全 文 ：兰属杂交兰绿翡翠组培变异的
RAPD检测与鉴定
肖文芳， 李 佐， 尤 毅， 陈和明， 吕复兵
（广东省农科院环境园艺研究所/广东省园林花卉种质创新综合利用重点实验室， 广东 广州 510640）
摘 要：从兰属杂交兰绿翡翠组培群体中筛选得到表型突变体 8 株，与正常植株相比多分蘖且矮化，部分植株
叶卷曲。 利用 50条随机引物对突变体和正常株进行 RAPD检测，结果显示，RAPD检测对突变体检测有效，5条动态
性引物的扩增结果都是正常株比变异株的扩增条带多，表明这类变异很有可能是染色体缺失引起的。 另外，发现突
变体存在个体差异，并与表型的个体差异不对应。
关键词：杂交兰； RAPD； 组培变异； 分蘖
中图分类号：S685.31;Q319 文献标识码：A 文章编号：1004-874X（2014）21-0135-05
Detection and identification of high-tillering and dwarf
mutants from Cymbidium hybrids ‘Lv Fei Cui’ by RAPD
XIAO Wen-fang, LI Zuo, YOU Yi, CHEN He-ming, LYU Fu-bing
(1.Floriculture Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Key Lab
of Ornamental Plant Germplasm Innovation and Utilization, Guangzhou 510640, China)
Abstract: Eight high-tillering and dwarf mutants were screened from Cymbidium hybrids‘Lv Fei Cui’, some mutants’
leaves were curly. All the mutants were compared and analyzed with the control (wild-type Cymbidium hybrids) by RAPD
using 50 UBC arbitrary primers. The results showed that RAPD analysis was useful for the mutants, the polymorphism
between the mutants and the control was detected by using 5 primers and the mutants showed more polymorphic fragments,
which suggested that this kind of variation was likely to be caused by lack of chromosome. Further, different incised mutant
had different polymorphic fragments with wide individual variability.
Key words: Cymbidium hybrids; RAPD; somaclonal variation； tiller
兰科植物是开花植物中最大的科，有 750 多个属，
25 000 个原生种， 地理分布广， 其中中国有 1 200 多
种。 在我国传统兰花生产中， 蝴蝶兰的产业化程度最
高，其次是大花蕙兰。 但是，近年来一类称为杂交兰的
新型兰花在市场上逐步流行开来。 杂交兰是通过国兰
与大花蕙兰及国兰种间杂交选育而来， 它综合了父母
本的优点，具有很高的观赏价值。 在广东，杂交兰经过
几年的试种试销受到消费者的青睐， 种植规模也逐年
提高。 目前，市场上常见的杂交兰品种仅有 10 多个，其
中绿翡翠是较受欢迎的品种之一。 兰属杂交兰的规模
化生产主要通过组织培养生产分生苗和分株两条途径
繁殖种苗，花农一般购买瓶苗进行栽培。 但是，以快繁
为目的的组织培养，为了追求高增殖率，都在诱导和增
殖阶段的培养基中添加较高浓度的激素， 繁殖体长时
间在高浓度激素的作用下往往发生不良变异。 杂交兰
相对于蝴蝶兰等兰花来说，组培变异率非常低，但变异
是绝对的，在长时间的组培继代过程中，仍有一定几率
产生突变体。 而这类变异的出现对生产十分不利，必须
在瓶苗时期就及时剔除，否则会造成严重的经济损失。
RAPD（random amplified polymorphic DNA）是一种
以 PCR 技术为基础的核苷酸序列多态性检测方法，该
方法无需了解 DNA 序列信息，快速易操作，是突变体
检测和筛选的常用方法 [1]。 目前，国内外对于多种植物
的组培突变体检测都有报道 [2-4]，几种常见兰科植物的
品种变异检测也大都采用 RAPD 检测 [5-7]，RAPD 检测已
经成为快速检测突变体的常规方法。 而 RAPD 在兰属
植物上的应用主要集中在亲缘关系的鉴定及反应体系
的优化，而对变异检测则未见报道。
收稿日期：2014-07-08
基金项目： 广东省专业镇中小微企业公共服务平台建设项
目 （2012B091400032）；广东省中国科学院全面战略合作项目
（2012B091100255）
作者简介：肖文芳（1985-），女，硕士，助理研究员，E-mail:
smilehigh126@126.com
通讯作者：吕复兵（1971-），男，博士，研究员，E-mail: 136603
73325@163.com
广东农业科学 2014 年第 21期 135
C M Y K
DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2014.21.029
表 1 9 个样品的 DNA 检测质量和浓度
样品
WT
M1
M2
M3
M4
M5
M6
M7
M8
A260/A280
1.82
1.79
1.82
1.79
1.71
1.74
1.81
1.82
1.89
A260/A230
2.09
2.12
1.86
1.97
1.39
1.51
1.97
2.03
2.43
浓度（ng/μL）
156.1
98.3
59.9
88.3
92.5
74.5
102.9
79.1
79.9
M MT M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8
15000
10000
7500
5000
2500
1000
250
M:15000 bp Marker；WT,M1~M8：杂交兰样品编号
图 1 9 个样品的 DNA 凝胶电泳图谱
本研究以杂交兰绿翡翠正常株和表型变异株为试
验材料， 探索 RAPD 检测技术在杂交兰组培突变体检
测上的可行性，旨在建立一套比较完善，适用于大多数
杂交兰突变体检测的技术。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 杂交兰植株 供试杂交兰绿翡翠植株为购自广
东省韶关市翁源县江尾镇仙邑兰苑的瓶苗经栽培半年
的植株，其中正常株 4 株，不正常株 8 株。 不正常株与
正常株相比，植株明显矮化，叶细长甚至扭曲，幼苗期
就不断进行分蘖产生一至多个侧芽。 正常株采用混合
采样，分别从 4 株中采集 0.1 g 嫩叶，混合为一个样品，
以消除个体差异，命名为 WT；从 8株变异株（编号 M1~
M8）分别采集 0.4 g嫩叶。
1.1.2 试剂及仪器 化学试剂均购自广州化学试剂
厂，基因组 DNA 提取试剂盒为天根生物科技（北京）有
限公司的新型植物基因组 DNA提取试剂盒。
1.1.3 RAPD 引物 50 条 10 碱基随机引物筛选自国
内外文献[8-14]，由生工生物工程（上海）股份有限公司
合成。
1.1.4 PCR反应试剂 TaqDNA聚合酶使用 Takara 公
司的 TaqTM。
1.2 试验方法
1.2.1 总 DNA提取与检测 杂交兰基因组 DNA 提取
材料采用嫩叶 0.2 g，按照 DNA提取试剂盒说明书的操
作步骤进行，提取的 DNA 溶解在 80 μL 1×TE 溶液中。
取 DNA 溶液 2 μL 于 Thermo 的 Nanodrop 2000C 核酸
蛋白检测系统上检测 DNA 的纯度及浓度，根据检测结
果将样品 DNA浓度调节到 20 ng/μL。
1.2.2 RAPD 反应体系 RAPD 反应采用 25 μL 体
系：Taq 酶 1 U（5 U/μL），Primer(10 μmol/L)1 μL，模板
DNA(20 ng/μL) 2 μL。 Mg2+浓度及 dNTPs浓度进行两因
素多水平筛选，Mg2+浓度（25 mmol/L）设 1.2、1.6、2.0、2.4
μL 共 4 个水平，dNTPs 浓度 （2.5 mmol/L） 设 0.8、1.2、
1.6、2.0、2.4 μL 共 5 个水平。 RAPD 反应程序：94℃ 3
min；94℃ 45 s、38℃ 1 min、72℃ 1 min 30 s，45 个循环；
72℃ 10 min，4℃保存。 所有反应 3次重复。
1.2.3 琼脂糖凝胶电泳检测 25 μL反应溶液中加入 8
μL 6×loading buffer，混匀后，取 10 μL上样到 1.5%琼脂
糖凝胶上，于 1×TAE缓冲液中 80 V恒压电泳 1 h。
2 结果与分析
2.1 DNA提取结果
从表 1、图 1 可知，利用天根的基因组提取试剂盒
提取的 DNA质量及浓度都比较好，但是普遍存在 RNA
污染，证明试剂盒提取第一步中的 RNA 酶的降解作用
较小，可以适量增加 RNA 酶的量，并延长降解时间以
去除 RNA 污染。 不过 RNA 污染对于 RAPD 检测的影
响较小， 在此试验中提取的 DNA 足够进行后续试验。
证明此 DNA提取方法适用于杂交兰变异检测。
2.2 RAPD反应体系筛选结果
建立 Mg2+浓度梯度及 dNTPs 浓度梯度试验（表2），
通 过 对 2 个 样 品 （WT、M6） 和 2 个 引 物 〔S198
(CTGGCGAACT)、S199(GAGTCAGCAG)〕的 3 次重复检
测 ， 确 定 采 用 Mg2 +（25 mmol/L）2.0 μL、dNTPs （2.5
mmol/L）1.2 μL 的反应体系， 即编号为 12 的反应体系
进行后续的 RAPD检测，试验电泳结果见图 2。
2.3 引物筛选
9 个样品分别用 50 条待选引物进行 PCR 反应及
电泳检测，筛选条带清晰，最后筛选出结果具有多态性
的引物 5条（表 3）。
2.4 RAPD检测
经过初筛和复筛， 找到 5条引物能在正常株型与
变异株型间扩增出多态性条带， 经 3 次重复确定扩增
136
C M Y K
2000
1000
750
500
250
100
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 16 16 17 18 19 20 1 2 3 4
S198
M6WT
S198
M 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 16 16 17 18 19 20 1 2 3 4 5 6 7 8
S199
M6 WT
S198
2000
1000
750
500
250
100
M 9 10 11 12 13 14 16 16 17 18 19 20 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
WT
S199 S199
M6
2000
1000
750
500
250
100
S199
M6
M 13 14 16 16 17 18 19 20
2000
1000
750
500
250
100
M: 2000 bp Marker; WT, M6: 样品编号; S198, S199：引物名称; 1~20: 反应体系编号
图 2 Mg2+浓度及 dNTPs 浓度筛选电泳结果
dNTPs 浓度（2.5mmol/L）
0.8 μL
1.2 μL
1.6 μL
2.0 μL
2.4 μL
0.8 μL
1.2 μL
1.6 μL
表 2 Mg2+浓度梯度及 dNTPs 浓度梯度
序号
1
2
3
4
5
6
7
8
Mg2+浓度（25mmol/L）
1.2 μL
1.2 μL
1.2 μL
1.2 μL
1.2 μL
1.6 μL
1.6 μL
1.6 μL
9
10
11
12
13
14
15
16
1.6 μL
1.6 μL
2.0 μL
2.0 μL
2.0 μL
2.0 μL
2.0 μL
2.4 μL
2.0 μL
2.4 μL
0.8 μL
1.2 μL
1.6 μL
2.0 μL
2.4 μL
0.8 μL
Mg2+浓度（25mmol/ L） dNTPs 浓度（2.5mmol/L）序号
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C M Y K
S8 S39 S425
M WT M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8WT M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 WT M1 M2 M3 M4 M5
2000
1000
750
500
250
100
S425 S446 S495
2000
1000
750
500
250
100
M6 M7 M8M WT M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 WT M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8
M：2000 bp Marker;WT，M1~M8：杂交兰样品编号；S8、S39、S425、S446、S495：引物编号
图 3 9 个杂交兰样品的 5 个引物的 RAPD 检测结果
表 3 杂交兰选用引物及其序列
引物名称
S8
S39
S425
引物序列
GTCCACACGG
CAAACGTCGG
ACTGAACGCC
引物名称
S446
S495
引物序列
CCACGGGAAG
GGGTAACGTG
结果稳定，多态性清楚。 经过 RAPD 检测可以发现，正
常杂交兰植株与疑似变异植株之间的扩增结果不一
样， 表明疑似的变异杂交兰植株基因组的确发生了变
异。5条引物的扩增结果都是正常株比变异株的扩增条
带多，表明这类变异很有可能是染色体缺失引起的。 并
且变异植株之间也存在差异，M3 和 M8 的扩增结果与
其他变异植株并不相同， 表明疑似的杂交兰变异存在
不同种变异。 但是在表型上来看，在变异株中间表型特
异（叶子表现出细长并卷曲）的 M1 和 M5 的扩增结果
并未表现出特殊，有两种可能性：一是这种表型的变异
可能不是来自于基因组变异， 而是其他环境因素造成
的；二是筛选出的引物没有覆盖到这种变异，未能检测
出与此变异相关的基因片段。 而 M3与 M8的表型未发
现特异变异，基因组却存在特异变异，可能是由于该基
因组的变化为引起表型变异， 或者是引起的表型变异
不易用肉眼观察到。
3 结论与讨论
随着国民生活水平的不断提高， 花卉市场的发展
前景也越来越好，作为全国著名的花卉城市，广东省的
花卉产业正处于蓬勃发展期。 新型花卉的出现更为花
卉产业注入了新的活力。 杂交兰作为一种兼具父母本
优点的新型兰花，具有良好的市场前景。 但是由于杂交
兰产业刚刚起步， 生产方面还存在一些急需解决的问
题，其中最主要的问题就是种苗质量。 种苗的质量直接
影响了植株的生长周期及生长状况， 进而影响生产成
本和销售金额。 杂交兰种苗生产采用组织培养的方法，
一定程度上保证了种苗的一致性及品质。 但是，组培苗
存在一个很大的隐患，就是组培过程中的变异问题。
前人的生产经验表明， 杂交兰相较于其他兰花的
组培苗来说，组培变异率相对较低。 但变异是绝对的，
本试验采用的材料就是典型例子， 由于在购买种苗时
未进行检测， 种植半年后才发现种苗大部分发生了变
异，不能继续种植销售，经济损失惨重。 因此，建立杂交
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兰品种变异检测是杂交兰生产过程中亟待解决的问
题，对控制种苗的优良种性具有重大意义。 工厂化育苗
生产规模大，要求种苗变异检测快速有效。 目前，国内
对品种的遗传变异检测还停留在形态学鉴定水平。 但
是， 植株的基因水平变异并不全部能在表型上表现出
来， 比如本研究的试验材料 M3 和 M8 存在特异变异，
表型并未表现或表现不明显。 相对于 AFLP、SSR 等分
子检测技术来说，RAPD检测技术方便快捷，成本低，适
用性广，对样品 DNA 要求低，是一种非常适用于大规
模组培苗生产变异检测的基因检测方法。 兰科植物中
已有多种建立了变异检测体系， 但是对杂交兰的研究
则未见报道。本试验采用试剂盒提取 DNA，快速无毒副
作用，RAPD反应体系及反应条件重复性强， 为杂交兰
的大规模种苗变异检测提供了强有力的工具。
另外， 本试验所使用的突变体材料也将为兰属植
物的分子育种提供新的材料。 野生兰花是靠种子传播
和自然分蘖繁殖的。 目前一些珍稀名贵的兰花品种不
能通过组培繁殖，主要也是通过分蘖繁殖，如何提高兰
花的分蘖率是兰花育种中一个重要的研究方向。 但是，
在工厂化组培生产种苗的过程中，过早分蘖，特别是开
花前分蘖，是不利于生产的，如何在开花前抑制兰花的
分蘖也是兰花生产中的一个重要的研究方向。 目前，兰
花分蘖方面的研究主要集中于激素对其影响， 对分蘖
的分子机理研究基本没有[15-17]。 而在水稻等禾本科植物
中 ， 利用分蘖突变体已发现多个与分蘖相关的基
因 [18-19]。本试验所用材料经 RAPD检测确定为自然的多
分蘖突变体， 能够为后续研究兰花的分蘖繁殖提供优
良的试验材料。
参考文献：
[1] Williams J G K, Kubelik A R, Livak K J, et al. DNA
polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful
genetic markers[J].Nucleic Acids Reserch,1990,18:6531-6535.
[2] 王磊,宿红艳,顾亮,等.7 中蝴蝶兰红花品种的遗传多样性分
析[J].鲁东大学学报(自然科学版),2010,26(3):250-254.
[3] 孙晓莉 ,章铁 ,刘秀清 .蝴蝶兰 60Coγ 射线辐照材料的 RAPD
分子标记研究[J].中国农学通报,2009,25(1):156-159.
[4] 崔广荣 ,张子学 ,张从宇 ,等 .蝴蝶兰 NaN3 离体化学诱变及再
生植株 RAPD检测[J].热带作物学报,2010,31(4):592-599.
[5] 明凤,董玉光,娄玉霞,等.蝴蝶兰不同花色品种遗传多样性的
RAPD分析[J].上海农业学报,2003,19(2):44-47.
[6] 章宁,苏明华,徐夙侠,等.应用 RAPD 技术辅助蝴蝶兰辐射育
种[J].亚热带植物科学,2007,36(3):19-22.
[7] Goh M W K, Kumar P P, Lim S H, et al. Random amplified
polymorphic DNA analysis of the moth orchids, Phalaenopsis
(Epidendroideae: Orchidaceae)[J]. Euphytica,2005,141:11-22.
[8] 胡薇 ,黄儒珠,潘晓华 ,等.建兰 38 个品种的 RAPD 分析[J].园
艺学报,2008,35(2):289-294.
[9] 罗远华,余志金,莫光武,等.石斛兰品种遗传变异的 RAPD 检
测[J].安徽农业科学,2009,37(5):11889-11891.
[10] 罗远华,莫饶,蔡林宏,等.文心兰品种变异 RAPD 分子检测技
术的建立及应用[J].热带农业科学,2009,29(7):28-32.
[11] Khoddamzadeh A A, Sinniah U R, Kadir M A, et al. Detection
of somaclonal variation by random amplified polymorphic DNA
analysis during micropropagation of Phalaenopsis bellina
(Rchb.f.) Christenson[J].African Journal of Biotechnology, 2010,
9(40): 6632-6639.
[12] Hao Y J, Deng X X. Occurrence of chromosomal variations and
plant regeneration from long-term-cultured citrus callus [J]. In
Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant, 2002, 38:
472-476.
[13] Chen W T, Chen T M, Fu Y M, et al. Studies on somaclonal
variation in Phalaenopsis[J]. Plant Cell Reports,1998,18:7-13.
[14] Chen Y H, Tsai Y J, Huang J Z, et al. Transcription analysis of
peloric mutants of Phalaenopsis orchids derived from tissue
culture[J]. Cell Research, 2005, 15(8): 639-657.
[15] 夏鸿西 ,朱利泉 ,张明 ,等 .植物生长调节剂对石斛生长的影
响[J].园艺学报,1999,26(4):275-276.
[16] 郑立明.植物生长调节剂对中国兰花无性繁殖及生长发育影
响的试验[J].浙江教育学院学报,2004(1):65-69.
[17] 郑疏影 ,潘远智 ,孙振元.植物生长调节剂对大花蕙兰分蘖及
生长发育的影响[J].北方园艺,2007(1):85-87.
[18] 王海湃,张淑英,包劲松,等.水稻多分蘖矮杆突变体 htd1-2 的
遗传分析和基因定位[J].遗传,2009,31(5):531-539.
[19] 王丹.水稻分蘖调控基因 TE 的功能分析和类病突变体 lms1
的图位克隆[D].北京:中国农业科学院,2012.
（责任编辑 崔建勋）
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