n e q u a t i o n o f f i r s t o r d e r r
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B y a d d i n g a
s t a bj l iz e r
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r a i s e d f r o m 12 9 t o 3 7 8 d a y s
.
T h e ca l
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g r a m w as a ls o g i v e n
.
K e y w o r ds op
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, c o m Pu t e r P r -o
即a m ( o r i ig n a l a r ti e l e o n 外g e 5 34 )
T h e e o m琳t i ib l i t y o f t r o x e r u ti n a n d e i ti e o l i n e in de x -
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S U N H u a
,
D U A N M U X i a n g
一 t a o , Z H A N G
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一 Ju n (加 t: ut et of CI : : 昭 a l 外 。 , m a e o￡o夕犷 a就 黝。 护从 a e夕 ,刀口 , b o n 衬“ 卜
Ca l U几; ”舒 : “ , , aI ,吞城 , 15 0 0 8 6 )
·
5 69
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