全 文 ：第４１卷 第４期
２０１３年４月
西北农林科技大学学报（自然科学版）
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ａ＆Ｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔ．Ｓｃｉ．Ｅｄ．）
Ｖｏｌ．４１ Ｎｏ．４
Ａｐｒ．２０１３
网络出版时间：２０１３－０３－２７ １５：５０
网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／６１．１３９０．Ｓ．２０１３０３２７．１５５０．０２８．ｈｔｍｌ
中国兰属植物菌根真菌的ｒＤＮＡ ＩＴＳ分析
［收稿日期］ ２０１２－０７－２４
［基金项目］ 四川省教育厅科研项目（１０ｚｄ１１８９）；四川省人社厅项目（１１ｓｄ３１０５）；西南科技大学博士基金项目（０９ｚｘ７１０７）
［作者简介］ 王芝娜（１９８６－），女，四川金堂人，在读硕士，主要从事植物生物技术研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｕａｎｌｕ２０１０３＠ｙａｈｏｏ．ｃｎ
［通信作者］ 李 杰（１９７４－），男，四川巴中人，副教授，博士，主要从事观赏园艺研究。
王芝娜，李 杰，张银杰
（西南科技大学 生命科学与工程学院，四川 绵阳６２１０１０）
［摘 要］ 【目的】对３０株中国兰属植物菌根真菌进行分子鉴定及遗传多样性分析，进一步探讨中国兰属植物
与其菌根真菌的专一性。【方法】以真菌通用引物ＩＴＳ１／ＩＴＳ４，扩增分离自云南６种兰属植物的３０株菌根真菌的ｒＤ－
ＮＡ ＩＴＳ序列，再与ＧｅｎＢａｎｋ中的菌株ｒＤＮＡ ＩＴＳ序列进行Ｂｌａｓｔ比对，并采用非加权组平均法（ＵＰＧＭＡ）进行聚类
分析。【结果】ｒＤＮＡ ＩＴＳ序列Ｂｌａｓｔ比对结果显示，分离的３０株菌根真菌分别隶属于镰刀菌属、毛壳菌属、柱孢霉属
和瘤菌根菌属，与形态学鉴定结果一致；菌根真菌ＩＴＳ１－５．８Ｓ－ＩＴＳ２序列总长４２９～５６３ｂｐ，ＧＣ含量为４１．６７％～
５８．０６％，其中ＩＴＳ１长９２～２５９ｂｐ，ＧＣ含量为４７．６６％～５８．６２％；５．８Ｓ长１５５～１５８ｂｐ，ＧＣ含量为４０．８１％～
５２．０５％；ＩＴＳ２长１４６～１９２ｂｐ，ＧＣ含量为３８．７８％～５５．５６％；聚类分析显示，３０株菌根真菌可分为４组，其中，分离
自送春、蕙兰、建兰的菌根真菌皆属于镰刀菌属，聚在Ⅰ组上；分离自春剑的菌根真菌除ＣＪ７单独聚在Ⅳ组外，其他均
聚在Ⅰ组上；分离自莲瓣兰、春兰的菌根真菌分别聚在Ⅱ和Ⅲ与Ⅰ和Ⅱ２个分支上，分离自莲瓣兰的菌根真菌聚在
Ⅱ、Ⅲ２个分支上。【结论】在供试的６种兰属植物中，春剑、春兰、莲瓣兰和蕙兰菌根真菌的遗传多样性较送春、建兰
丰富；蕙兰、送春、建兰与菌根真菌的专一性较强，而春剑、春兰、莲瓣兰与菌根真菌的专一性相对较弱。
［关键词］ 兰属植物；菌根真菌；ＩＴＳ；聚类分析
［中图分类号］ Ｓ６８２．３１０．１ ［文献标志码］ Ａ ［文章编号］ １６７１－９３８７（２０１３）０４－０１９１－０６
ｒＤＮＡ ＩＴＳ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｆｕｎｇｉ ｏｆ Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍｐｌａｎｔｓ
ＷＡＮＧ Ｚｈｉ－ｎａ，ＬＩ Ｊｉｅ，ＺＨＡＮＧ Ｙｉｎ－ｊｉｅ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｉａｎｙａｎｇ，Ｓｉｃｈｕａｎ６２１０１０，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｗａｓ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ３０ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｆｕｎｇｉ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ
Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍｐｌａｎｔｓ，ａｎａｌｙｚｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅｍ，ａｎｄ ｅｘｐｌｏｒｅ ｆｕｎｇａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．【Ｍｅｔｈｏｄ】ｒＤＮＡ ＩＴＳ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｒｏｍ ３０ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｆｕｎｇｉ ｏｆ ｓｉｘ Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍｐｌａｎｔｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ
ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒ ＩＴＳ１／ＩＴＳ４ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ Ｂｌａｓｔ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｂｅｆｏｒｅ ｂｅｉｎｇ
ｅｓｔｉｍａｔｅｄ ｂｙ ＵＰＧＭＡ．【Ｒｅｓｕｌｔ】Ｔｈｅ Ｂｌａｓｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｒＤＮＡ ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｓｅ ｆｕｎｇｉ ｂｅ－
ｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｆｕｓａｒｉｕｍ，Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ，Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ，ａｎｄ Ｅｐｕｌｏｒｈｉｚａ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｆｕｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ
ｗｉｔｈ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ．ｒＤＮＡ ＩＴＳ ｓｉｚｅｓ ｏｆ ３０ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｆｕｎｇｉ ｒａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ ４２９ｔｏ
５６３ｗｉｔｈ ＧＣ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ４１．６７％－５８．０６％．ＩＴＳ１ｗｅｒｅ ９２－２５９ｂｐ ｗｉｔｈ ＧＣ ｏｆ ４７．６６％－５８．６２％，５．８Ｓ
ｗｅｒｅ １５５－１５８ｂｐ，ｗｉｔｈ ＧＣ ｏｆ ４０．８１％－５２．０５％，ａｎｄ ＩＴＳ２ｗｅｒｅ １４６－１９２ｂｐ ｗｉｔｈ ＧＣ ｏｆ ３８．７８％－
５５．５６％．Ｔｈｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｌ ｔｒｅｅ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ３０ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｆｕｎｇｉ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｆｏｕｒ ｇｒｏｕｐｓ，ｗｈｉｃｈ ｏｆ
ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｆｕｎｇｉ ｉｎ Ｃ．ｃｙｐｅｒｉｆｏｌｉｍ，Ｃ．ｆａｂｅｒｉ，Ｃ．ｅｎｓｉｆｏｌｉｕｍｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｃｌａｄｅ ｏｆ Ｆｕｓａｒｉｕｍ．Ｍｙ－
ｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｆｕｎｇｉ ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｔｅａｔｕｍｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ＣｌａｄｅⅠｅｘｃｅｐｔ ＣＪ７，ａｎｄ ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｆｕｎｇｉ ｉｓｏ－
ｌａｔｅｄ ｆｒｏｍＣ．ｇｏｅｒｉｎｇｉｉ ａｎｄ Ｃ．ｔｏｒｔｉｓｅｐａｌｕｍｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｉｎ ＣｌａｄｅⅠ，ＣｌａｄｅⅡａｎｄ ＣｌａｄｅⅡ，ＣｌａｄｅⅢ，ｒｅｓｐｅｃ－
DOI:10.13207/j.cnki.jnwafu.2013.04.027
ｔｉｖｅｌｙ．【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】Ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｆｕｎｇｉ ｉｎ Ｃ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｔｅａｔｕｍ，Ｃ．ｇｏｅｒｉｎｇｉｉ，Ｃ．ｔｏｒｔｉｓｅｐａｌｕｍ，ａｎｄ Ｃ．ｆａｂｅｒｉ
ｈａｄ ｇｒｅａｔｅｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ ｔｈａｎ Ｃ．ｃｙｐｅｒｉｆｏｌｉｍ，Ｃ．ｅｎｓｉｆｏｌｉｕｍ．Ｃ．ｆａｂｅｒｉ，Ｃ．ｃｙｐｅｒｉｆｏｌｉｍ，Ｃ．ｅｎｓｉｆｏｌｉｕｍ
ｈａｄ ｈｉｇｈｅｒ ｆｕｎｇａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｔｈａｎ Ｃ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｔｅａｔｕｍ，Ｃ．ｇｏｅｒｉｎｇｉｉ ａｎｄ Ｃ．ｔｏｒｔｉｓｅｐａｌｕｍ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍｐｌａｎｔｓ；ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｆｕｎｇｉ；ＩＴＳ；ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ
中国重要的兰属（Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍ）植物因具有很高
的经济价值和观赏价值而被过度采集，正面临灭绝
的危险。在自然条件下，兰属植物必须与真菌建立
共生关系，其种子萌发、幼苗生长发育以及成年兰属
植物营养的获取才得以实现［１］。因此，研究兰属植
物与其菌根真菌的共生关系对兰属植物的保护具有
十分重要的意义。但很多兰属植物的共生真菌繁殖
结构或有性世代在人工培养条件下常难以获得，甚
至不可能获得，利用传统的形态学手段难以鉴定［２］。
而真菌的ＩＴＳ区域在种内相对保守，但种间变异明
显，因此分析真菌ＩＴＳ序列能快速准确地鉴定真菌
菌种［３］。近年来，研究者们采用ＩＴＳ分子技术对兰
科植物菌根真菌进行了相关研究［４－１４］，对中国兰属
植物菌根真菌的研究也陆续展开［１５－１９］，并取得了一
定的进展，但对兰属植物与其菌根真菌间的专一性
尚未达成共识。本研究利用ＩＴＳ技术，对分离自云
南６种兰属植物的３０株菌根真菌进行遗传多样性
分析，以期为进一步探讨兰属植物与其菌根真菌间
的专一性奠定基础。
１ 材料与方法
１．１ 供试菌株
供试３０株兰属植物菌根真菌，分离自云南野生
春剑（Ｃ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｔｅａｔｕｍ）、春兰（Ｃ．ｇｏｅｒｉｎｇｉｉ）、蕙
兰（Ｃ．ｆａｂｅｒｉ）、送春（Ｃ．ｃｙｐｅｒｉｆｏｌｉｍ）、建兰（Ｃ．ｅｎ－
ｓｉｆｏｌｉｕｍ）、莲瓣兰（Ｃ．ｔｏｒｔｉｓｅｐａｌｕｍ）。经形态学初
步鉴定隶属镰刀菌属（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ）、毛壳菌属
（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍｓｐ）、柱孢霉属（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ ｓｐ）
和瘤菌根菌属（Ｅｐｕｌｏｒｈｉｚａｓｐ），详细信息见表１。
表１ 用于ｒＤＮＡ ＩＴＳ分析的兰属植物菌根真菌概况
Ｔａｂｌｅ １ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｆｕｎｇｉ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍＣｙｍｂｉｄｉｕｍｆｏｒ ｒＤＮＡ ＩＴＳ ａｎａｌｙｓｉｓ
编号
Ｎｏ．
菌株
Ｓｔｒａｉｎｓ
来源品种
Ｃｕｌｔｉｖａｒ ｏｒｉｇｉｎ
形态鉴定结果
Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
编号
Ｎｏ．
菌株
Ｓｔｒａｉｎｓ
来源品种
Ｃｕｌｔｉｖａｒ ｏｒｉｇｉｎ
形态鉴定结果
Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
１ ＬＢＬ１ 莲瓣兰Ｃ．ｔｏｒｔｉｓｅｐａｌｕｍ Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍｓｐ １６ ＣＪ３ 春剑Ｃ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｔｅａｔｕｍ Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ
２ ＬＢＬ２ 莲瓣兰Ｃ．ｔｏｒｔｉｓｅｐａｌｕｍ Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍｓｐ １７ ＣＪ４ 春剑Ｃ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｔｅａｔｕｍ Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ
３ ＬＢＬ３ 莲瓣兰Ｃ．ｔｏｒｔｉｓｅｐａｌｕｍ Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍｓｐ １８ ＣＪ５ 春剑Ｃ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｔｅａｔｕｍ Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ
４ ＬＢＬ４ 莲瓣兰Ｃ．ｔｏｒｔｉｓｅｐａｌｕｍ Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎｓｐ １９ ＣＪ６ 春剑Ｃ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｔｅａｔｕｍ Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ
５ ＪＬ１１ 建兰Ｃ．ｅｎｓｉｆｏｌｉｕｍ Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ ２０ ＣＪ７ 春剑Ｃ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｔｅａｔｕｍ Ｅｐｕｌｏｒｈｉｚａｓｐ
６ ＳＣ１ 送春Ｃ．ｃｙｐｅｒｉｆｏｌｉｍ Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ ２１ ＣＬ１ 春兰Ｃ．ｇｏｅｒｉｎｇｉｉ Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ
７ ＨＬ１ 蕙兰Ｃ．ｆａｂｅｒｉ Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ ２２ ＣＬ２ 春兰Ｃ．ｇｏｅｒｉｎｇｉｉ Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ
８ ＨＬ２ 蕙兰Ｃ．ｆａｂｅｒｉ Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ ２３ ＣＬ３ 春兰Ｃ．ｇｏｅｒｉｎｇｉｉ Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ
９ ＨＬ３ 蕙兰Ｃ．ｆａｂｅｒｉ Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ ２４ ＣＬ４ 春兰Ｃ．ｇｏｅｒｉｎｇｉｉ Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎｓｐ
１０ ＨＬ４ 蕙兰Ｃ．ｆａｂｅｒｉ Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ ２５ ＣＬ５ 春兰Ｃ．ｇｏｅｒｉｎｇｉｉ Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎｓｐ
１１ ＨＬ５ 蕙兰Ｃ．ｆａｂｅｒｉ Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ ２６ ＣＬ６ 春兰Ｃ．ｇｏｅｒｉｎｇｉｉ Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ
１２ ＨＬ６ 蕙兰Ｃ．ｆａｂｅｒｉ Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ ２７ ＣＬ７ 春兰Ｃ．ｇｏｅｒｉｎｇｉｉ Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎｓｐ
１３ ＨＬ７ 蕙兰Ｃ．ｆａｂｅｒｉ Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ ２８ ＣＬ８ 春兰Ｃ．ｇｏｅｒｉｎｇｉｉ Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎｓｐ
１４ ＣＪ１ 春剑Ｃ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｔｅａｔｕｍ Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ ２９ ＣＬ９ 春兰Ｃ．ｇｏｅｒｉｎｇｉｉ Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ
１５ ＣＪ２ 春剑Ｃ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｔｅａｔｕｍ Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ ３０ ＣＬ１０ 春兰Ｃ．ｇｏｅｒｉｎｇｉｉ Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ
１．２ 菌根真菌ＤＮＡ的提取
将分离得到的菌根真菌菌株接种至ＰＤＡ液体
培养基上，于２５℃、１８０ｒ／ｍｉｎ培养５～７ｄ后收集
菌丝球，无菌水冲洗２～３次，置于干燥箱烘干后用
液氮研磨至粉末状，采用ＣＴＡＢ法提取ＤＮＡ备用。
１．３ ＩＴＳ区段的ＰＣＲ扩增及测序
ＩＴＳ区段的ＰＣＲ扩增采用真菌通用引物ＩＴＳ１
（５′－ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ－３′）和ＩＴＳ４（５′－
ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ－３′），引物合成和
测序由上海生工生物公司进行。ＰＣＲ扩增反应总
体积２５μＬ：Ｍｇ
２＋（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）１．５μＬ，ｄＮＴＰｓ（２．５
ｍｍｏｌ／Ｌ）２μＬ，１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ２．５μＬ，Ｔａｑ聚合
酶（５Ｕ／μＬ）０．２μＬ，上下游引物（２０μｍｏｌ／Ｌ）各
０．５μＬ，模板ＤＮＡ ２μＬ，去离子水１５．８μＬ。ＰＣＲ
扩增程序：９４℃预变性３ｍｉｎ；９４℃变性４５ｓ，５５℃
退火４５ｓ，７２℃延伸２ｍｉｎ，共３６个循环；７２℃延伸
１０ｍｉｎ。取２μＬ扩增产物用１５ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶检
测并在凝胶成像仪下照相保存。剩余产物送往上海
２９１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４１卷
生工生物公司测序。
１．４ 数据分析
将所得的菌根真菌ｒＤＮＡ ＩＴＳ序列输入 Ｇｅｎ－
Ｂａｎｋ中，获得ＧｅｎＢａｎｋ登录号，并通过Ｂｌａｓｔ比对
获得相似性最高的序列，确定菌根真菌的分属地位。
参照数据库中已有兰属及其他兰科植物菌根真菌的
ｒＤＮＡ ＩＴＳ范围，对本研究中的兰属植物ｒＤＮＡ
ＩＴＳ 序列进行界定。用 ＭＥＧＡ５．０５ 软件中的
ＣｌｕｓｔａｌＷ 进行多序列比对，再选用非加权组平均法
（ＵＰＧＭＡ）中的Ｔａｊｉｍａ－Ｎｅｉ模块构建系统发育树。
２ 结果与分析
２．１ 菌根真菌ｒＤＮＡ ＩＴＳ片段的ＰＣＲ扩增
兰属植物菌根真菌ｒＤＮＡ ＩＴＳ区段的扩增产物
经１５ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶电泳检测，发现其长度在５００
ｂｐ左右；且条带清晰、完整、明亮，说明扩增产物品
质较好。部分菌株的扩增结果见图１。
２．２ 菌根真菌ｒＤＮＡ ＩＴＳ序列的Ｂｌａｓｔ比对
将获得的菌根真菌ｒＤＮＡ ＩＴＳ序列提交至ＮＣ
ＢＩ中的ＧｅｎＢａｎｋ数据库，获得ＧｅｎＢａｎｋ登录号（表
２）。Ｂｌａｓｔ比对分析结果（表２）显示，兰属植物菌根
真菌的ｒＤＮＡ ＩＴＳ与ＧｅｎＢａｎｋ中菌株序列的相似
性高达９７％～１００％，缺失或插入（Ｇａｐｓ）比例为
０％～１％，属于高度同源。因此，将分离自６种兰属
植物的３０株菌根真菌鉴定为其比对的菌种。鉴定
结果显示，３０株菌根真菌隶属于镰刀菌属、毛壳菌
属、柱孢霉属和瘤菌根菌属，其中镰刀菌属菌株最
多，有２０株，占６６．６７％。
图１ 兰属植物菌根真菌ｒＤＮＡ ＩＴＳ片段的ＰＣＲ扩增图谱
Ｆｉｇ．１ ｒＤＮＡ ＩＴＳ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｆｕｎｇｉ
表２ 兰属植物菌根真菌ｒＤＮＡ ＩＴＳ序列的Ｂｌａｓｔ比对结果
Ｔａｂｌｅ ２ Ｂｌａｓｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｒＤＮＡ ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｆｕｎｇｉ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍＣｙｍｂｉｄｉｕｍｐｌａｎｔｓ
菌株
Ｓｔｒａｉｎｓ
ＧｅｎＢａｎｋ登录号
ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
ｎｕｍｂｅｒｓ
ＧｅｎＢａｎｋ中比对菌名及登录号
Ｆｕｎｇｕｓ ａｎｄ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ
ｓｅｍｂｌａｂｌｅ ｃｌｏｎｅ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ
相似度／％
Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ（ＩＤｓ）
缺失或插入比例／％
Ｇａｐｓ
ＣＪ１ ＪＱ７７１１７４ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ＨＭ２１００９２．１ ５４３／５４３（１００） ０／５４３（０）
ＣＪ２ ＪＱ７７１１７５ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ＤＱ００２５５０．１ ５３０／５３０（１００） ０／５３０（０）
ＣＪ３ ＪＱ７７１１７６ Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ ＨＭ２１４４５４．１ ４７９／４７９（１００） ０／４７９（０）
ＣＪ４ ＪＱ７７１１７７ Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ ＨＭ２１４４５４．１ ４７８／４７８（１００） ０／４７８（０）
ＣＪ５ ＪＱ７７１１７８ Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ ＡＹ７２９０７２．１ ４８４／４８５（９９） ０／４８５（０）
ＣＪ６ ＪＱ７７１１７９ Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ ＡＹ７２９０７２．１ ４８４／４８５（９９） ０／４８５（０）
ＣＪ７ ＪＱ７７１１８０ Ｅｐｕｌｏｒｈｉｚａｓｐ ＦＪ６１３０９４．１ ６０１／６１７（９７） ２／６１７（０）
ＣＬ１ ＪＱ７７１１８２ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ＦＪ９１４８８６．１ ５４６／５４６（１００） ０／５４６（０）
ＣＬ２ ＪＸ１７３０５８ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ ＥＵ５２０１１９．１ ５０２／５０３（９９） ０／５０３（０）
ＣＬ３ ＪＱ７７１１８４ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ＨＱ４５１８９０．１ ４９０／４９０（１００） ０／４９０（０）
ＣＬ４ ＪＱ７７１１８５ Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎｓｐ ＦＪ６０５２５９．１ ５７０／５７７（９９） ３／５７７（１）
ＣＬ５ ＪＸ１７３０６９ Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎｓｐ ＦＪ６０５２５９．１ ５０８／５１４（９９） ２／５１４（０）
ＣＬ６ ＪＸ１７３０７０ Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ ＨＭ２１４４６１．１ ５００／５００（１００） ０／５００（０）
ＣＬ７ ＪＸ１７３０７１ Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎｓｐ ＦＪ６０５２５９．１ ５０８／５１３（９９） ２／５１３（０）
ＣＬ８ ＪＸ１７３０７２ Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎｓｐ ＦＪ６０５２５９．１ ５０７／５１３（９９） ２／５１３（０）
ＣＬ９ ＪＸ１７３０７３ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ＦＪ８７４６３３．１ ５００／５００（１００） ０／５００（０）
ＣＬ１０ ＪＸ１７３０７４ Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ ＨＭ２１４４６１．１ ４９４／４９４（１００） ０／４９４（０）
ＪＬ１１ ＪＸ１７３０６１ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ ＥＵ５２０１１９．１ ４７２／４７５（９９） １／４７５（０）
ＬＢＬ１ ＪＸ１７３０５７ Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｂｏｓｔｒｙｃｈｏｄｅｓ ＪＦ８１７２７３．１ ５０９／５０９（１００） ０／５０９（０）
ＬＢＬ２ ＪＱ７７１１８３ Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｆｕｎｉｃｏｌａ ＧＱ９９６５７４．１ ５１７／５１７（１００） ０／５１７（０）
ＬＢＬ３ ＪＸ１７３０５９ Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｆｕｎｉｃｏｌａ ＥＦ０１７２０４．１ ５１５／５１５（１００） ０／５１５（０）
ＬＢＬ４ ＪＸ１７３０６０ Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎｓｐ ＦＪ６０５２５９．１ ５６８／５７４（９９） ３／５７４（１）
ＨＬ１ ＪＸ１７３０６２ Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ ＨＭ２１４４６１．１ ４８９／４９０（９９） ０／４９０（０）
ＨＬ２ ＪＸ１７３０６３ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｄｏｌｅｎｓ ＪＱ８４６０４５．１ ４８３／４８３（１００） ０／４８３（０）
ＨＬ３ ＪＸ１７３０６４ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ＨＱ６５８１１５．１ ４７９／４７９（１００） ０／４７９（０）
ＨＬ４ ＪＸ１７３０６５ Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ ＦＪ８４０５３２．１ ５０１／５０１（１００） ０／５０１（０）
ＨＬ５ ＪＸ１７３０６６ Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ ＨＭ２１４４６１．１ ５００／５０１（９９） １／５０１（０）
ＨＬ６ ＪＸ１７３０６７ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｄｏｌｅｎｓ ＨＭ３４６５４０．１ ４９３／４９３（１００） ０／４９３（０）
ＨＬ７ ＪＸ１７３０６８ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ＥＦ６１１０８６．１ ４９９／４９９（１００） ０／４９９（０）
ＳＣ１ ＪＸ１７３０５５ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ＪＱ８４６０５０．１ ４６９／４６９（１００） ０／４６９（０）
３９１第４期 王芝娜，等：中国兰属植物菌根真菌的ｒＤＮＡ ＩＴＳ分析
２．３ 菌根真菌的ｒＤＮＡ ＩＴＳ序列分析
参照ＧｅｎＢａｎｋ中已有兰科植物菌根真菌的标
准，对３０株菌根真菌的ｒＤＮＡ ＩＴＳ序列进行界定，
去除５′端１８ＳｒＤＮＡ和３′端２８ＳｒＤＮＡ序列后，仅
对ｒＤＮＡ内转录间隔区的ＩＴＳ进行分析，结果见表
３。表３表明，３０株菌根真菌的ＩＴＳ１－５．８Ｓ－ＩＴＳ２序
列总 长 ４２９～５６３ｂｐ，ＧＣ 含 量 为 ４１．６７％ ～
５８．０６％；其中，ＩＴＳ１长９２～２５９ｂｐ，ＧＣ 含量为
４７．６６％～５８．６２％；５．８Ｓ长１５５～１５８ｂｐ，ＧＣ含量
为４０．８１％～５２．０５％；ＩＴＳ２长１４６～１９２ｂｐ，ＧＣ含
量为３８．７８％～５５．５６％。菌根真菌ＩＴＳ１与ＩＴＳ２
序列的长度、ＧＣ含量均存在明显差异。
表３ 兰属植物菌根真菌的ｒＤＮＡ ＩＴＳ序列组成及变异分析
Ｔａｂｌｅ ３ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒＤＮＡ ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ
ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｆｕｎｇｉ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍＣｙｍｂｉｄｉｕｍｐｌａｎｔｓ
菌株
Ｓｔｒａｉｎｓ
ＩＴＳ１
（Ｇ＋Ｃ）含量／％
（Ｇ＋Ｃ）ｃｏｎｔｅｎｔ
长度／ｂｐ
Ｌｅｎｇｔｈ
５．８Ｓ
（Ｇ＋Ｃ）含量／％
（Ｇ＋Ｃ）ｃｏｎｔｅｎｔ
长度／ｂｐ
Ｌｅｎｇｔｈ
ＩＴＳ２
（Ｇ＋Ｃ）含量／％
（Ｇ＋Ｃ）ｃｏｎｔｅｎｔ
长度／ｂｐ
Ｌｅｎｇｔｈ
ＩＴＳ１－５．８Ｓ－ＩＴＳ２
（Ｇ＋Ｃ）含量／％
（Ｇ＋Ｃ）ｃｏｎｔｅｎｔ
长度／ｂｐ
Ｌｅｎｇｔｈ
ＣＪ１ ４９．５３ １０７ ５１．１２ １５５ ５２．７８ １８２ ５０．００ ４４３
ＣＪ２ ４９．５３ １０７ ５１．１２ １５５ ５２．７８ １８２ ５０．００ ４４３
ＣＪ３ ４９．５３ １０７ ５１．１２ １５５ ５２．７８ １６８ ５０．００ ４２９
ＣＪ４ ４９．５３ １０７ ５１．１２ １５５ ５２．７８ １６８ ５０．００ ４２９
ＣＪ５ ５１．４３ １０５ ４９．５２ １５５ ５１．４３ １９２ ４５．７１ ４５１
ＣＪ６ ５１．４３ １０５ ４９．５２ １５５ ５１．４３ １９２ ４５．７１ ４５１
ＣＪ７ ５５．２１ ２５９ ４０．８１ １５８ ４３．６８ １４６ ４６．５１ ５６３
ＣＬ１ ５０．９１ １１０ ４３．４４ １５５ ４３．２４ １８９ ５４．０５ ４５３
ＣＬ２ ４８．１８ １３７ ４３．１１ １５７ ５５．３０ １８０ ５１．１１ ４７４
ＣＬ３ ４９．５３ １０７ ５１．１２ １５５ ５２．７８ １６８ ５０．００ ４２９
ＣＬ４ ４７．７１ １５３ ４４．４４ １５７ ５２．９４ １８１ ５２．９４ ４９１
ＣＬ５ ４７．７１ １５３ ４４．４４ １５７ ５２．９４ １８１ ５２．９４ ４９１
ＣＬ６ ４７．６６ １０７ ５２．０５ １５５ ５５．５６ １８８ ５４．０５ ４４９
ＣＬ７ ４７．７１ １５３ ４４．４４ １５７ ５２．９４ １８１ ５２．９４ ４９１
ＣＬ８ ４７．７１ １５３ ４４．４４ １５７ ５２．９４ １８１ ５２．９４ ４９１
ＣＬ９ ５０．９１ １１０ ４３．４４ １５５ ４３．２４ １８９ ５４．０５ ４５３
ＣＬ１０ ４７．６６ １０７ ５２．０５ １５５ ５５．５６ １８８ ５４．０５ ４４９
ＨＬ１ ４７．６６ １０７ ５２．０５ １５５ ５５．５６ １８８ ５４．０５ ４４９
ＨＬ２ ４９．５３ １０７ ５１．１２ １５５ ５２．７８ １８２ ５０．００ ４４３
ＨＬ３ ４９．５３ １０７ ５１．１２ １５５ ５２．７８ １６８ ５０．００ ４２９
ＨＬ４ ４７．６６ １０７ ５２．０５ １５５ ５５．５６ １８８ ５４．０５ ４４９
ＨＬ５ ４７．６６ １０７ ５２．０５ １５５ ５５．５６ １８８ ５４．０５ ４４９
ＨＬ６ ４９．５３ １０７ ５１．１２ １５５ ５２．７８ １８２ ５０．００ ４４３
ＨＬ７ ４７．６６ １０７ ５２．０５ １５５ ５５．５６ １８８ ５４．０５ ４４９
ＪＬ１１ ４７．８３ ９２ ４１．０６ １５５ ４１．９４ １８９ ５８．０６ ４３６
ＬＢＬ１ ５８．６２ １４５ ４３．１９ １５７ ３８．７８ １７５ ４１．６７ ４７７
ＬＢＬ２ ５６．３８ １４９ ４７．５０ １５７ ４０．００ １７７ ４６．９４ ４８３
ＬＢＬ３ ５６．３８ １４９ ４７．５０ １５７ ４０．００ １７７ ４６．９４ ４８３
ＬＢＬ４ ４７．７１ １５３ ４４．４４ １５７ ５２．９４ １８１ ５２．９４ ４９１
ＳＣ１ ４９．５３ １０７ ５１．１２ １５５ ５２．７８ １６８ ５０．００ ４２９
用 ＭＥＧＡ５．０５内嵌的ＣｌｕｓｔａｌＷ 软件对ＩＴＳ１－
５．８Ｓ－ＩＴＳ２区域序列进行比对发现，分析序列总长
５７３ｂｐ，其中变异位点３８０个，简约信息位点１７８
个，分别占序列全长的６６．３％，３１．１％；ＩＴＳ１排序
后总长为２６０ｂｐ，其中变异位点１２９个，简约信息位
点７８个，分别占序列全长的４９．６％，３０．０％；５．８Ｓ
排序后总长为２０４ｂｐ，其中变异位点７７个，简约信
息位点４个，分别占序列全长的３７．８％，２．０％；
ＩＴＳ２排序后总长为２２０ｂｐ，其中变异位点１５４个，
简约信息位点１０２个，分别占序列全长的７０％，
４６．４％。
从菌根真菌ｒＤＮＡ ＩＴＳ区分布的变异量看，在
３８０个变异位点中，春剑、春兰、莲瓣兰、蕙兰菌根真
菌分别包含２９２，１１７，１１５，７５个。１７８个简约信息
位点中，春剑、春兰、莲瓣兰、蕙兰菌根真菌分别存在
５９，８９，６，５９个。送春、建兰均仅分离到１株菌根真
菌。这些结果表明，春剑、春兰、莲瓣兰和蕙兰菌根
真菌的遗传多样性较送春、建兰丰富。
４９１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４１卷
２．４ 菌根真菌ｒＤＮＡ ＩＴＳ序列的系统发育分析
将３０株菌根真菌的ｒＤＮＡ ＩＴＳ序列与下载的
相似性最高的序列进行多序列比对，采用非加权组
平均法（ＵＰＧＭＡ），通过Ｔａｊｉｍａ－Ｎｅｉ模块建成聚类
树状图（图２）。当水平距离为０．０９左右时，可以将
３０株真菌分为４组，分别标记为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，其中
春剑菌根真菌 ＣＪ７单独构成一组Ⅳ。Ⅰ组包括
ＳＣ１、ＣＪ１、ＣＪ２、ＣＪ３、ＣＪ４、ＣＪ５、ＣＪ６、ＨＬ１、ＨＬ２、
ＨＬ３、ＨＬ４、ＨＬ５、ＨＬ６、ＨＬ７、ＪＬ１１、ＣＬ２、ＣＬ１、ＣＬ３、
ＣＬ６、ＣＬ９、ＣＬ１０；Ⅱ组包括ＬＢＬ４、ＣＬ４、ＣＬ５、ＣＬ７、
ＣＬ８；Ⅲ组包括ＬＢＬ１、ＬＢＬ３、ＬＢＬ２。系统发育树结
果与兰属植物菌根真菌ｒＤＮＡ ＩＴＳ序列分析结果
（表２）高度一致。
图２ 兰属植物菌根真菌ｒＤＮＡ ＩＴＳ序列的系统发育树
树枝上的数字表示ｂｏｏｔｓｔｒａｐ验证中可信度的百分比（％）
Ｆｉｇ．２ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｒＤＮＡ ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｆｕｎｇｉ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍＣｙｍｂｉｄｉｕｍｐｌａｎｔｓ
Ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｎ ｔｈｅ ｂｒａｎｃｈｅｓ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄ ｔｏ ｔｈｅ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｂｏｏｔｓｔｒａｐ（％）
３ 讨 论
Ｂｌａｓｔ比对与形态学鉴定结果皆显示，本研究分
离的３０株菌株隶属于镰刀菌属、毛壳菌属、柱孢霉
属和瘤菌根菌属。兰属植物菌根真菌ｒＤＮＡ ＩＴＳ序
列具有丰富的多态性，对其进行分析是鉴定兰属植
物菌根真菌的有效的分子手段，同时结合形态学分
析，能提高兰属植物菌根真菌的鉴定水平，有助于分
析兰属植物菌根真菌的遗传关系及兰属植物与其菌
根真菌的专一性。
分析兰属植物菌根真菌ｒＤＮＡ ＩＴＳ序列发现，
同一区域不同兰属植物菌根真菌间存在一定的聚类
关系。菌根真菌都是从成年植株的根段分离得到
的，聚类分析表明，分离自送春、蕙兰、建兰的菌根真
菌皆属于镰刀菌属，聚在Ⅰ组上；分离自春剑的菌根
真菌除ＣＪ７单独为Ⅳ组外，其他均聚在Ⅰ组上；分
５９１第４期 王芝娜，等：中国兰属植物菌根真菌的ｒＤＮＡ ＩＴＳ分析
离自莲瓣兰、春兰的菌根真菌分别聚在Ⅱ和Ⅲ与Ⅰ
和Ⅱ分支上。说明在属的水平上，蕙兰、送春、建兰
与菌根真菌的专一性较强，而春剑、春兰、莲瓣兰与
菌根真菌的专一性相对较弱。
兰属植物与菌根真菌的专一性一直是争论的焦
点。但诸多研究学者认为：不同种的真菌能促进同
一种兰属植物生长发育，一种真菌同时能与多种兰
花形成共生关系［２０］。这很可能是因为这些共生真
菌皆能提供兰属植物萌发生长所需要的营养物质，
它们之间存在营养专一性。因此，研究兰属植物与
菌根真菌的营养专一性对于了解兰属植物与菌根真
菌的共生关系有重要意义。
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６９１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４１卷