全 文 ：收稿日期:2011 － 04 － 11
基金项目:湖南省自然科学基金重点资助项目(09JJ3051) ;湖南省高校产业化培育项目(10CY015)
作者简介:袁带秀(1975 －) ，女，湖南邵阳人，实验师，硕士，主要从事药用植物生理生化研究。E － mail:yuandaixiu123@ 126．
com
* 通讯作者
doi:10． 3969 / j． issn． 1006 － 9690． 2012． 01． 011
绞股蓝属三种植物的 POD、EST和 SOD同工酶研究
袁带秀1，袁志忠2，刘世彪2*
(1．吉首大学医学院，湖南 吉首 416000;2．吉首大学 植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室，湖南 吉首 416000)
摘 要 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对绞股蓝属的五柱绞股蓝、广西绞股蓝和绞股蓝 3 种植物的 POD、EST 和
SOD同工酶进行了比较研究。结果表明，3 种绞股蓝的 3 种同工酶谱带不同。3 种同工酶在广西绞股蓝上表现最
强。3 种同工酶在同一物种不同器官中的表达具有一定差异，以叶中的表达最强，茎次之，根最弱。由同工酶推断
的 3 种绞股蓝的亲缘关系为绞股蓝与广西绞股蓝亲缘关系较近，与五柱绞股蓝亲缘关系较远。
关键词 绞股蓝属;同工酶;相似系数
中图分类号:Q946． 5 文献标识码:A 文章编号:1006 － 9690(2011)06 － 0038 － 05
Study on Isoenzyme of POD，EST and SOD among 3 Species of
Gynostemma
Yuan Daixiu1，Yuan Zhizhong2，Liu Shibiao2*
(1． Medicine School of Jishou University，Jishou 416000，China;2． Key Laboratory of Plant Resources
Conservation and Utilization of Hunan Province，Jishou University，Jishou 416000，China)
Abstract A comparative study on isoenzymes of peroxydase (POD) ，esterase (EST)and superoxide
dismutase (SOD)among three species of Gynostemma pentagynum，G． guangxiense and G． pentaphyllum
was made by means of polyacrylamide gel electrophoresis． The results showed that the three species pres-
ented different isozyme belts of POD，EST and SOD． The strongest expression of three isoenzymes was
detected in G． guangxiense． The patterns of POD，EST and SOD isozyme were obviously different in dif-
ferent organs in the same species，with the strongest expression in leaf，secondly in stem and the least in
root． Analysis on the isozyme zymograms revealed that G． pentaphyllum had closer relationship with G．
guangxiense，rather than G． pentagynum．
Key words Gynostemma;isoenzyme;similarity coefficient
绞股蓝［Gynostemma pentaphyllum(Thunb．)
Makion］为葫芦科(Cucurbitaceae)多年生草质藤本
植物，有“南方人参”和“第二人参”的美誉，别名小
苦药、公罗锅底、五叶藤、遍地生根、甘茶蔓。多分布
于亚热带地区，我国主要分布于陕西南部及长江以
南各省区。现代药理学证明，绞股蓝具有抗疲劳、降
血脂、降血压、促进细胞新陈代谢、增强免疫、抑制肿
瘤、防衰老、祛痰利尿等作用，临床上用以治疗气管
炎和传染性肝炎等［1］。
同工酶是研究植物多样性的有力工具，通过分
析各种酶的同工酶电泳谱带，可以识别出控制这些
酶的基因位点和这些位点的多态性，并把遗传变异
数量化，可以较客观地反映整个基因组的变异。由
于酶谱带的变化能直接反映出物种 DNA 分子水平
上的变化，近 20 年来酶分析方法已广泛应用于植物
种群的遗传多样性、遗传分化及遗传结构等研究
中［2 － 6］。目前人们对绞股蓝同工酶谱的研究还较
少［7 － 9］，尤其对不同物种绞股蓝的同工酶的比较研
究尚未见报道。本文以绞股蓝、广西绞股蓝和五柱
绞股蓝为材料，对其过氧化物酶同工酶(POD)、酯
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第 31 卷第 1 期
2012 年 2 月
中 国 野 生 植 物 资 源
Chinese Wild Plant Resources
Vol． 31 No． 1
Feb． 2012
酶同工酶(EST)和超氧物歧化酶同工酶(SOD)进行
比较研究，试图通过同工酶分析来探讨不同物种和
同一物种不同器官中的同工酶酶谱特征及各种源之
间的亲缘关系，进而为绞股蓝的生理生化研究和绞
股蓝的综合应用提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 材料
材料:五柱绞股蓝 G． pentagynum(编号为 1
号)、广西绞股蓝 G． guangxiense(编号为 2 号)和绞
股蓝 G． pentaphyllum(编号为 3 号)于 2010 年 9 月
下旬，从吉首大学后山试验园地分别随机采集若干
株，用蒸馏水洗净，吸水纸吸干水分后，分别按其根、
茎、叶不同器官依次取样。
仪器:DYY － II － 2C 稳压稳流电泳仪、DYY － II
－ 28A型垂直电泳槽、TGL － 16G 高速冷冻离心机、
BINTA2020D凝胶成像分析系统。
1． 2 方法
1． 2． 1 样品制备 分别称取五柱绞股蓝(1 号)、广
西绞股蓝(2 号)和绞股蓝(3 号)样品(鲜品冷冻)
1． 0 g，加 1 mol·L －1 Tris － HCl(pH8． 0)样品提取液
1 mL于冰浴研成匀浆，然后以 1 mL 提取液分几次
洗入离心管，在高速冷冻离心机上以 8 000 r /min 离
心 10 min，上清液加等体积 40%的蔗糖溶液混匀，
置冰箱内冷藏，供点样用。
1． 2． 2 试剂配制及凝胶制备 采用不连续聚丙烯
酰胺凝胶电泳。分离胶:浓度为 7． 5%;浓缩胶:浓
度为 4%;电极缓冲溶液:pH 8． 3 的 Tris － Gly 系统;
分离胶灌制完成后置 4 ℃冰箱中过夜。浓缩胶在电
泳前灌制。
1． 2． 3 电泳 用微量进样器分别吸取 20 μL 样品
液缓缓注入样品槽底部，在负极槽电极缓冲液中加
入 1 滴溴酚蓝指示剂示踪，将电泳槽正负极与电泳
仪正负极相连，电泳开始时控制电流为 15 mA ，待
示踪指示剂行至距琼脂层约 1 cm时关闭电源，停止
电泳。整个过程约需 2 h，为防止温度过高，电泳过
程在冰箱内进行。
1． 2． 4 染色 POD 同工酶采用醋酸 －联苯胺染色
法染色;EST同工酶采用乙酸 － α －萘脂、乙酸 － β
－萘脂和固兰 RR盐染色;SOD 同工酶采用 SOD 活
性法［2］。电泳结束后，染色、脱色、固定、拍照、作
图。
1． 2． 5 谱带的相对迁移率和相似系数的计算 计
算谱带的相对迁移率(Rf)=酶带迁移距离 /指示剂
迁移距离。相似系数(C)= 2n /(n1 + n2)× 100%，
式中 n1 为 A酶谱的酶带数;n2 为 B 酶谱的酶带数;
n为 A与 B品种相同的酶带数［3］。
2 结果与分析
2． 1 POD同工酶
从表 1 及图 1 中可以看出，3 个不同物种绞股
蓝根、茎、叶 POD同工酶可分为三大酶区:第Ⅰ酶区
的相对迁移率为 0． 07 ～ 0． 21;第Ⅱ酶区的相对迁移
率为 0． 28 ～ 0． 48;第Ⅲ酶区的相对迁移率为 0． 55 ～
0． 94。三大酶区中，根共有 12 条酶带，茎共有 12 条
酶带，叶共有 11 条酶带。3 个物种的绞股蓝根均含
有酶带②，茎均含有酶带②、③，叶均含有酶带①、
⑧、⑩，且颜色最深，这可能是不同物种绞股蓝的根、
茎、叶在 POD 同工酶上的反应，即酶带②，酶带②、
③，酶带①、⑧、⑩分别为不同物种绞股蓝根、茎、叶
在 POD同工酶上的特征酶带。
同一物种的绞股蓝根、茎、叶组织中 POD 的表
达具有一定的差异。五柱绞股蓝(1 号)的根有 5 条
酶带，茎有 6 条酶带，叶有 6 条酶带，其中根有 2 条
强带，茎有 4 条强带，叶有 5 条强带。广西绞股蓝(2
号)的根有 11 条酶带，茎有 8 条酶带，叶有 9 条酶
带，其中根有 4 条强带，茎有 5 条强带，叶有 7 条强
带。绞股蓝(3 号)的根有 8 条酶带，茎有 6 条酶带，
叶有 9 条酶带，其中根有 2 条强带，茎有 3 条强带，
叶有 7 条强带。由此可见，POD 同工酶活性在不同
物种绞股蓝的叶上表现最强，其次是茎，最后是根。
—93—
第 1 期 袁带秀，等:绞股蓝属三种植物的 POD、EST和 SOD同工酶研究
表 1 绞股蓝属 3 种植物根、茎、叶 POD同工酶谱带的相对迁移率
编号 物种 部位
谱带的相对迁移率 Rf
① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ ⑨ ⑩ 瑏瑡 瑏瑢 瑏瑣 瑏瑤 瑏瑥 瑏瑦 瑏瑧
五柱 根 0． 07 0． 15 － － － － － 0． 41 － － － 0． 7 0． 76 － － － －
1 绞股 茎 0． 07 0． 15 0． 21 － － － 0． 37 － － 0． 55 0． 63 － － － － － －
蓝 叶 0． 07 － 0． 21 － － － 0． 37 0． 41 － 0． 55 － 0． 7 － － － － －
广西 根 0． 07 0． 15 0． 21 0． 28 － － － 0． 41 － 0． 55 － － 0． 76 0． 8 － 0． 9 0． 94
2 绞股 茎 0． 07 0． 15 0． 21 － － 0． 33 － － 0． 48 0． 55 0． 63 － 0． 76 － － － －
蓝 叶 0． 07 0． 15 － 0． 28 0． 29 － 0． 37 0． 41 － 0． 55 0． 63 0． 7 － － － － －
绞股 根 0． 07 － 0． 21 0． 28 － － － 0． 41 － 0． 55 － － － － 0． 83 0． 9 －
3 蓝 茎 － 0． 15 0． 21 0． 28 － － 0． 37 0． 41 － － － 0． 7 － － － － －
叶 0． 07 0． 15 0． 21 0． 28 － － 0． 37 0． 41 － 0． 55 0． 63 0． 7 0． 76 － － － －
图 1 绞股蓝属 3 种植物的根、茎、叶 POD同工酶酶谱
2． 2 EST同工酶
从表 2 及图 2 中可以看出，3 个不同物种绞股
蓝的根、茎、叶 EST 同工酶表达位点较丰富，其酶区
可分为三区:第Ⅰ酶区的相对迁移率为 0． 03 ～
0． 12;第Ⅱ酶区的相对迁移率为 0． 17 ～ 0． 4;第Ⅲ酶
区的相对迁移率为 0． 5 ～ 0． 94。三大酶区中，广西
绞股蓝(2 号)含有 7 条强带，17 条中强带;绞股蓝
(3 号)含有 3 条强带，7 条中强带;五柱绞股蓝(1
号)含有 2 条强带，9 条中强带。从酶带强弱看，EST
同工酶在广西绞股蓝(2 号)的表达要强于其他两个
物种。
同一物种绞股蓝的根、茎、叶 EST 表达也有一
定的差异。从图 2 中看出，五柱绞股蓝(1 号)的根
有 7 条带，其中中强带 4 条，弱带 3 条;茎有 8 条带，
其中强带 2 条，中强带 1 条，弱带 5 条;叶有 7 条带，
其中中强带 4 条，弱带 3 条。广西绞股蓝(2 号)的
根有 7 条带，其中强带 1 条，中强带 4 条，弱带 2 条;
茎有 9 条带，其中强带 4 条，中强带 5 条;叶有 10 条
带，其中强带 2 条，中强带 8 条。绞股蓝(3 号)的根
有 7 条带，其中中强带 2 条，弱带 5 条;茎有 5 条带，
其中中强带 3 条，弱带 2 条;叶有 5 条带，其中强带 3
条，中强带 2 条。综合来看，不同物种绞股蓝 EST
同工酶在茎、叶上的表达高于根。
2． 3 SOD同工酶
从表 3 和图 3 中看出，3 个物种的绞股蓝及同
一种绞股蓝的不同器官的 SOD表达都有一定差异。
在 SOD 同工酶 Rf 为 0． 13 位置上，五柱绞股蓝(1
号)的根、叶均表现为强带，茎表现为中强带;广西
绞股蓝(2 号)的根、茎、叶都表现为强带;绞股蓝(3
号)的叶表现为强带，茎表现为中强带，根仅表现为
弱带。在 Rf为 0． 23 位置上，五柱绞股蓝(1 号)的
叶表现为中强带，根表现为弱带，而茎没有表现出酶
带;广西绞股蓝(2 号)的根表现为中强带，茎、叶表
现为弱带;绞股蓝(3 号)的根、茎、叶均表现为弱带。
在 Rf为 0． 55 位置上，五柱绞股蓝(1 号)的叶表现
为强带，而根、茎表现为弱带;广西绞股蓝(2 号)的
根、茎、叶均表现为强带;绞股蓝(3 号)的根、茎、叶
均表现为中强带。在 Rf 为 0． 83 位置上，五柱绞股
蓝(1 号)的茎、叶均表现为中强带，而根表现为弱
带;广西绞股蓝(2 号)的叶表现为强带，茎表现为中
强带，而根表现为弱带;绞股蓝(3 号)的茎、叶表现
为强带，根却没表现出酶带。由上所述，可知酶带①
为 3 种绞股蓝 SOD 同工酶在叶上的特征谱带。从
酶活性看，SOD同工酶在叶上表现最强，其次是茎，
最后是根。3 个物种绞股蓝中，SOD 同工酶在广西
绞股蓝上表现最强。
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中 国 野 生 植 物 资 源 第 31 卷
表 2 绞股蓝属 3 种植物根、茎、叶 EST同工酶谱带的相对迁移率
编号物种部位
谱带的相对迁移率 Rf
① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ ⑨ ⑩ 瑏瑡 瑏瑢 瑏瑣 瑏瑤 瑏瑥 瑏瑦 瑏瑧 瑏瑨 瑏瑩
五柱 根 － 0． 06 － 0． 17 － 0． 24 0． 33 － － － 0． 54 0． 63 － 0． 72 － － － － －
1 绞股 茎 － 0． 06 － 0． 17 － 0． 24 － 0． 35 0． 4 － － 0． 63 － － － － － 0． 87 －
蓝 叶 － 0． 06 0． 12 － － 0． 24 － 0． 35 － － － 0． 63 － － － 0． 83 － 0． 87 －
广西 根 0． 03 － 0． 12 0． 17 － 0． 24 － － － － － 0． 63 － 0． 72 － 0． 83 － － －
2 绞股 茎 0． 03 0． 06 0． 12 － 0． 21 － 0． 33 － － － － 0． 63 － 0． 72 0． 8 0． 83 － － 0． 94
蓝 叶 0． 03 0． 06 0． 12 － 0． 21 － 0． 33 － － － － 0． 63 0． 68 0． 72 － － 0． 85 － 0． 94
绞股 根 0． 03 － 0． 12 － － － 0． 33 － 0． 4 0． 5 － － － － － － － 0． 87 0． 94
3 蓝 茎 0． 03 － 0． 12 － － － 0． 33 － 0． 4 － － － － 0． 72 － － － － －
叶 0． 03 － 0． 12 － 0． 21 － － － － － － － － 0． 72 － － － 0． 87 －
图 2 绞股蓝属 3 种植物的根、茎、叶 EST同工酶酶谱
表 3 绞股蓝属 3 种植物根、茎、叶 SOD同工酶谱带的
相对迁移率
编号 物种 部位
谱带的相对迁移率 Rf
① ② ③ ④
1
五柱绞
股蓝
根 0． 13 0． 23 0． 55 0． 83
茎 0． 13 － 0． 55 0． 83
叶 0． 13 0． 23 0． 55 0． 83
2
广西绞
股蓝
根 0． 13 0． 23 0． 55 0． 83
茎 0． 13 0． 23 0． 55 0． 83
叶 0． 13 0． 23 0． 55 0． 83
3 绞股蓝
根 0． 13 0． 23 0． 55 －
茎 0． 13 0． 23 0． 55 0． 83
叶 0． 13 0． 23 0． 55 0． 83
2． 4 相似系数与亲缘关系
同工酶的相似系数可以用于判定物种的亲缘关
系。本实验以叶为例，从表 4 中看出，绞股蓝不同物
种间同工酶谱的相似系数为 0． 31 ～ 0． 58，有较近的
亲缘关系;其中广西绞股蓝(2 号)与绞股蓝(3 号)
的相似系数最高，五柱绞股蓝(1 号)与绞股蓝(3
号)的相似系数最低，说明广西绞股蓝(2 号)与绞股
蓝(3 号)的亲缘关系最近，五柱绞股蓝(1 号)与绞
股蓝(3 号)的亲缘关系最远。
图 3 绞股蓝属 3 种植物的根、茎、叶 SOD同工酶酶谱
表 4 绞股蓝属 3 种植物叶的同工酶相似系数
物种 1 号 2 号 3 号
1 号 1 0． 47 0． 31
2 号 1 0． 58
3 号 1
3 讨 论
植物的同工酶分析可以很好地了解植物的生理
活动状态。POD广泛存在于高等植物的组织中，参
与各种生理活动，具有多种分子形式的组织特异性，
在植物不同生长发育时期其同工酶酶谱构成及酶活
性均存在差异，表现为多型现象。其变化与植物组
织器官的分化、形成和生理状态等密切相关，且酶谱
变化先于形态分化［10 － 11］。EST 是催化酯类化合物
水解的酶系，它催化羧酸酯类的酯键的水解或合成，
在植物不同的生长发育时期表现出器官特异性［12］。
SOD广泛存在于生物体内的含金属酶之一，是一种
重要的氧自由基清除剂，它能催化超氧化物阴离子
自由基发生歧化反应，产生分子氧和过氧化氢，具有
多种生物学作用。
绞股蓝属植物具有 17 个种及变种［13］，前人仅
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第 1 期 袁带秀，等:绞股蓝属三种植物的 POD、EST和 SOD同工酶研究
对绞股蓝的几种同工酶进行了初步研究，绞股蓝幼
苗的 POD同工酶具有 3 条带［7］，而绞股蓝愈伤组织
中的 POD同工酶则有 7 ～ 9 条带［8］，SOD 同工酶谱
有 12 条带，分为 3 个酶区［9］。本实验对绞股蓝同
工酶电泳数据的分析表明，绞股蓝的 POD同工酶具
有 12 条带，具有 3 个酶区;SOD同工酶具有 4 条带，
也具有 3 个酶区。造成这种差异的原因是在生长发
育过程中，植物器官或组织的生理特性和代谢过程
会发生变化，同工酶的类型也会随之变化。绞股蓝
不同器官的酶带数和强弱差异的变化是较大的，其
POD、EST、SOD 同工酶酶带在叶上表现最强，茎其
次，根最弱。如 EST 同工酶带数在五柱绞股蓝的
根、茎、叶上分别为 7、8、7 条，在广西绞股蓝的根、
茎、叶上分别为 7、9、10 条，在绞股蓝的根、茎、叶上
分别为 7、5、5 条，这反映了不同种类植物不同器官
的同工酶特异性表现是存在差异的。
酶谱可以反映不同植物物种间的相互联系与区
别，有助于判别物种间的亲缘关系。酶谱的差异表
现在酶带颜色深浅不同和迁移率不同。本实验证明
了绞股蓝不同物种之间既有共同酶带，又有各自的
特征酶带，以广西绞股蓝酶带总条数最多，五柱绞股
蓝酶带总条数最少。根据 Garva 和 Tsunewaki
(1977)等提出的“同工酶条带越多的品系越进化”
的理论，同工酶谱条带最少的五柱绞股蓝较原始，条
带最多的广西绞股蓝分化程度较大，是 3 个物种中
最为进化的种质。这种同工酶指标在绞股蓝不同物
种之间的特异性，是与绞股蓝属不同物种形态学上
的差异性一致的，因为绞股蓝和广西绞股蓝属于绞
股蓝亚属，而五柱绞股蓝属于喙果藤亚属［13］。因
此，同工酶的酶谱分析完全可以作为绞股蓝属植物
分类鉴定的重要依据。
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中 国 野 生 植 物 资 源 第 31 卷