全 文 ：第 38 卷 第 3 期
2014 年 5 月
南京林业大学学报(自然科学版)
Journal of Nanjing Forestry University (Natural Sciences Edition)
Vol． 38，No． 3
May，2014
doi:10． 3969 / j． issn． 1000 － 2006． 2014． 03． 034
收稿日期:2013 － 03 － 15 修回日期:2014 － 01 － 07
基金项目:江苏省镇江市科技计划项目(NY2007044)
第一作者:宿静，讲师。E-mail:sujing － 418@ 163． com。
引文格式:宿静． 基于 trnL-F基因序列的铁兰属植物亲缘关系分析［J］． 南京林业大学学报:自然科学版，2014，38(3) :175 － 178．
基于 trnL-F基因序列的铁兰属植物亲缘关系分析
宿 静
(东营技师学院，山东 东营 257091)
摘要:以莺哥凤梨(Vriesea carinata)为外类群，利用 Clustal X1． 81 和 MEGA3． 1 软件对 31 种铁兰属植物的基因序
列进行比对和分析，并构建分子系统树。结果表明:31 种铁兰属植物供试材料的 trnL-F序列长度在 806 ～ 835 bp
之间，变异位点 22 个，信息位点 14 个，平均遗传距离 0． 007，且在 301 ～ 322 bp和 826 ～ 830 bp处分别出现了插入
和 polyT序列。利用 ML法建立的系统树显示，31 个铁兰属植物分为 3 组。序列分析结果与形态学结果基本一
致，表明 trnL-F序列可用于铁兰属植物的亲缘关系分析，并可作为某些特定种的鉴定依据。
关键词:铁兰属;trnL-F基因;亲缘关系
中图分类号:S718. 49 文献标志码:A 文章编号:1000 － 2006(2014)03 － 0175 － 04
Phylogenetic relationship analysis of Tillandsia plants based on trnL-F gene
SU Jing
(Technician College of Dongying，Dongying 257091，China)
Abstract:In this paper，Catopsis subulata was selected as the outgroup，and trnL-F genes of 31 Tillandsia species were
analyzed and compared with each other to construct the phylogenetic trees by use of Clusta1 X1. 81 and MEGA3． 1 soft-
wares． The results showed that the length of trnL-F genes in 31 Tillandsia plants were in the range of 806 bp to 835 bp，
and there were 22 variable sites and 14 informative sites among them． On the other hand，the average genetic distance of
31 trnL-F gene sequences was 0． 007，and at the points of 301 － 322 bp，there were 21 deoxyribonucleotides inserted in
trnL-F gene sequences from T． fasciculata and T． tenuifolia，and a polyT sequence appeared at 826 － 830 bp． The phyloge-
netic trees built by ML method illustrated that 31 species could be clustered together into three groups． The clustered re-
sults were consistent with the morphologic identification． This indicated that trnL-F gene could be used for the Tillandsia
relationship analysis and as the basis for the identification of the specific species．
Key words:Tillandsia;trnL-F gene;phylogenetic relationship
铁兰属，具茎草本，花序为花多列分布穗状花序
或由穗状花序总状排列或简单花序，花色鲜艳，蒴果，
种子直立，附属毛白色，着生在基部［1］。1935 年，
Mez［2］将铁兰属划分为 6 个亚属:Subgen． Allardtia，
Subgen． Anoplophytum，Subgen． Diaphoranthema，Sub-
gen． Phytarrhiza，Subgen． Pseudo-Catopsis，和 Subgen．
Platastachys。1971 年以后，Smith 等［3］将铁兰属中
Subgen． Platystachys 更名为 Subgen． Tillandsia，1977
年，Smith等［4］将 4 种铁兰属植物并入 Subgen． Pseu-
dalcantarea亚属，主要依据是植株矮小但花序很长，即
现行系统中铁兰属共包含 7个亚属。
自 Hebert等［5］利用线粒体细胞色素 C 氧化酶
亚基 I(COI)进行 DNA条形码研究以来，该基因序
列已在动物的系统发育研究中得到广泛的应用。
由于植物线粒体基因进化速率较慢、遗传分化小，
而该基因又存在多拷贝、种内变异大、引物通用性
差的特性，因此植物学家们最终选定叶绿体基因展
开了有关植物 DNA 条形码的研究［6］，但目前尚未
找到理想的植物 DNA条形码。
叶绿体基因组 DNA中 trnL-F基因内的非编码
区，进化速率大于功能编码区，受外界环境选择压
力小，在一定分类水平上适用于系统关系重
建［7 － 8］。铁兰属植物经过多年的演化，亚属之间出
现了多处交叉，表现为一定的遗传分化。笔者采用
trnL-F序列产物直接测序的方法，对 31 种铁兰属
植物进行分析，以评价该序列在探讨铁兰属植物亲
南 京 林 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 第 38 卷
缘关系的可行性，从而为铁兰属植物系统发育研
究、分类鉴定提供理论依据，并对我国引种的铁兰
属植物种质资源的亲缘关系进行求实佐证，为进一
步繁殖选育提供理论基础。
1 材料与方法
1． 1 试材及取样
供试植物除莺哥凤梨(Vriesea carinata)外，其
余 30 个供试材料包含有 28 个种，分别为 Tillandsia
gardneri、T． globosa、T． stricta、T． araujei、T． ixioides、
T． neglecta、T． mauryana、T． montana、T． somnians、T．
usneoides、T． fasciculata、T． tenuifolia、T． juncea、T． se-
cunda、T． kolbii、T． xerographyca、T． ionantha、T． velu-
tina、T． butzii、T． magnusiana、T． harrisii、T． concolor、
T． cauligera、T． brachycaulos、T． subteres、T． bailyei、T．
hondurensis、T． straminea;另外两个供试材料为松萝
铁兰，采集地分别为秘鲁和巴西，即松萝铁兰包含
3 个采集地。
2008 年 8 月，自江苏农林职业技术学院园区
采集植物新鲜叶片，用冰袋保鲜，带回实验室用于
DNA提取。
1． 2 DNA提取、PCＲ扩增及序列测定
采用改良的 CTAB法与 PCＲ 产物回收试剂盒
相结合方法进行总 DNA提取，1． 0%的琼脂糖电泳
进行检测。
PCＲ 扩增引物对为 c (5 － CGAAATCGG-
TAGACGCTACG － 3)和 f(5 － ATTTGAACTGGT-
GACACGAG － 3)［9］。扩增反应体系为 50 μL，包
括:10 × PCＲ buffer 5 μL，24 mmol /L MgCl2 5 μL，
2. 5 mmol /L dNTPs 2. 5 μL，10 μmol /L 引物 c 和 f
各 1. 5 μL，DNA(10 ～ 30 ng)2． 5 μL，2． 5 μmol /min
TaqDNA聚合酶，用双蒸水补足 50 μL。PCＲ 扩增
程序:94 ℃预变性 3 min，进入 35 个 PCＲ 循环(94
℃变性 45 s，60 ℃复性 30 s，72 ℃延伸 90 s) ，最后
于 72 ℃延伸 5 min，4 ℃保存。
PCＲ扩增产物经 1. 0%琼脂糖电泳检测，确定
为目的带且无杂带干扰、DNA 的浓度达到测定要
求后，由上海英骏生物技术有限公司直接双向测
序，测序引物同 PCＲ引物。
1． 3 序列拼接、比对和系统树构建
用 DNAMAN软件进行序列拼接，然后用 Clust-
al X1． 81 软件进行序列比对，并根据峰图进行手工
校正［1］。用 MEGA3． 1 软件进行序列分析并依据
其中的最大简约法构建系统发育树，空位作为缺失
处理。对分支的可靠性评价使用靴带值(boot-
strap，1 000重复)分析，统计序列间的碱基突变位
点，计算平均遗传距离和碱基颠换数、转换率的百
分率。其中引用部分 Genbank 数据进行了分析，引
用情况如下:种有 T． disticha、T． albertiana、T． latifo-
lia、Catopsis． sub ulata，Genebank 登录号依次分别
为 AY614312、AY614361、AY614352、AY614272。
2 结果与分析
2． 1 铁兰属植物 trnL-F序列特征
在所有的被子植物中，迄今为止报道 trnL
(UAA)3外显子至 trnF(GAA)之间的基因间区即
trnL-F序列长度为 360 ～ 470 bp［10］，其相邻的 trnL
(UAA)内含子 390 ～ 615 bp［11］，两者总长度为 750
～ 1 085 bp。所有供试的 PCＲ 样品产物经琼脂糖
电泳后在 820 bp 处出现一目的条带图，测序后得
到的序列长度在 806 ～ 835 bp 之间，平均长度为
813 bp。各序列所占比例中，A 为 37. 0%，T 为
32. 6%，C 为 17. 2%，G 为 13． 3%，A + T 为 69．
6%，C + G为 30. 5%，即铁兰属植物 trnL-F 序列中
含 A + T的比例高。颠换 26 个，转换 10 个，插入 /
缺失 11 个。其中变异位点 22 个，占总序列长度的
2. 71%;信 息 位 点 14 个，占 总 序 列 长 度 的
1． 72%［1］。
在 301 ～322 bp处 T． fasciculata和 T． tenuifolia
出现了一段长达21 bp的插入，序列为 TAACATTAT-
GAATGATTATGA，明显区别于其他种;在 826 ～ 830
bp处，出现了一段特殊的 polyT 序列，且不同试样
间有 所 不 同，T． usneoides (Bra)、T． somnians、
T． secunda表现为 TTTTT;T． bailyei、T． concolor、T． ve-
lutina、T． juncea、T． usneoides(Per)、T． magnusiana、
T． subteres、T． globosa、T． neglecta、T． straminea、T． io-
nantha、T． concolor、T． fasciculata、T． usneoides、T． xe-
rographyca、T． harrisii、T． kolbii、T． butzii、T． caulig-
era、T． gardneri、T． brachycaulos 表现为 TTTT －;T．
stricta、Taraujei表现为 － － － － －;T． ixioides 表现
为 TTT － －;T． tenuifolia 表现为 TTTAT;T． montana
表现为 T － － － －;T． mauryana表现为 TTTG －。
2． 2 铁兰属植物系统发育树分析
采用最大简约法，经 1 000 次重复抽样计算，
获得了铁兰属植物的 trnL-F序列分子系统树，结果
见图 1。由图 1 可知，外类群 Vriesea carinata 构成
了一个单系。在结合线处，供试铁兰属植物主要分
为 3 类。
从系统进化树进高(图 1)T． tenuifolia 和
T． mauryana的遗传距离最大，为 0. 065，说明这两
671
第 3 期 宿 静:基于 trnL-F基因序列的铁兰属植物亲缘关系分析
个种之间的亲缘关系最远，最小遗传距离为 0，如
T． albertiana与 T． straminea、T． brachycaulos 与 T．
subteres、T． araujei 与 T． ixioides 之间遗传距离都为
0。参试属间的平均遗传距离 0． 007。
第 1 类包括 15 种，分别聚成 4 组。第 1 组包
括 T． araujei、T． ixioides、T． stricta、T． montana 和 T．
juncea，前 4 种属于 T． subgen． Anoplophytum 亚属，
T． juncea属于 T． subgen． Tillandsia亚属，这与形态
数量分类的结果相互吻合，在形态数量分类中
T． juncea和 T． araujei 聚在一起［12］。第 2 组包括
T． somnians、T． cauligera、T． secunda 前两者属于
T． subgen． Allardtia亚属，T． secunda 属于 T． subgen．
Tillandsia。第 3 组 包 括 T． bailyei、T． kolbii、
T． velutina、T． concolor、T． butzii、T． ionantha，全都属
于T． subgen． Tillandsia亚属。第 4 组为 T． neglecta，
属于 T． subgen． Anoplophytum亚属。
图 1 基于铁兰属 trnL-F序列分析的ML树
Fig． 1 The ML tree of Tillandsia generated from
trnL-F sequences
第 2 类包括 T． harrisii、T． usneoides(Bra)、T． us-
neoides(Per)、T． usneoides、T． fasciculata、T． alber-
tiana、T． straminea、T． brachycaulos、T． subteres、T． xe-
rographyca、T． magnusiana、T． gardneri和 T． latifolia，
其中 T． usneoides(Bra)、T． usneoides(Per)、T． us-
neoides属于 T． subgen． Diaphoranthema，属于同一个
种，只是采集地不同。从树形图中可以看出，秘鲁
和巴西采集的 T． usneoides 聚在一起，而美国采集
的 T． usneoides 与二者亲缘关系稍远，这可能与采
集地的距离有关。T． latifolia 属于 T． subgen． Al-
lardtia亚属，单独聚为一小组，T． harrisii、T． fascicu-
lata、T． albertiana、T． straminea、T． brachycaulos、T．
subteres、T． xerographyca、T． magnusiana 都属于 T．
subgen． Tillandsia亚属，而 T． gardneri 聚在了这一
组中，此种属于 T． subgen． Anoplophytum 亚属，原因
可能与 polyT 序列有关，它们的这段序列都为
“TTTT －”。
第 3 类是由 4 个单系单种植物组成的，包括
T． globosa、T． disticha、T． tenuifolia 和 T． mauryana，
T． disticha属于 T． subgen． Allardtia 亚属，T． globosa
和 T． mauryana属于 T． subgen． Anoplophytum亚属，
T． tenuifolia属于 T． subgen． Tillandsia 亚属。虽然 4
种植物都为单系，但是从位置上看，T． globosa 和
T． mauryana相聚较近。T． tenuifolia 没有并入第 2
类的原因可能是因为一段长达 21 bp的序列(TAA-
CATTATGAATGATTATGA)的插入。
3 讨 论
trnL-F非编码区位于 trnL 基因和 trnF 基因之
间，也包含了 trnL基因的一部分，在整个叶绿体基
因中进化速率适中，与其他叶绿体的非编码区相
比，它属于较慢的一类，但又远远高于叶绿体的编
码区。如 trnL-F 进化速率远慢于 rpL16 内含子或
trnT-L基因间区的进化速率［13］，是 rbcL 基因进化
速率的 3 倍以上，因而 trnL-F序列对于不同分类阶
元植物类群的系统关系重建都有重要的参考价值，
目前已广泛应用于植物的系统发育分析［14 － 16］。
该研究中，参与 trnL-F序列测序的共有 4 个亚
属(T． subgen． Allardtia、T． subgen． Anoplophytum、
T． subgen． Diaphoranthema和 T． subgen． Tillandsia)。
trnL-F序列测序的结果与传统的分类结果基本一
致，亚属间的大部分种聚在一起;polyT 序列的不同
能够在一定程度上鉴别 T． subgen． Anoplophytum 亚
属和 T． subgen． Tillandsia亚属。
T． subgen． Allardtia 亚属有 T． somnians、T．
cauligera、T． disticha和 T． latifolia 4 种植物，分别聚
在 3 部分，T． somnians、T． cauligera 聚在一起，这与
经典分类结果相符，与 SＲAP 标记所得结果也一
致，但造成 T． disticha和 T． latifolia分布差异的原因
有多种，最主要的原因可能是由于这两个种的序列
是引自 Genbank的序列，但也受供试物种的多少和
来源，以及统计分析方法的影响。
T． subgen． Anoplophytum 亚属有以下几种植物
771
南 京 林 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 第 38 卷
供试:T． araujei、T． ixioides、T． stricta、T． montana、
T． neglecta、T． gardneri、T． globosa 和 T． mauryana，
其中 T． araujei、T． ixioides、T． stricta、T． montana聚在
一起，T． globosa 和 T． mauryana 作为单系相聚较
近，这个聚类结果与 polyT 序列有关，T． mauryana
的为“TTTG －”，T． globosa 的为“TTTTT”，T． ne-
glecta和T． gardneri单独与其他亚属的种相聚在一
起，这两种的 polyT 序列为“TTTTT”;而 T． stricta、
T． araujei的为“－ － － － －”，T． ixioides 的为“TTT
－ －”，T． montana的为“T － － － －”，都有不同程
度的 T 缺失，所以相聚在一起。T． subgen． Anoplo-
phytum亚属在 polyT 序列上与其他亚属有着很大
的区别，大部分种在这段特殊序列上都有缺失，
trnL-F序列为区分该亚属提供了有力的分子证据。
T． usneoides(Bra)、T． usneoides(Per)、T． us-
neoide(USA)属于 T． subgen． Diaphoranthema，供试
植物属同一个种，聚类关系充分证明了地理分布差
异在亲缘关系上的作用是比较显著的，铁兰属植物
绝大多数分布在南美洲，但也有一些种分布在北美
洲，如美国和加拿大。此次关于 T． usneoides 序列
特征的测定为以后杂交选育也提供了理论上的佐
证。T． subgen． Diaphoranthema 亚属主要是和 T．
subgen． Tillandsia 亚属的种聚在一起，也印证了二
者之间的亲缘关系。
T． subgen． Tillandsia亚属是铁兰属中最大的一
个亚属，此次测序该亚属供试种为 16 个，主要聚为
2 类:第 1 类包括 T． bailyei、T． kolbii、T． velutina、
T． concolor、T． butzii、T． ionantha;第 2 类 包 括
T． harrisii、T． fasciculata、T． albertiana、T． straminea、
T． brachycaulos、T． subteres、T． xerographyca、T． mag-
nusiana。还有两个种与该亚属的其他种分布较远，
一个是 T． tenuifolia，这个种在 trnL-F序列上表现出
较大的变异，除了有一段序列为 TAACATTATGAAT-
GATTATGA的插入以外，在 polyT 这段序列上为
“TTTAT”，其他该亚属植物的 polyT 序列上为
“TTTTT”，这也是它单独聚为一个单系的原因。另
外一个种为 T． juncea 与 T． subgen． Anoplophytum 亚
属的种聚在一起，这和形态数量分类的结果以及
SＲAP标记结果相互吻合［16］，T． juncea 的分类位置
可能还有待进一步探讨。值得注意的是，长达 21 bp
的插入序列仅在 T． fasciculata 和T． tenuifolia两种植
物上存在，而这两个种都属于T． subgen Tillandsia
亚属。
参考文献(Ｒeferences):
［1］宿静．中国引种的铁兰属植物系统分类及微形态研究［D］．南
京:南京林业大学，2010．
Su J． Phylogenetic relationship analysis and morphology of Tilland-
sia plants［D］． Nanjing:Nanjing Forestry University，2010．
［2］Mez C． Bromeliaceae［C］/ / Endler A． Das Pflanzenreich． W．
Leipzig:Engelmann，1934 － 1935．
［3］Smith L B，Downs Ｒ J． Pitcairnioideae(Bromeliaceae) ［C］/ /
Flora Neotropica Monograph，1974．
［4］ Smith L B，Downs Ｒ J． Tillandsioideae(Bromeliaceae) ［C］/ /
Flora Neotropica Monograph，1977．
［5］Hebert P D，Cywinska A，Ball S L，et al． Biological identifica-
tions through DNA barcodes［J］． Proceedings of the Ｒoyal Society
of London Series B:Biological Sciences，2003，270:313 － 321．
［6］张蓉，殷亚方，徐魁梧，等． 基于 DNA 的木材树种识别进展
［J］． 南京林业大学学报:自然科学版，2014，38(1) :151
－ 156．
Zhang Ｒ，Yin Y F，Xu Q W，et al Progress of wood identification
based on DNA method［J］． Journal of Nanjing Forestry Universi-
ty:Natural Sciences Edition，2014，38(1) :151 － 156．
［7］Ｒichardson J E，Fay M F，Cronk Q B，et al． A phylogenetic analy-
sis of Ｒhamnaceae using rbcL and trnL-F plastid DNA sequences
［J］． Amer J Bot，2000，87(9) :1309 － 1324．
［8］Bayer Ｒ J，Puttock C F，Kelchner S A． Phylogeny of south Afri-
can Gnaphalieae (Asteraceae)based on two non-coding chloro-
plast sequences［J］． Amer J Bot，2000，87:259 － 272．
［9］Tablert P，Gielly L，Pautou G，et al． Universal primers for amplifi-
cation of three non-coding regions of chloroplast DNA［J］． Plant
Mol Bio，1991，17(5) :1105 － 1109．
［10］赵卫国，张志芳，潘一乐，等．桑树 trnL － F基因间隔区序列的
特点及分析［J］．蚕业科学，2002，28(2) :83 － 86．
Zhao W G，Zhang Z F，Pan Y L，et al． Studied on the cpDNA
trnL-F intergenic spacer sequence in the genus mulberry［J］． Sci-
ence of sericulture，2002，28(2) :83 － 86．
［11］Thompson J D，Gibson T J，Plewniak F，et al． The CLUSTAL X
windows interface:flexible strategies for multiple sequence align-
ment aided by quality analysis tools［J］． Nucleic Acids Ｒesearch，
1997，25(24) :4876 － 4882．
［12］宿静，李玉萍，汤庚国． 34 种铁兰属植物亲缘关系的 SＲAP分
析［J］．南京林业大学学报:自然科学版，2013，37(5) :153 －
157．
Su J，Li Y P，Tang G G． Genetic relationship of 34 Tillandsia
plants using SＲAP marker［J］． Journal of Nanjing Forestry Uni-
versity:Natural Sciences Edition，2013，37(5) :153 － 157．
［13］Small Ｒ L，Ｒybum J A，Cronn Ｒ C，et al． The tortoise and the
hare:choosing between non-coding plastome and nuclear Adh se-
quences for phylogeny reconstruction in a recently diverged plant
group［J］． Amer J Bot，1998，85:1301 － 1315．
［14］杨路存，陈桂琛，周国英．基于不同 DNA序列对四数璋牙菜系
统位置分析［J］．西北植物学报，2010，30(9) :1773 － 1779．
Yang L C，Chen G C，Zhou G Y． Systematic position of Swertia
tetraptera Maxim． inferred from ITS，rpl16 and trnl-trnf DNA se-
quences［J］． Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica，2010，30
(9) :1773 － 1779．
［15］Wang F Y，Gong X，Hu C M，et al． Phylogeography of an alpine
species Primula secundiflora inferred from the chloroplast DNA se-
quence variation［J］． Journal of Systematics and Evolution，2008，
46(1) :13 － 22．
［16］Liu Y，Yan H F，Cao T，et al． Evaluation of 10 plant barcodes in
Brayophyta (Mosses) ［J］． Journal of Systematics and Evolution，
2010，48(1) :36 － 46．
( 责任编辑 郑琰燚)
871