全 文 ：　　收稿日期:1999-09-02
　　基金项目:四川省科委基金资助项目
作者简介:谭文澄(1937-),男 ,教授
兰属植物DNA指纹图的研究
谭文澄1 , 　方盛国2 , 　谢　海1 , 　戢鹏霄1
(1.四川师范大学 化学与生命科学学院 , 四川成都 610066;　2.四川师范大学 分子生物学研究所 , 四川 成都 610066)
　　摘要:采用 LZF-1寡核苷酸探针和限制性内切酶 Hinf 1 , 检测兰属23样株和石斛属1样株的DNA酶解片
段 , 获得了清晰易读的由 6 ～ 15 条带组成有特异性的遗传指纹图谱.表明:(1)LZF-1 探针能与兰属及石斛
属植物基因组 DNA 中的酶解片段中简单重复序列形成杂交分子 , 证实近缘植物基因组中存在同源 DNA 片
段;(2)在介于 1 ～ 24 kb 的谱带中 ,大红朱砂(A)15条 , 3株红蝉(B)皆12条 , A×B F1 2n =40两株皆11条 ,
2n =80的两株皆 13条 ,朱砂蝉兰8条 , 三青蝉皆11条 ,黄蝉9条 , 两西藏虎头兰皆12条 ,两大花蕙兰皆7条 ,
两碧玉兰皆 8条 ,两雪兰皆 6条 ,雪兰×大花蕙兰 8条 ,墨兰 8条 ,石斛兰属的熊猫兰 7条;(3)各种植物谱带
各具特异性 , 可见其间亲缘关系不同.相同种植物谱带条数一致 , 电泳迁移率即片段的分子量区间类似 , 此
方法可得到具个体特异的 DNA 指纹图 ,可进一步应用于兰属植物的分子遗传学分析.
关键词:兰属;石斛属;LZF-1 探针;荧光素标记;DNA 指纹图
中图分类号:Q943　　文献标识码:A　　文章编号:1001-8395(2000)04-0407-05
0　引言
选用适当的 DNA 指纹探针和限制性内切酶 ,
可对动物 、植物及微生物的限制性片段长度多态性
(RFLP)作出遗传 分析[ 1] , 最 早于 1988 年由
Jeffreys
[ 2] 对人的血红蛋白基因研究中被发现而发展
起来 ,在人类[ 3 , 4] 及动物[ 5] 遗传学 、法医学等方面 ,
陆续有新的发现[ 6～ 8] .近年来在植物 DNA指纹研究
中也有逐步增多的报道 , 如水稻[ 9] , 黑莓和悬钩
子[ 10] ,苹果属和李属等[ 11] ,以及玉米 、番茄 、莴苣 、芸
苔、马铃薯等 ,可见此技术也正引起国内外植物遗传与
育种学者们的广泛注意.
在植物新品种选育上 ,掌握亲子间性状表现与
遗传传递规律是很重要的 , DNA 指纹的精细分析 ,
将指导育种设计 ,对亲本选配和杂种性状预测等将
有较为准确的遗传学根据.
我们采用 LZF-1 DNA指纹探针[ 12] ,对国产兰属
23样本及石斛属 1样本的 DNA 指纹图作了初步研
究 ,所试用荧光素标记法[ 13] 在植物 DNA 指纹研究
中尚属首次 ,许多兰属植物的 DNA 指纹图亦为首
次报道 ,为兰属各种之间的亲缘关系之确定 , DNA
指纹技术在兰属中的应用积累基础资料 ,也为荧光
素标记方法在植物 DNA 指纹分析中应用提供依
据.
1　材料与方法
1.1　材料　用于本研究的兰属植物共 23样本 ,石
斛属 1样本 ,详见表 1.
1.2　试剂与设备　LZF-1 DNA指纹探针(北京 ,金
河应用生物技术研究所),限制性内切酶 Hinf 1(华
美生物公司),T4 多核苷酸激酶(瑞典 Pharmacia),荧
光素-11-dUTP ,鲁米诺 ,抗荧光素-HRP 缀合物 ,硝酸
纤维素(英国Amersham),核酸电泳系统等.
1.3　实验方法　
1.3.1　DNA提取　取保存在常温冰箱结冻室中 1
～ 21号兰叶样本约 0.5 g ,其中 8 ,22 ～ 24号样本是
新鲜的试管苗原球茎及小苗约 1 g ,剪碎置研钵中
加液氮作冷冻研磨 ,使成粉末.实验操作及药品等
参见文[ 14]所述.
1.3.2　酶切 、电泳按文[ 14] 　加入DNA-Hind Ⅲ为
分子量标准 ,电泳时间延长至约 40 h.电泳结束取
出琼脂糖凝胶膜 ,置白瓷盘中 ,蒸馏水洗涤 5 min ,
变性液处理 30 min ,中和液浸泡30 min ,在胶膜上复
　　2000年 7 月　第 23 卷　第 4期 四川师范大学学报(自然科学版)Journal of Sichuan Normal University(Natural Science) July , 1999　Vol.23 , No.4　
盖一张硝酸纤维素膜作 Southern转移 ,用 20×SSC
将DNA从胶膜上转移到硝酸纤维素膜上 ,室温 12
h ,取下硝酸纤维素膜在清水中漂洗 5 min ,80 ℃下
干燥约 1 h ,使DNA固定在膜上 ,4 ℃干燥保存膜备
用.
表 1　受试植物样本及检测结果
样本号 植　物　名　称 谱带条数 谱带分子量范围(kb) 同位点＊ 备注
1
大红朱砂(A)Cymbidium longibracteatum
var.rubisepalum Y.S.Wu var.nov. 15 1.3～ 21.0
2
`醉妃 之一 ,系大红朱砂(A)×红蝉(B)的
F1 , 2n=40 11 2.0～ 12.6
3 `醉妃 之二 ,同上 11 2.0～ 12.6
4
`富丽红 ,系大红朱砂(A)×红蝉(B)的 F1 ,
2n=80 13 2.0～ 19.0
5 `拟富丽红 同上 13 2.3～ 19.0
6
红蝉(B)之一 Cymbidium iridioides D.Don.
cv.“Hong Chan Lan” 12 1.5～ 22.0
7 红蝉(B)之二,拉丁名同上 12 1.5～ 21.0
8 红蝉(B)之二(试管原球茎及小苗),拉丁名同上 12 1.5～ 22.0
9
朱砂蝉兰 Cymbidium iridioides D.Don.cv.
“Zhu Sha Chan Lan” 8 2.4～ 9.9
10 青蝉之一 Cymbidium hookerianum Rchb.f. 11 3.7～ 16.1
11 青蝉之二 ,拉丁名同上 11 3.8～ 14.5
12 青蝉之三 ,拉丁名同上 11 3.5～ 15.0
13 黄蝉 Cymbidium iridioides D.Don. 9 1.2～ 12.2
14 西藏虎头兰之一 Cymbidium tracyanum Rolfe 12 1.5～ 22.0
15 西藏虎头兰之二 ,拉丁名同上 12 1.6～ 23.0
16 大花蕙兰之一 C.sp. 7 6.0～ 23.5
17 大花蕙兰之二 C.sp. 7 6.1～ 23.0
18
碧玉兰之一 C.hookerianum var.lowianum
(Rohb.f.)Y.S.Wu et S.C.Chen. 8 1.4～ 18.0
19 碧玉兰之二 ,拉丁名同上 8 1.5～ 18.2
20 雪兰之一 Cymbidium goerigii var.papyrif lorum 6 1.7～ 7.9
21 雪兰之二 ,拉丁名同上 6 1.6～ 7.9
22
雪兰 C.goerigii var.papyrif lorum ×大花蕙
兰(试管原球茎及小苗)C.sp. 8 2.3～ 22.0
23 墨兰 C.sinene(andr)Willd(试管原球茎及小苗) 8 2.1～ 21.0
24
熊猫兰Dendrobium sp.“Panda”(试管原球茎
及小苗) 7 1.8～ 9.7
　
5
5
　
3
3
　　　　
2
2
　
2
2
　
3
3
　　
2
2
2
2
1
1
2
2
2
2
　
0
0
1
1
1
2
3
2
3
2
4
　　　　　　　＊同种不同个体间同位点谱带条数.
备注:各样品的提供者鉴定人分别是:1.吴汉珠;2.谭文澄;3.邓承康;4.李文安.
408　　 四川师范大学学报(自然科学版) 23 卷
1.3.3　探针标记 　无菌水稀释 LZF-1探针至 100
×10-12 mol ,依次加入 LZF-1探针 100 μL ,荧光素-
11-dUTP 10 μL ,缓冲液 16μL ,T4核苷酸激酶 16μL ,
加水至 260 μL ,小管抽吸多次使混匀 ,置 37 ℃ 60
min ,检测标记结果.
1.3.4　预杂交 ,杂交　取出膜置 1×TAE 20 mL , 42
℃作预杂交 ,加200μL HC阻断剂 ,10min ,加100μL
探针杂交 45 min ,加 FGD(发光底物)200 μL , 5 min ,
接洗膜
1.3.5　洗膜　6×SSC 0.1%SDS 振荡洗涤 5 min ,1
×SSC 0.1 SDS置 42 ℃温育 15 min ,吸干待用.
1.3.6　荧光自曝光和显影　将杂交后的硝酸纤维
素膜和X光胶片叠合在暗匣中使荧光给胶片曝光3
～ 5 d ,按常规作胶片显影 ,制作照片.
2　结果与讨论
本研究采用 LZF-1寡核苷酸探针及限制性内
切酶 Hinf 1 ,以荧光素标记法[ 13] ,检测了兰属 23样
本和石斛属1样本的DNA酶解片断 ,获得了清晰易
读的由 6 ～ 15条谱带组成的各具特异性的遗传指
纹图谱 ,见图 1所示.结果表明:
(1)所用 LZF-1探针可与兰属及石斛属(共 24
样本)基因组 DNA中简单重复序列杂交 ,兰属与石
斛属各植物间存有同源 DNA 片段.探针检测的灵
敏度很高 ,初步判断仅需兰鲜叶 0.2 g 和原球茎等
0.4 g即足够.
(2)在介于 1.0 ～ 24.0 kb的谱带中 ,大红朱砂
(A)15条 ,三株红蝉(B)皆 12条 ,A×B的 F1 2N=
40 ,两株皆11条 ,A×B F1 2N=80 ,两株皆 13条 ,朱
砂蝉兰8条 ,三青蝉皆 11条 ,黄蝉 9条 ,两西藏虎头
兰皆 12条 ,两大花蕙兰皆 7条 ,两碧玉兰皆 8条 ,两
雪兰皆 6条 ,雪兰×大花蕙兰 8条 ,石斛兰属的熊
猫兰 7条.为节省篇幅 ,资料并入表 1中.
　　(3)各种植物谱带各具特异性 ,可见其间亲缘
关系不相同.相同种植物谱带数一致 ,电泳迁移率
即片段的分子量区间相当类似 ,从红蝉 、青蝉 、西藏
虎头兰等两三个个体的谱带比较可以发现 ,不同个
409第 4 期 谭文澄等:兰属植物 DNA指纹图的研究 　　
体间同位点带数很少 ,红蝉 3个体间同位点带数仅
2 ～ 3条 ,青蝉 3个体间同位点带数仅 1 ～ 2条 ,两西
藏虎头兰间同位点带数仅 2条 ,说明本检测方法准
确性较高 ,谱带具有个体特异性 ,详见表 1.
(4)样本 1 ～ 8号为一杂交组合 ,其间同位点谱
带条数如表 2所示.从表 2中资料可见 ,大红朱砂
同F1 4个体间同位点仅0 ～ 2条 ,与文[ 14]采用 JH-
12.8探针所得1 ～ 2条相类似 ,因而不能确定它是
真亲本 , “醉妃”之一与之二间 ,以及“富丽红”与红
蝉之一间有同位点带数 5条 ,可见它们间亲缘关系
最近 , “醉妃”之二与“富丽红”以及“富丽红”与“拟
富丽红”之间都有 3 条同位点 ,表示出亲缘关系较
近.
表 2　兰属 1～ 8 号样本 DNA 指纹图谱带数
样本号 植物名称 本植物显现的带数
各植物间同位点带数
8 1 2 3 4 5 6 7
1 大红朱砂 15 0 1 1 2 3 1 1
2 `醉妃之一 11 5 2 2 2 1 2
3 `醉妃之二 11 3 1 1 3 2
4 `富丽红 13 3 5 2 0
5 `拟富丽红 13 1 0 3
6 红蝉之一 12 3 2
7 红蝉之二 12 2
8 红蝉之三 12
　　在 14年前做杂交时是以大红朱砂为母本 ,以红蝉
为父本 ,但纵观全部现已获得的资料 ,尚难以断定 ,采
样的1为母本 ,6 ,7 ,8中有一个体为其F1 的父本.这一
杂交组合以及各种之间和各个体之间的遗传距离 ,尚
需进一步扩大个体数 ,选用更多探针-酶的组合 ,作深
入探讨才能加以确定.
致谢　部分兰叶样品分别由四川省农科院吴
汉珠教授 、成都市杜甫草堂邓承康先生提供并鉴
定.实验于本校分子生物学研究所分子遗传实验室
进行 ,在此一并致谢.
参考文献
1　Ryskov A P , Jincharadze A G , Prosnyak M I , et al.M 13 phage DNA as a univissal marker for DNA fingerprinting of animals , plants ,
and microorganisms[ J] .FEBS Lett , 1988 , 233:388～ 392.
2　Jeffreys A J , Wilson V , Thein S L.Hypervariable “minisatellite” regions in human DNA[ J] .Nature , 1985 , 314:67～ 74.
3　蓝翎 ,张小为 , 霍振义 ,等.用寡核苷酸探针(CAC)5/(GTG)5 进行人的 DNA 指纹分析[ J] .遗传学报 , 1993 , 20(1):1 ～ 6.
4　方盛国 ,冯文和 , 张安居 ,等.大熊猫亲子鉴定[ J] .四川大学学报(自然科学版), 1994 , 31(3):389～ 395.
5　李伯龄 ,倪锦堂 , 储小兰 ,等.DNA 探针在法医学中的应用研究[ J] .遗传学报 , 1989 , 16:470 ～ 474.
6　蓝翎 ,张小为 , 段秉章 ,等.寡核苷酸探针进行 DNA指纹分析在法医学上应用的评价[ J] .遗传学报 , 1993 , 20(5):404～ 410.
7　孟安明 ,齐顺章 , 周顺伍 ,等.家禽遗传指纹图研究初报[ J] .遗传 , 1993 , 15(2):9 ～ 13.
8　郑康乐 ,沈波 , 于飞 ,等.水稻 DNA 限制性片段长度多态性的研究[ M] .南京:江苏科学技术出版社 , 1991.117～ 121.
9　Dallas J F.Detection of DNA “ fingerprints” of cultivated rice by hybridization with a human minisatellite probe[ J] .Proc Natl Acad Sci
USA , 1988 , 85:6831～ 6835.
10　Nybom H , Schaal B A , Rogstad S H.DNA ` fingerprints can distinguish cultivars of blackberries and raspberries[ J] .Acta Hortic ,
1989 , 262:305～ 310.
11　Nybom H , Rogstad S H , Schaall B A.Genetic variation detected by use of the MB “ DNA fingerprint” probe in Malus , Prunus , and ru-
bus(Rosacea)[ J] .Theor Appl Genet , 1990 , 79:153～ 156.
12　方盛国 ,李丹 , 陈冠群 ,等.LZF-1 探针及草鱼等 3 种鱼类的 DNA 指纹图的初步研究[ J] .四川师范大学学报(自然科学
版), 1993 , 16(5):79～ 82.
13　申滨 ,邹浪萍 , 褚嘉佑 ,等.荧光素标记 JH12.6探针进行的人 DNA指纹图分析[ J] .遗传学报 , 1995 , 22(3):167～ 170.
410　　 四川师范大学学报(自然科学版) 23 卷
14　谭文澄.兰属 4 植物 DNA指纹的初步研究[ J] .四川师范大学学报(自然科学版), 1997 , 20(1):67～ 71.
15　Rogstad S H , Patton H J C , Schaal B A.MB repeat proba detects DNA minisatellite like sequences in gymnosperms and angiosperms
[ J] .Proc Natl Acad Sci USA , 1988 , 85:9176～ 9178.
DNA Fingerprint Patterns in Cymbidium
TAN Wen-cheng1 , 　FANG Sheng-guo2 , 　XIE Hai1 , 　JI Peng-xiao1
(1.College of Chemistry and Life Science , Sichuan Normal University , Chengdu 610066 , Sichuan;
2.Institute of Moleculer Biology , Sichuan Normal University , Chengdu 610066, Sichuan)
Abstract:The authors detect DNA fragment of 23 sample in Cymbidium and one sample ofDendrobium 1 plant sample with oligonucleot-
ede probe LZF-1 and restriction endonuclease Hinf 1 , determined highly individual-specific heredity DNA fingerprint parttens with 6-15 bands.
Results are as follows.(1)Oligonucleotid probe LZF-1 can hybrid with simple repeated sequences of DNA fragmenitsfrom Cymbidium and
Dendrobium plants , confirmed that homologous DNA fragments exist in near relation plants genome.(2)Among the 1-24 Kb fragments there
are 15 bands from sample(A):Cymbidium Between longibracteatum var.rubisepanum Y.S.Wu nov.;there are 12 bands from all of three
plants sample of(B):C.iridioiedsesD.Don.cv.“Hong Chan Lan”;there are 11 bands from all of (A)×(B)F12N=40 two plants sam-
ple;there are 13 bands from all of(A)×(B)F1 2N=80(tetraploid)two plants sample;there are 8 bands from C.iridioides D.Don cv.
“ Zhu Sha Chan Lan” ;there are 11 bands from all of C.tracyanum Rolfe.two plants sample;there are 7 bands from (C) sample:
Cymbidium hybrid;there are 6 bands from all of(D)sample:C.goerigii var.papyriforum two plants;there are 8 bands from(D)×(C);
there are 8 bands from all of C.hookerianum var.lowianum(Rchb.f.)Y.S.Wu et S.C.Chen two plants sample;there are 8 bands from
C.sinense(Andr.)Willd.there are 7 band fromDendrobium sp.“ Panda”.(3)The species-specific DNA fingerprint patterns showed clear-
ly that among the detected species relationships are different.However , in that among the detected species relationships are different , in same
species , the number of fingerprint fragments from different individual is identical.Electrophoretic mobility or molecular weight region of DNA
restriction fragment is also similar.This method provides an individual-specific DNA fingerprint pattern used in Cymbidium genetic analysis..
Key words:Cymbdium ;Dehndrobium ;Oligonucleotede probe LZF-1;Fluorescein labelling;DNA Fingerprint patterns
(编辑　余　毅)
411第 4 期 谭文澄等:兰属植物 DNA指纹图的研究