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老鹳草属植物遗传多样性的 RAPD分析
尹海波 ,韩荣春 ,康廷国 ,王 冰 ,许 亮
(辽宁中医药大学药学院 ,辽宁大连 116600)
摘要 目的:分析 8种老鹳草属植物遗传多样性和亲缘关系。方法:利用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术分
析遗传多样性 , UPGMA类平均法聚类分析。结果:筛选出的 11个随机引物供试材料 DNA随机扩增 , 共得到 145条
带。其中多态性条带 114条 ,多态性为 78.62%。经聚类分析 ,可将供试材料分为 3类 , 与传统分类方法差异不大。
结论:RAPD技术用于老鹳草属的遗传多样性和分类研究是可行的。
关键词 老鹳草属;RAPD;遗传多样性;亲缘关系;聚类分析
中图分类号:R282.77 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2008)12-1788-03
RAPDAnalysisforGeneticDiversityofGeranium
YINHai-bo, HANRong-chun, KANGTing-guo, WANGBing, XUliang
(LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedical, Dalian116600, China)
Abstract Objective:Toanalyzethegeneticdiversityandaffinityrelationshipsamong8speciesofGeranium.Methods:Random
amplifiedpolymorphicDNA(RAPD)techniquewasusedtoanalyzegeneticdiversity, andthedendrogramwasconstructedbyUPGMA.
Results:ElevenRAPDprimerswereelectedfortherandomamplification.Atotalof145DNAbandsweredetected, 114amongwhich
werepolymorphic, theaveragerateofpolymorphicbandswas78.62%.TheresultofclusteranalysisbyusingUPGMAmethodshowed
that8 genotypescouldbeclassifiedintothreetypes.Thisoutcomewascorespondingtothetraditionalclassification.Conclusion:Itis
concludedthatRAPDmarkerscanbeusedonthestudiesofgeneicrelationshipsandclassificationofspeciesofGerniumsensitively.
Keywords Geranium;RAPD;Geneticdiversity;Geneticrelationships;Clusteranalysis
作者简介:尹海波(1973-),辽宁沈阳人 ,副教授 ,博士 ,主要研究方向:种质资源鉴定及中药的品质评价;Tel:15998530628, 0411-87586004。
中药老鹳草为牻牛儿苗科牻牛儿苗 Erodium
stephanianumWild.、老鹳草 GeraniumwilfordiMax-
im.或野老鹳草 G.carolinianumL.的干燥地上部
分 〔1〕 ,具有祛风湿 、通经络 、止泻痢的功效 〔2〕。我国
老鹳草种类繁多 ,不同地区常混杂入药 ,严重影响了
该药材的质量。
老鹳草属植物的组织 、粉末 、花粉 、X-射线衍射
及相关质量方面已见报道 〔3-6〕 ,但应用分子标记技术
对该属植物进行鉴定和遗传多样性分析的研究却未
见报道 。
本实验在前期工作的基础上运用 RAPD技术建
立 DNA图谱 ,以期达到从分子水平上鉴别不同种老
鹳草的目的 ,并构建亲缘关系谱图 ,探讨属下分类关
系 。
1 材料与方法
实验选用的 8种老鹳草生药材于 2005年 8月
至 9月采得 ,分别取新鲜嫩叶片于 -70℃保存 。详
见表 1。
1.1 基因组 DNA提取 取保存于 -70℃的老鹳
草新鲜嫩叶片 0.5 g,放入研钵用液氮研磨成细粉 ,
再将研好的粉末在解冻的条件下装入 1.5 ml的离
心管 ,迅速加入 700μl65℃预热的 CTAB提取缓冲
液 (2% CTAB:100 mmol/L Tris-HClPH8.0, 20
mmol/LEDTA PH8.0, 0.8 mol/LNaCl, 用前加
1.5%的 β-巯基乙醇),充分混匀后于 65℃水浴保温
1h;再加入 700 μl(24∶1)的氯仿-异戊醇 ,摇动 10
min, 10000 rpm离心 10 min,抽提上清液 ,重复上面
操作 3次 ,直至中间无蛋白层为止 。取上清液 ,逐滴
表 1 材料采集
样品 名称 采集日期 采集地点 鉴定结果
1 鼠掌老鹳草 2005、 8 辽宁省沈阳市北陵 Geraniumsibiricum
2 长白老鹳草 2005、 8 吉林省长白山二道白河镇 G.paishanense
3 北方老鹳草 2005、 8 吉林省长白山二道白河镇 G.erianthum
4 突节老鹳草 2005、 9 辽宁省千山 G.krameri
5 老鹳草 2005、 8 辽宁省沈阳市北陵 G.wilfordii
6 块根老鹳草 2005、 8 黑龙江省桂木斯市四丰山 G.dahuricum
7 老蕊老鹳草 2005、 8 黑龙江省佳木斯市四丰山 G.eriostemon
8 灰背老鹳草 2005、 8 吉林省白河镇前四合村 G.wlasowianum
注:凭证标本由王冰教授鉴定 ,现保存于本院植物教研室
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DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2008.12.011
转入装有 2倍体积的(-20℃)预冷无水乙醇中 ,颠
倒均匀 , -20℃保存 0.5 h;用玻璃钩挑出 DNA,
12000rpm离心 10 min,吸干乙醇;用 70%乙醇洗涤
沉淀 2次 ,在超净工作台上吹干;再用 100 μl的 TE
(d2H2O)溶解 。取得到的 DNA溶液 6 μl,与溴酚兰
指示剂 1∶5混匀 ,以 1.4%琼脂糖凝胶(含 0.5 μg/
mlEB)电泳检测片段大小 , UV-755B紫外分光光度
计检测 A260与 A280值并定量。由表 2可看出 ,提取
的基因组 DNA的 A260与 A280值大部分在 1.8 ～ 2.0
之间 ,说明各样品 DNA浓度和纯度均满足要求 ,几
乎不含蛋白质 , RNA也基本上被完全降解 ,能够满
足 RAPD反应对 DNA的质量要求。
表 2 供试材料基因组 DNA的紫外分析结果
样品号 1 2 3 4 5 6 7 8
A
260 0.021 0.023 0.020 0.031 0.033 0.019 0.021 0.018
A280值 0.011 0.012 0.011 0.015 0.018 0.010 0.011 0.010
A
260
与 A
280
值 1.910 1.920 1.820 2.070 1.830 1.900 1.910 1.800
浓度(μg/μl) 0.735 0.910 0.700 1.085 1.155 0.665 0.735 0.630
1.2 RAPD方法 以 8个不同种老鹳草药材的
DNA为模板 ,采用不同引物进行扩增 。TaqDNA聚
合酶由北京天根生化公司提供。反应体系为:总体
积 25μl,含模板 DNA20 ng, 引物 0.5 μM, dNTPs
150μM, TaqDNA聚合酶 1U, MgCl2 2.5 mM, 10 ×
Bufer(Mg-free)1 ×, Marker(DNAladder:2000、
1000、750、500、250、100 bp),其余以无菌水补至 25
μl。反应程序为:94℃预变性 1 min, 94℃变性 1
min, 36℃退火 2min, 72℃延伸 2 min,共循环 35次 ,
最后在 72℃延伸 5min, 4℃保存 。
1.3 电泳检测 取 PCR反应产物 6 μl,与溴酚兰
指示剂 1∶5混匀;以 1.4%琼脂糖凝胶(0.5 μg/ml
EB)电泳检测扩增结果。电泳条件:电压 80V,电泳
时间 2.5h;电泳结束后在 GelDoc2000紫外凝胶成
像系统(Bio-Rad)上观察并保存图像。
1.4 RAPD随机引物筛选 10 bp寡核苷酸随机
引物由北京赛百盛生物公司合成 ,共 100条 RAPD
引物 ,用一种材料做完 100对引物后 ,去除没有条带
的引物 ,再用另一种材料依次筛选下去;最后筛选出
扩增条带清晰 、重复性好 、多态性丰富的 11个引物
用于 PCR扩增反应 ,所用引物号 、碱基序列见表 3。
1.5 数据分析方法 电泳谱图中根据分子迁移率
及其有无进行统计 ,具有多态性的带赋值为 “1”,无
此带或模糊不清时赋值为 “ 0”;将数据输入 NT-
SYSpc2.1软件 ,计算遗传相似性系数 ,并用 UPGMA
法聚类得到聚类图。
表 3 11个 RAPD引物的名称和序列
NO 序列(sequence) GC(%)
278 TTCAGGGTGG 60
279 GGGAATTCGG 60
281 GAGCGCCTTA 70
285 GGGAACCCGT 70
286 AGGCCGTATC 60
312 ACGGACGTCA 60
313 CTGAGGTCTC 60
314 AGACCCAGAG 60
315 TCACCAGCCA 60
316 GTTTCGCTCC 60
317 TGATCCCTGG 60
2 结果分析
2.1 多态性引物扩增结果 从 100个 10 bp寡核
苷酸随机引物中筛选得到条带清晰 ,呈现多态性的
引物 11个。运用筛选出的 11个引物对供试材料
DNA进行随机扩增 ,共得到 145条带 ,其中多态性
条带 114条 ,多态性百分率为 78.62%;每个引物检
测到的位点在 7 ～ 18之间 ,平均每个引物可获得 13
个 DNA片段 ,扩增出的 DNA带的分子大小在 100 ～
2000 bp,见表 4;3个多态性最好的引物扩增条带见
图 1。
图 1 引物 313、315、281扩增条带
2.2 遗传相似系数 8种老鹳草属植物间的相似
系数见表 5。从表中可见不同种老鹳草的遗传相似
系数在 0.025 ～ 0.336之间 , 平均相似性系数为
0.179 ,表明不同种间存在较大的遗传差异;突节老
鹳草与块根老鹳草之间的相似系数最高 ,为 0.336,
长白老鹳草与灰背老鹳草 、老鹳草与块根老鹳草 、北
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方老鹳草与毛蕊老鹳草的相似系数也较高 ,分别为
0.334、0.332和 0.331 ,表明两两类型间的亲缘关系
相对较近;而鼠掌老鹳草与长白老鹳草的相似系数
最小 ,为 0.025,表明二者的亲缘关系相对较远 。
表 4 11个随机引物对老鹳草材料的扩增结果
引物 序列 扩增带数 多态带数 多态带的百分率(%)
278 TTCAGGGTGG 11 7 63.63
279 GGGAATTCGG 7 3 42.86
281 GAGCGCCTTA 13 12 92.31
285 GGGAACCCGT 13 7 58.85
286 AGGCCGTATC 12 10 83.33
312 ACGGACTTCA 17 15 88.24
313 CTGAGGTCTC 16 15 93.75
314 AGACCCAGAG 18 15 83.33
315 TCACCAGCCA 13 12 92.31
316 GTTTCGCTCC 13 11 84.62
317 TGATCCCTGG 12 7 58.33
合计 145 114 78.62
表 5 RAPD标记计算出 8种老鹳草间的遗传相似系数
1 2 3 4 5 6 7 8
1 1.000
2 0.025 1.000
3 0.075 0.324 1.000
4 0.271 0.302 0.267 1.000
5 0.056 0.047 0.052 0.135 1.000
6 0.035 0.085 0.270 0.336 0.332 1.000
7 0.067 0.058 0.331 0.285 0.068 0.315 1.000
8 0.014 0.334 0.060 0.197 0.293 0.042 0.310 1.000
图 2 RAPD标记构建的聚类图
2.3 聚类分析 采用 UPGMA类平均法 , 8种老鹳
草的 DNA遗传聚类分析 ,得出各种间亲缘关系的树
状图(图 2)。在相似系数 0.80处 ,可聚为 Ⅰ 、Ⅱ、Ⅲ
类;Ⅰ类包括鼠掌老鹳草 、北方老鹳草 、毛蕊老鹳草
和老鹳草;其中北方老鹳草和毛蕊老鹳草先聚成小
组 ,再与鼠掌老鹳草聚合 ,最后与老鹳草聚合;Ⅱ类
包括长白老鹳草和灰背老鹳草 ,二者聚合成一类;Ⅲ
类由突节老鹳草和块根老鹳草聚合形成 。
3 讨论
3.1 基于 RAPD标记建立起的树状图 ,所有供试
样品的遗传距离均大于零 ,表明不同品种的老鹳草
之间既有相同的遗传背景 ,又存在一定的差异。通
过聚类分析结果可见毛蕊老鹳草与北方老鹳草形态
最为相近 ,均为较粗壮的草本 ,且花较大 , DNA水平
也比较相近 ,首先聚为Ⅰ类 ,同属于小花组的老鹳草
与鼠掌老鹳草也聚为一类;长白老鹳草与灰背老鹳
草均属于匍匐性草本 ,茎比较纤细 ,聚为 Ⅱ类;突节
老鹳草与块根老鹳草分枝较多 ,聚为Ⅲ类;这一结果
与汪劲武 〔7〕研究的传统的分类方法较为一致 。本
实验结果可供开发利用该属植物资源参考。
3.2 按传统分类方法长白老鹳草属于小花组 ,应
与鼠掌老鹳草 、老鹳草聚为一类 ,可实际结果并非如
此。究其原因 ,可能是 RAPD技术本身存在多态性
少和重现性差的缺点:该属全球有 400余种 ,我国有
60多种 ,而本实验所用样品少只有 8种。
参 考 文 献
[ 1] 卫生部药典委员会 .中华人民共和国药典 .一部 .北
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[ 2] 江苏新医学院 .中药大词典 .下册 .上海:上海人民卫
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[ 5] 尹海波 , 康廷国 ,潘荣琛 , 等.老鹳草属两种老鹳草总黄
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(2008-04-09收稿
2008-09-08修回)
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