全 文 ：中国农业科学 2004,37(11):1641-1646
Scientia Agricultura Sinica

收稿日期：2004-03-01
基金项目：国家重点基础研究发展计划资助项目（2001CB108905）和国家自然科学基金资助项目（3027001）
作者简介： 陈 强(1965-)，男，四川平昌人，副教授，在职博士，主要从事根瘤菌分类及分子生物学研究。Tel:0835-2882185；E-mail: cqiang@sicau.edu.cn。
陈文新为通讯作者, Tel: 010-62733749；E-mail: wenxin_chen@263.net


四川省葛藤属根瘤菌的遗传多样性研究
陈 强 1, 2，陈文新 1，张小平 2，李登煜 2，K. Lindstrom 3
（1农业部农业微生物资源及其应用重点开放实验室/中国农业大学生物学院，北京 100094； 2四川农业大学资源环境学院，雅安 625000；
3Department of Applied Chemistry and Microbiology, University of Helsinki, Finland Fin-00014）

摘要：用 AFLP、REP-PCR、23S rDNA PCR-RFLP 等方法对分离自四川的 23 株葛藤属的根瘤菌的遗传特性进行
了研究。结果表明，供试的葛藤根瘤菌遗传特性存在明显差异。 AFLP 分析结果显示，23 个菌株分为 7个 AFLP 遗
传群；在 BOXAIR-PCR 分析中，23 株根瘤菌则被分为 5 个遗传群；对 23S rDNA PCR-RFLP 分析表明，葛藤根瘤菌
分属于中慢生根瘤菌属（Mesorhizobium）、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）2 个属，聚类分析结果将其划分为 5
个遗传群。分离自四川省的葛藤根瘤菌存在较大的遗传多样性。
关键词：根瘤菌；遗传多样性；葛藤；AFLP

Genetic Diversity of Rhizobia Isolated from Pueraria spp.
in Sichuan, China
CHEN Qiang1, 2, CHEN Wen-xin1, ZHANG Xiao-ping2, LI Deng-yu 2, K. Lindstrom3
(1 Key Laboratory of Agro-Microbial Resource and Application, Ministry of Agriculture/College of Biological Sciences，
China Agricultural University, Beijing 100094; 2College of Resources and Environmental Science, Sichuan Agricultural University,
Yaan 625000; 3Department of Applied Chemistry and Microbiology, University of Helsinki, Finland Fin-00014 )

Abstract: Twenty-three rhizobial strains isolated from Pueraria spp. in different sites of Sichuan province were studied by
using AFLP, BOXAIR-PCR and 23S rDNA PCR-RFLP techniques. The results showed that genetic diversity among these rhizobia
was existed. The analysis of AFLP revealed that, there were seven AFLP genotypes among these rhizobial strains; and
BOXAIR-PCR suggested that, there were five genotypes existed. The results from 23S rDNA PCR-RFLP analysis revealed that,
from the phylogeny point of view, these rhizobia belong to Mesorhizobium sp. and Bradyrhizobium sp., and however, most of them
were different from the type strains of the related genera, which indicated that maybe there are putative new species existed.
Key words: Rhizobia; Genetic diversity; Pueraria spp.; AFLP

根瘤菌与豆科植物形成的共生固氮体系是生物固
氮的重要组成部分，对于维持自然界的氮素循环具有
积极的意义，对环境的可持续发展具有重要作用。葛
藤（Pueraria spp.）是一种多年生落叶木质藤本豆科植
物，广泛分布于我国除新疆、西藏以外的地方。葛藤
喜温暖湿润，但耐寒、耐旱，具有生长迅速、耐瘠薄
的优点，常生于草地、灌丛、疏林下及林缘，根系发
达，生命力强，是良好的水土保持植物，同时葛藤也
是优良的饲草植物和药用植物，葛藤的茎、叶是良好
的饲料，其根、叶、花、果亦可入药[1]。因此，研究
葛藤根瘤菌的遗传特性，并应用于我国的退化生态的
修复与重建以及西部地区退耕还林还草工程中，将具
有积极的生态意义和社会效益。
四川省地处我国西部，位于长江中上游，跨青藏
高原、横断山脉、云贵高原、秦巴山地和四川盆地几
种地貌类型，地势西高东低。三台、渠县、平昌和荥
经分别位于四川盆地西北部、东北部大巴山南麓、大
巴山系米仓山南麓和四川盆地西缘与成都平原向青
1642 中 国 农 业 科 学 37卷
藏高原过渡地带。本研究以分离自四川省 4个县的 23
株葛藤属根瘤菌为材料，用 AFLP、BOX-PCR、23S
rDNA PCR-RFLP 对其遗传多样性和系统发育进行了
研究。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
从 4个地方采集葛藤属植物的根瘤后，采用 YMA
培养基平板法分离纯化得到 23 株葛藤根瘤菌，用镜
检和回接结瘤试验检验菌株的纯度。供试菌株和参比
菌株情况见表 1。
1.2 方法
1.2.1 DNA 提取 将镜检纯化的供试菌株分别接
种到 3 ml TY培养液中，28℃、150 r/min振荡培养 3～
5 d，取 1.5 ml 菌液于 Eppendorf 管中，13 000 r/min

表 1 供试菌株
Table 1 Strains used in the study
菌株
Strain
宿主植物
Host plant
来源
Isolate site
CCBAU 611091 葛 P. thomsonii Bent 四川三台 Santai, Sichuan
CCBAU 611095 葛 P. thomsonii Bent 四川三台 Santai, Sichuan
CCBAU 611096 葛 P. thomsonii Bent 四川三台 Santai, Sichuan
CCBAU 611097 葛 P. thomsonii Bent 四川三台 Santai, Sichuan
CCBAU 611098 野葛 P. lobata(wild.) ohwi 四川渠县 Quxian, Sichuan
CCBAU 611099 野葛 P. lobata(wild.) ohwi 四川渠县 Quxian, Sichuan
CCBAU 611100 野葛 P. lobata(wild.) ohwi 四川渠县 Quxian, Sichuan
CCBAU 611101 野葛 P. lobata(wild.) ohwi 四川渠县 Quxian, Sichuan
CCBAU 611102 野葛 P. lobata(wild.) ohwi 四川平昌 Pingchang, Sichuan
CCBAU 611103 野葛 P. lobata(wild.) ohwi 四川平昌 Pingchang, Sichuan
CCBAU 611104 野葛 P. lobata(wild.) ohwi 四川平昌 Pingchang, Sichuan
CCBAU 611105 野葛 P. lobata(wild.) ohwi 四川平昌 Pingchang, Sichuan
CCBAU 611106 野葛 P. lobata(wild.) ohwi 四川平昌 Pingchang, Sichuan
CCBAU 611107 野葛 P. lobata(wild.) ohwi 四川平昌 Pingchang, Sichuan
CCBAU 611108 野葛 P. lobata(wild.) ohwi 四川荥经 Yingjing, Sichuan
CCBAU 611109 野葛 P. lobata(wild.) ohwi 四川荥经 Yingjing, Sichuan
CCBAU 611110 野葛 P. lobata(wild.) ohwi 四川荥经 Yingjing, Sichuan
CCBAU 611111 野葛 P. lobata(wild.) ohwi 四川荥经 Yingjing, Sichuan
CCBAU 611112 野葛 P. lobata(wild.) ohwi 四川荥经 Yingjing, Sichuan
CCBAU 611113 野葛 P. lobata(wild.) ohwi 四川荥经 Yingjing, Sichuan
CCBAU 611114 野葛 P. lobata(wild.) ohwi 四川荥经 Yingjing, Sichuan
CCBAU 611115 野葛 P. lobata(wild.) ohwi 四川荥经 Yingjing, Sichuan
CCBAU 611116 野葛 P. lobata(wild.) ohwi 四川荥经 Yingjing, Sichuan
中慢生根瘤菌属 Mesorhizobium
M. amorphae ACCC 19665T A. fruticosa 中国 China
M. ciceri USDA 3378T C. aretinum 美国 USA
土壤杆菌属 Agrobacterium
A. tumefaciense IAM 13129T 日本 Japan
A. rubi HAMBI 1812T 日本 Japan
A. vitis IAM 14140T 日本 Japan
A. rhizogense IAM 13570T 日本 Japan
根瘤菌属 Rhizobium
R. huantiense SO2T S. herbacea 美国 USA
R. leguminosarum USDA 2370T T. trfolium 美国 USA
R. tropici CIAT 899T P. vulgaris 美国 USA
R. etli HAMBI 1727T P. vulgaris 芬兰 Finland
R. galegae HAMBI 540T G.. orientalis 芬兰 Finland
R. hainanense CCBAU 57015T D. sinuatum 中国 Chnia
R.mongolense USDA 1844T M..ruthenica 美国 USA
R. giardinii USDA 2914T P. vulgaris 美国 USA
中华根瘤菌属 Sinorhizobium
S. meliloti USDA 1002T M. sativa 美国 USA
S. terangae LMG 7834T A. laeta 比利时 Belgium
S. kostiense HAMBI 1849T A. Senegal 芬兰 Finland
S. saheli HAMBI 215T S. pachycarpa 芬兰 Finland
S. fredii USDA 205T G.. max 美国 USA
慢生根瘤菌属 Bradyrhizobium
B. japonicum USDA 6T G.. max 美国 USA
B. elkanii USDA 76T G.. max 美国 USA
11期 陈 强等：四川省葛藤属根瘤菌的遗传多样性研究 1643
离心 4 min，弃去上清液， 用 1×TE 缓冲液洗涤菌体
2 次，加入 500 µl GUTC 缓冲液和 30 ng的 RNase，
充分混合后于 37℃温育 30 min，然后按 Terefework[2]
的方法提取菌体 DNA。以已知浓度的 λDNA 为标准，
用 1%琼脂糖凝胶电泳估测 DNA样品的浓度后，样品
保存于-20℃冰箱。
1.2.2 AFLP分析 取 5～8 µl供试 DNA 样品，用
EcoR I和 Mse I酶切，用 T4 DNA连接酶将酶切片段
与 Eco 连接头(5′-CTCGTAGACTGCGTACC-3′/3′
-CATCTGACGCATGGTTAA-5′)和 Mse 连接头(5′
-GACGATGAGTCCTGAG-3′ /3′ -TACTCAGGAC
TCAT-5′）连接后，用具有 2个选择性碱基的 Eco引
物 5′-GACTGCGTACCAATTC-GC-3′）和 Mse 引
物（5′-GATGAGTCCTGAGTAACT-CG-3′）进行
PCR反应。酶切连接及 PCR反应程序按张小平[3]、陈
强[4]的方法进行。反应完毕用 0.8%琼脂糖凝胶初步检
测 PCR产物，取 4 µl的 PCR 产物与等体积的上样缓
冲液混合，93℃变性 3 min，用 4%聚丙烯酰胺凝胶电
泳分离，银染、固定后室温过夜干燥，扫描凝胶。
1.2.3 BOXAIR-PCR 分析 用 BOXAIR 引物(5′
-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3′)扩增时，反
应液体系为：Dynazyme 聚合酶缓冲液(10×) 2.5 µl，
MgCl2(25 mmol·L-1) 5.6 µl，BSA(10 mg·ml-1) 0.2 µl,
DMSO(100%) 2.5 µl,，dNTPs (10 mmol·L-1) 2 µl，
BOXAIR引物(30 mmol·L-1) 0.32 µl，模板 DNA 50 ng，
Dynazyme 聚合酶 1.25 U，超纯水补足反应总体积 25
µl，扩增反应程序见文献[5]。取 1.5 µl的 PCR产物用
1.5%琼脂糖凝胶 50V电泳分离 5 h，UV凝胶成像系统
扫描。
1.2.4 23S rDNA PCR-RFLP 以 Primer3 和 Primer4
为引物，反应液组成：Dynazyme 聚合酶缓冲液(10×)
5 µl，dNTPs (10 mmol·L-1) 1 µl，Primer3和 Primer4引
物(50 mmol·L-1) 各 0.5 µl，模板 DNA 50 ng，Dynazyme
聚合酶 1.25 U，用超纯水补足反应总体积 50 µl，反应
程序见文献[6]。各取 PCR产物 8～10 µl，分别用 AluI、
HaeIII、HinfI、MspI于 37℃酶切 12 h后，3%琼脂糖
凝胶电泳分离，UV凝胶成像系统扫描。
1.2.5 数据分析和处理 所有 AFLP、BOXAIR-PCR
和 23S rDNA PCR-RFLP图像扫描文件用 Tiff文件保
存；图像信息采用 GelcomparⅡ(version 3.5) 分析软
件，用平均连锁法聚类，最后得到供试菌株的 UPGMA
树状图。
2 结果与分析
2.1 AFLP 聚类
图 1、2是葛藤根瘤菌的 AFLP指纹图谱和聚类分
析图。结果表明，供试菌株间存在明显的遗传差异，
包括参考菌株在内的37株根瘤菌可以分为11个AFLP
遗传群；其中，第 1、7、10、11遗传群全部由参考菌
株组成，23株葛藤根瘤菌聚于其余的 6个群内。其中，
第 2群有 6株根瘤菌，包括 2株中慢生根瘤菌参比菌
株和 4株葛藤根瘤菌；第 3、4、6群全部由葛藤根瘤
菌组成，第 5群包括 1株慢生大豆根瘤菌参比菌株
（ B.japonicm USDA6T）和 1 株葛藤根瘤菌
（CCBAU61109）。从试验结果看，供试的葛藤根瘤菌
遗传聚群既具有一定的地域性，同时也表现出了多样
化特征，如第 3群的 3个菌株分别来自 3个不同的地
方，第 4群的菌株全部由分离自荥经的菌株组成，第
6群则主要由分离自平昌的菌株组成。尽管群 3、4、6
的葛藤根瘤菌均属于慢生型菌株，但其 AFLP遗传图
谱存在差异，因而独立聚群。这些菌株是否是根瘤菌
的新的种群，有待进一步研究。
2.2 BOXAIR-PCR 聚类
图３是供试葛藤根瘤菌的 BOX 指纹图谱，对
BOX指纹进行UPGMA聚类分析，得到树状图（图 4），
23 株葛藤根瘤菌在 67%相似性水平处聚为一群，在



从左至右(From the left to right): DNA ladder, CCBAU61091, 61095,
61096, 61097, 61098, 61099, 61100, 61101, 61102, 61103, 61104, 61105,
61106, 61107, 61108, 61109, 61110, 61111, 61112, 61113, 61114, 61115,
61116, DNA ladder

图 1 葛藤根瘤菌 AFLP指纹图谱
Fig.1 AFLP fingerprints of studied rhizobial strains
1644 中 国 农 业 科 学 37卷


图 2 AFLP 聚类树状图
Fig.2 UPGMA dendrogram generated from AFLP


从左至右(From the left to right): DNA ladder, CCBAU61091, 61095,
61096, 61097, 61098, 61099, 61100, 61101, 61102, 61103, 61104, 61105,
61106, 61107, 61108, 61109, 61110, 61111, 61112, 61113, 61114, 61115,
61116, DNA ladder
图 3 葛藤根瘤菌 BOX 指纹图谱
Fig. 3 BOX fingerprints of studied rhizobial strins



图 4 BOXAIR 聚类树状图
Fig. 4 UPGMA dendrogram obtained from BOX

81%相似性处，除 CCBAU61108和 CCB61100单独成
群外，其余菌株聚为 3群。BOXAIR-PCR指纹图谱也
表明，各群菌株间遗传特性的差异明显，说明不同的
地理气候条件对根瘤菌和宿主植物影响不同，导致根
瘤菌向不同的遗传方向进化。
2.3 23S rDNA PCR-RFLP 分析
用 23S rDNA引物扩增后，得到大小约 2.3 kb的
片断。利用 AluI的酶切结果（图 5），对 4种限制性内
切酶的酶切结果聚类分析表明，23株葛藤根瘤菌在系
统发育上归属于中慢生根瘤菌属（Mesorhizobium）和
慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）。在 43%相似性水平
处，供试根瘤菌形成了慢生型与快生型根瘤菌 2个分
支（图 6），葛藤根瘤菌主要位于分支 I，即属于慢生
根瘤菌属，这些菌株在 80%相似性水平处分成 4个 23S
rDNA RFLP 遗传群，其中， CCBAU61108 与
USDA76T(B.elkanii)聚在一起，CCBAU61110 单独成
群；第 2、3群分别有 8、9个菌株。此外，另有 4株

从左至右(From the left to right): DNA ladder, CCBAU61091, 61095, 61096, 61097, 61098, 61099, 61100, 61101, 61102, 61103, 61104, 61105, DNA ladder,
61106, 61107, 61108, 61109, 61110, 61111, 61112, 61113, 61114, 61115, 61116, DNA ladder

图 5 葛藤根瘤菌 23S rDNA AluI 酶切结果
Fig.5 23S rDNA fingerprints of the studied rhizobia digested by AluI
11期 陈 强等：四川省葛藤属根瘤菌的遗传多样性研究 1645

图 6 23 S rDNA PCR-PFLP聚类图
Fig.6 UPGMA dendrogram constructed from 23S rDNA-RFLP

菌位于分支Ⅱ，属于中慢生型根瘤菌属分支，它们与
参比菌株（M. amorphae, M. plurifarum）间的差异明
显，也单独聚群，这一结果与 AFLP很好地吻合。
3 讨论
本文首次对葛藤属根瘤菌的遗传特性和系统发育
进行了研究，结果表明，分离自四川省不同地理环境
的葛藤根瘤菌存在明显的遗传多样性；在系统发育上，
供试菌株分属于中慢生根瘤菌属（Mesorhizobium）和
慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium），但以慢生根瘤菌属
为主；23株供试菌株中，仅 4株为中慢生型，其余 19
个为慢生型的菌株，在慢生型菌株中，不论是 AFLP，
还是 23S rDNA PCR-RFLP 分析，供试菌株并未与
USDA6T(B. japonicum)和 USDA76T (B. elkanii)聚在一
起，说明这些菌株在遗传特性和系统发育上有别于慢
生根瘤菌属 2个种的标准菌株，是否为新的种群，其
最终分类地位如何，有待进一步明确。笔者先前的研
究[7]表明，处于不同地区的同一种宿主植物，可以与
不同的根瘤菌形成共生体，本试验的结果再次证实了
这一点。虽然采样区同属中亚热带湿润气候，由于地
形、母质的差异，土壤也不同，三台县以石灰性紫色
土为主，渠县、平昌县以中性紫色土为主，而荥经县
则以酸性土壤居多，客观上为根瘤菌的生物多样性形
成提供了条件，使得这些根瘤菌株在遗传特性和系统
发育上都存在明显的差异。
研究根瘤菌生物多样性和系统发育的多相分类技
术很多[8]，本研究选用了 AFLP、BOXAIR-PCR和 23S
rDNA PCR-RFLP。AFLP能够从根瘤菌全基因组角度
获得丰富而稳定的遗传信息，能够充分反映供试根瘤
菌的遗传多样性，在本研究中，AFLP 分析将供试菌
株分成了 7个遗传群；BOXAIR-PCR则利用了根瘤菌
基因组中存在的重复序列来反映菌株间的遗传差
异，这 2种方法均能够获得大量信息，而且 2种方法
的聚群结果也比较吻合。但由于所获得的遗传信息的
角度不同，得到的结果会存在一定的差异，例如，AFLP
聚 类 图 中 ， CCBAU61091 、 CCBAU61095 、
CCBAU61096 和 CCBAU61101 与慢生型根瘤菌的参
比菌株分开，单独聚成了一群；而在 BOXAIR-PCR
分析中，这几个菌株却分散到不同的遗传群中，这是
由于 AFLP是从根瘤菌全基因组角度获得遗传信息，
而 BOXAIR-PCR 是从根瘤菌全基因组的重复序列中
获得有效信息，所以 AFLP得到的信息更丰富；加之
检测 PCR产物时，BOXAIR-PCR采用 1.5%琼脂糖电
泳，而 AFLP则采用 4%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增
产物，两者的分辨率也存在差异。由于 23S rDNA片
段比 16S rDNA 蕴藏更多的遗传信息，因而逐渐应用
于根瘤菌系统发育研究[6]。在本研究中，23S rDNA
PCR-RFLP 分析方法很好地反映了葛藤根瘤菌的系
统发育地位，其结果也与 AFLP有较好的一致性。
本试验的结果初步揭示了四川省葛藤根瘤菌的遗
传性状和系统发育关系，对于丰富我国根瘤菌资源研
究具有积极的意义。

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(责任编辑 卞海军)





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