全 文 ：第 31卷第 5期
2008年 10月
云南中医学院学报
JournalofYunnanUniversityofTraditionalChineseMedicine
Vol. 31No. 5
10. 2008
云南铁线莲属 12种药用植物的 RAPD分析＊
普春霞1、2■ , 杨竹雅 1 , 刘小莉1
(1.云南中医学院中药学院 , 云南昆明　650200;2.中国科学院昆明植物研究所 , 云南昆明　650204)
　　摘　要:目的:通过对 12种铁线莲属药用植物进行遗传多样性和亲缘关系分析 , 为生药鉴定提供依据。方
法:随机扩增多态性 DNA(RAPD)技术分析遗传多样性 , UPGMA类平均法进行聚类分析。结果:利用筛选出
的 10个随机引物对供试材料 DNA进行随机扩增 , 共得到 89条带 , 其中多态性带有 89条 , 多态性百分率为
100%.采用 UPGM聚类法对扩增出的谱带进行遗传聚类分析 , 得出反映各种间亲缘关系的树状图。 对多数种而
言 , 种间差异明显 , 同种不同分布点也存在差异 , 但同一分布点的不同个体差异较小。结论:该标记技术对铁
线莲属植物的生药鉴定是可行的 , 在系统学方面的应用有待进一步研究。
关键词:铁线莲属;RAPD;生药鉴定
中图分类号:Q949　　文献标识码:A　　文章编号:1000— 2723(2008)05— 0037— 05
　　铁线莲属 (Clematis)是一个全球分布的大
属 , 全世界约 300余种 , 中国 147种 , 云南是主要
分布区 , 分布有 56种 , 20变种 [ 1] 。本文作者对云
南铁线莲属的药用种类进行重新整理 , 确定云南共
有 32种 , 7变种 [ 2] 。从中选取了 12种进行 PAPD
分析 , 希望能对云南省铁线莲属药用种类的生药鉴
定提供依据。虽然 RAPD带有一些明显的缺陷
(如无法鉴定杂合子及重复性), 但由于此方法对
DNA质量要求较低 , 也不需预先了解研究对象的
基因组 , 因此考虑到生药鉴定的特殊性 , 仍选择此
方法。同时 , 实验证明同一实验室如果采用相同的
RAPD流程 , 在同一型号的 PCR仪上运行有很好
的重复性[ 3 ～ 4] 。在以往的研究中已有一定的工作采
用此方法对铁线莲属进行了研究 , 但数据量较
小 [ 5] , 加之受分类学研究的影响 , 数据的可比性
降低 , 因此在本文中部分种出现重复 。
同时 , 目前对中国铁线莲属的研究仍集中于经
典分类 , 因此本文也将对此方法应用于铁线莲属系
统发育研究的可行性进行探讨 。
1　实验材料与方法
1.1　实验材料
本文中所用样品为在野外采集的成熟叶片 , 用
硅胶干燥后保存在 -20℃ (表 1)。
1.2　总 DNA的提取
采用 2XCTAB微量法提取总 DNA, 具体操作
参照文献 [ 3]的方法 , 略有改动 , 整个提取过程均
使用 1.5mL的离心管 。提取出的总 DNA溶解于
适量无菌双蒸水 , -20℃冰箱保存 , 备用。用
0.6%琼脂糖凝胶电泳检测片段大小 , 均大于
20kb, 可见紫外分光光度计 (日本岛津 UV-
2450)检测纯度 。
1.3　PCR扩增反应
在温度梯度 PCR仪 (WhatmanBiometraTgradi-
ent)上进行。扩增反应体系为 25μL, 10Xbufer缓
冲液 (无 Mg2+) 2.5μL, dNTP (25μmol/L)
2.0μL、 MgCl2 (25μmol/L) 1.5μL、 扩 增引 物
(10μmol/L) 2.0uL、 模板 40ng-80ng、 Taq酶
1.5U、 加无菌双蒸水补充体积至 25μL。 PCR扩增
试剂购自大连宝生物工程有限公司。扩增程序:
94℃下预变性 4min, 36℃复性 1min, 72℃延伸
90s, 然后 94℃1min, 36℃1min, 72℃90 s进行 44
个循环 , 最后 72℃延伸 5min, 4℃保存。用筛选出
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＊基金项目:云南省教育厅基金项目 (NO:03Z710C)
收稿日期:2008— 03— 20　　修回日期:2008— 07— 15
作者简介:普春霞 (1977 ～ ), 女 , 云南大理人 , 讲师 , 主要从事药用植物资源研究。 ■通讯作者:普春霞 , Tel:
0871-6212605, E-mail:yucca1977@yahoo.com.cn
2008年 云南中医学院学报 第 31卷
表 1　样品编号
样品编号 学名 中文名 采集地 凭证标本保存地
1-1、1-2 C.puberlavar.ganpiniana(Levl.＆Van.)W.T.Wang 扬子铁线莲 昆明 云南中医学院
2-1、2-2 C.peteraeHand.-Mazz.、 钝萼铁线莲 昆明 云南中医学院
2-3、2-4 腾冲 云南中医学院
3 C.connataDC. 合柄铁线莲 昆明 云南中医学院
4-1、4-2 C.chrysocomaFranch. 金毛铁线莲 昆明 云南中医学院
5-1、5-2 C.buchananianaDC. 毛木通 昆明 云南中医学院
6 C.ranunculoidesFranch. 毛茛铁线莲 建水 云南中医学院
7-1、7-2、7-3 C.napaulensisDC. 合苞铁线莲 腾冲 云南中医学院
8 C.gourianaRoxb.exDC. 小衰衣藤 罗平 云南中医学院
9 C.montanaBnch.-Ham.exDC. 绣球藤 泸水 KUN
10-1、10-2 C.meyenianaWalp. 毛柱铁线莲 福贡 KUN
11 C.yunnanensisFranch. 云南铁线莲 泸水 KUN
12 C.metuoensisM.Y.Fang 墨脱铁线莲 泸水 KUN
　　注:以上标本除 C.puberlavar.ganpiniana(Levl.＆Van.)W.T.Wang由李锡文研究员鉴定外 , 均由作者鉴定 , 李锡
文研究员审阅 。 KUN为中国科学院昆明植物研究所标本馆的国际代码
的引物对所有个体的 DNA进行 PCR扩增 。
1.4　琼脂糖凝胶电泳
水平电泳仪 (Bio-RAD)制胶时在胶中加入
500ng/mL溴化乙锭。电泳条件:扩增产物 15uL
加适量上样缓冲液 , 40 V恒压 , 电泳时间 3h, 电
泳结束后 , 凝胶成像系统 (TanonGIS-2009)观
察 , 记录结果。
1.5　RAPD随机引物筛选
10bp寡核苷酸随机引物由上海生工生物工程
技术服务有限公司合成 , 共 200个 RAPD引物 。筛
选出多态性较强 、重现性好的 10个引物 (表 2)。
表 2　引物编号及扩增条带数
引物编号 条带数 引物编号 条带数
1.OPB-1 10 6.OPH-6 10
2.OPB-2 9 7.OPH-10 9
3.OPD-12 11 8.OPL-13 9
4.OPE-18 7 9.OPM-7 5
5.OPF-15 11 10.OPO-7 8
1.6　数据分析方法
电泳图谱中根据分子迁移率及其有无进行统
计:有带计为 l, 无带或模糊不能辩认计为 0。以
种为单位用 Popgen32软件选择 Nei的无偏差遗传
一致度 (unbiasedidentity), 计算出基于此的遗传
距离 , 用 MEGA3.1软件选择 UPGMA法进行聚类
分析构建聚类图[ 6] 。
2　结果
2.1　DNA多态性
本文选择了 10对引物 (表 2), 共计 89条条
带。 10个随机引物对铁线莲属 12种植物的基因组
DNA进行随机扩增 , 共得到 89条带 , 其中多态性
带有 89条 , 多态性百分率为 100%.文中选出 2
个多态性最好的引物扩增出的代表性图 (图 1)。
OPO-7
OPF-15
Mark:DL2000
样品顺序为 1-1、 1 -2、 2 -1、 2-2、 2 -3、 2 -4、
3、 4-1、 4-2、 5 -1、 5-2、 6、 7 -1、 7-2、 7-3、 8、
9、 10-1、 11、 10-2、 12
Sequenceofexperimentalsample:1-1、 1-2、 2-1、 2
-2、 2-3、 2-4、 3、 4 -1、 4-2、 5-1、 5 -2、 6、 7 -
1、 7-2、 7-3、 8、 9、 10-1、 11、 10-2、 12
图 1　引物 OPO-7和 OPF-15扩增结果
Fig.1　AmplificationresultsbyprimerOPO-7andOPF-15
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第 5期 普春霞 , 等:云南铁线莲属 12种药用植物的 RAPD分析 　　　　　　　　　 　
2.2　种间遗传距离和聚类分析
实验所得的 Nei的无偏差遗传距离矩阵见表
3, 12个种之间的遗传距离除 C.yunnanensis和 C.
metuoensis之间以及这两者分别与 C.puberla之间
的遗传距离小于 0.1以外 , 其余均大于 0.1。应
用 UPGMA法得聚类图 (图 2)。在此聚类图中 ,
小于 0.05处 , C.yunnanensis、 C.metuoensis与
C.puberla形成第一个分支 , 与遗传距离相呼应。
表 3　Nei的无偏差遗传距离
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1C.puberla 0.00002
2C.peterae 0.1341 0.0000
3C.connata 0.2197 0.1901 0.0000
4C.chrysocoma 0.2371 0.2710 0.2067 0.0000
5C.buchananiana 0.2218 0.2900 0.3171 0.3058 0.0000
6C.ranunculoides 0.2057 0.1367 0.2691 0.3185 0.3648 0.0000
7C.napaulensis 0.2359 0.3127 0.4710 0.3743 0.3371 0.3831 0.0000
8C.gouriana 0.1310 0.2170 0.3142 0.3342 0.3812 0.2691 0.3339 0.0000
9C.montana 0.2339 0.2816 0.2401 0.3732 0.3979 0.3455 0.4738 0.3298 0.0000
10C.meyeniana 0.1061 0.2022 0.3157 0.3357 0.3185 0.3003 0.3355 0.1991 0.3312 0.0000
11C.yunnanensis 0.0117 0.1622 0.2401 0.2290 0.2423 0.2260 0.2444 0.1579 0.2545 0.1326 0.0000
12C.metuoensis 0.0636 0.2049 0.2839 0.3030 0.2483 0.2691 0.2718 0.1982 0.2990 0.1719 0.0819 0.0000
图 2　基于种间 Nei的无偏差遗传距离的 UPGMA聚类图
2.3　个体间遗传距离和聚类分析
在遗传距离中 , 同种同产地的遗传距离小于
0.1, 同种不同产地的遗传距离在 0.1-0.2之间 ,
而种间差异多大于 0.2。其中较为特殊的是 C.
yunnanensis、 C.metuoensis分别和 C.puberla的
遗传距离也小于 0.1, 与种间遗传距离的数据一
致。在 UPGMA聚类图中 (图 3), 同种同产地的
分支均位于小于 0.05处 , 仅上述三种较为特殊 ,
位于小于 0.05处 , 且在第一分支中 , C.puberla
和 C.yunnanensis无法区分 。
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2008年 云南中医学院学报 第 31卷
图 3　基于个体间 Nei的无偏差遗传距离的 UPGMA聚类图
3　分析与讨论
种间遗传距离的分析结果见表 3, 各种间的遗
传距离从 0.0117到 0.4738不等 。其中 12个种之
间的遗传距离除 C.yunnanensis和 C.metuoensis
之间以及这两者分别与 C.puberla之间的遗传距
离小于 0.1以外 , 其余均大于 0.1。在图 2中 , C.
yunnanensis、 C.metuoensis与 C.puberla形成第
一个分支小于 0.05。就总的情况而言 , 依据种间
遗传距离可以较好地将 12种分开 , 即便是上述 3
个种 , 虽然种间遗传距离小 , 但就目前扩增出的条
带来看 , 差异明显。在依据个体间遗传距离得到的
UPGM聚类图中 , 在第一分支处 , C.puberla和
C.yunnanensis无法区分。就其原因而言 , 主要是
由于所选引物对这 2个种不合适 , 条带数太少 ,
C.puberla和 C.yunnanensis仅为一条 , 致使这两
个种无法区分。因此在 UPGM聚类图中 , 可以看
到出现了种间遗传距离大于种内遗传距离的情况 。
对其他种而言 , 种间差异明显 , 同种不同分布点也
存在差异 , 但同一分布点的不同个体差异较小 , 因
此利用 RAPD进行药用种类的种一级的鉴定和产地
鉴定具有可行性。因此可以认为 , 将 RAPD分子标
记的方法运用于铁线莲属的生药鉴定是可行的。同
时 , 选出的引物在一定程度上可以作为铁线莲属植
物的通用引物 。但仍需增加引物筛选和优化 。
在经典分类的系统中 , 绣球藤 C.montana
Buch.-Ham.exDC., 金毛铁线莲 C.chrysocoma
Franch., 合苞铁线莲 C.napaulensisDC属于绣球
藤亚属 subgen.CheiropsisPeterm.的绣球藤组
sect.CheiropsisDC.;小蓑衣藤 C.gourianaRoxb.
exDC., 钝萼铁线莲 C.peteraeHand.-Mazz.,
扬子铁线莲 C.puberlavar.ganpiniana(Levl.
＆Van.)W.T.Wang, 毛柱铁线莲 C.meyeniana
Walp.属于欧洲铁线莲亚属 Subgen.Clematis.
Keener＆Dennis的威灵仙组 Sect.Clematis.Tamu-
40
第 5期 普春霞 , 等:云南铁线莲属 12种药用植物的 RAPD分析 　　　　　　　　　 　
ra, 墨脱铁线莲 C.metouensisM.Y.Fang属于欧
洲铁线莲亚属 Subgen.Clematis.Keener＆ Dennis
的菝葜叶铁线莲组 Sect.NaraveliopsisHand. -
Mazz.;云南铁线莲 C.yunnanensisFranch.毛木通
C.buchananianaDC.合柄铁线莲 C.connataDC.,
毛茛铁线莲 C.ranunculoidesFranch.属于尾叶铁
线莲亚属 Subgen.ViornaGray的尾叶铁线莲组
Sect.Viorna(Reichb.)Prantl[ 7] 。聚类图的结果与
经典分类的结果不吻合 , 意味着运用 RAPD的分子
标记的方法进行系统学的研究可能是不合适的 , 这
可能是由于实验所涉及的 12个种分别属于铁线莲
属的亚属 , 加之铁线莲属是一个温带分布的全球性
大属 , 种类繁多 , 分布范围广 , 使得种间差异增
大 , 这意味着实验所得条带中非同源性条带的出现
几率增加 , 因而此方法对于重建系统可能是不合适
的 。若选择此方法进行系统学研究 , 需要进一步的
引物筛选增大数据量 , 并对可能出现的非同源性条
带加以注意 。随着分子标记技术的发展 , 各种新的
技术不断产生 , 如果要科学 、 准确地对植物的遗传
多样性和亲缘关系进行研究 , 还得运用多种分子标
记技术 , 将每种标记的结果和传统的分类结果进行
全面的比较和分析 , 才能获得令人信服的结果。
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(编辑:岳胜难)
RAPDAnalysisof12SpeciesofClematis
PUChun-xia1、2 , YANGZhu-ya1 , LIUXiao-li1
(1.YunnanUniversityofTCM, KunmingYunnan650200, China;
2.KunmingInstituteofBotany, ChineseAcademyofSciences, KunmingYunnan650204, China)
ABSTRACT:Objective:Geneticdiversityamong12 speciesofClematisL.wereanalyzed, andtheresult
wasthefoundationinformationforidentificationofmedicinalplants.Methods:Randomamplifiedpolymorphic
DNA(RAPD)techniquewasusedtoanalyzegeneticdiversity, andthedendrogramwasconstructedbyUPGM.
Results:TenRAPDprimerswereselectedtoapplyforrandomamplification.Atotalof89DNAbandsweredetec-
ted, alwhichwerepolymorphic.ThedendrogrambyusingUPGMclaimedthatthediferencesamongmostofspe-
ciesweredominant, andthediferencesamongdiferentdistributionsiteofthesamespeciescouldbeidentified,
however, itwasnoteasytoidentifythesamespeciesatthesamesite.Conclusion:RAPDmarkerswassuitablefor
identificationofspeciesofClematis.Butwhetheritwasusedforphylogeneticswasnotsure.
KEYWORDS:Clematis;RAPD;IdentificationofMedicinalPlants
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