全 文 ：第 37 卷 第 5 期
2013 年 9 月
南京林业大学学报(自然科学版)
Journal of Nanjing Forestry University (Natural Sciences Edition)
Vol． 37，No． 5
Sept．，2013
收稿日期:2012 － 11 － 08 修回日期:2013 － 04 － 25
基金项目:江苏省镇江市科技计划项目(NY2007044)
第一作者:宿静，农艺师，博士。E-mail:sujing-418@ 163． com。
引文格式:宿静，李玉萍，汤庚国． 34 种铁兰属植物亲缘关系的 SRAP 分析［J］． 南京林业大学学报:自然科学版，2013，37(5) :153
－ 156．
34 种铁兰属植物亲缘关系的 SRAP分析
宿 静1，李玉萍2，汤庚国3
(1．东营市技师学院，山东 东营 257091;2．金陵科技学院园艺学院，江苏 南京 210038;
3．南京林业大学森林资源与环境学院，江苏 南京 210037)
摘要:利用 SRAP分子标记对 34 种铁兰属植物的亲缘关系进行分析。挑选了 10 对特异性引物，共扩增出 402 个
位点，多态性位点 376 个，多态性百分率 94%，相似系数 0． 134 3 ～ 0． 955 6。聚类分析发现，34 份铁兰属植物材
料在相似系数为 0． 78 时可划分为 4 个类群。分布地域是影响聚类结果的重要影响因子，实验证明 Tillandsia jun-
cea与 T． subgen． Anoplophytum亚属有较近的亲缘关系。
关键词:铁兰属;亲缘关系;SRAP
中图分类号:Q948 文献标志码:A 文章编号:1000 － 2006(2013)05 － 0153 － 04
Genetic relationship of 34 Tillandsia plants using SRAP marker
SU Jing1，LI Yuping2，TANG Gengguo3
(1． Technician College of Dongying，Dongying 257091，China;2． College of Horticulture，Jinling Institute Technology;Nanjing
210038，China;3． College of Forest Resources and Environment，Nanjing Forestry University，Nanjing 210037，China)
Abstract:In this paper，SRAP was used to assess the genetic relationship of 34 Tillandsia varieties． Ten pairs of prim-
ers were selected． 402 bands were amplified，of which 376 bands(94%)were polymorphic，and the Neis genetic simi-
larity coefficients ranged from 0． 134 3 － 0． 955 6． According to the UPGMA method，we made the cluster analysis by u-
sing the NTSYS software，34 Tillandsia plants could be divided into four groups at the similarity coefficient of 0． 78． The
geographical distribution was a principal factor for the cluster result． The experiment indicated that Tillandsia juncea and
T． subgen． Anoplophytum had close relationship．
Key words:Tillandsia;genetic relationship;SRAP
凤梨科铁兰属(Tillandsia)植物在全世界约有
500 多种，其中气生种有 200 余种。原产于中、南
美洲的热带或亚热带地区。植株呈莲座状、筒状、
线状或辐射状，叶片有披针形、线形或直立。叶除
绿色外，还有灰白、蓝灰等色，有些种在开花之前，
叶片会变成红色。叶片表面密被白色鳞片，穗状或
复穗状花序从叶丛中央抽出，花穗有生长密集而且
色彩艳丽的花苞片或绿色至银白色苞片，小花生于
苞片之内，有绿、紫、红、白、黄、蓝等色，花瓣 3 片，
蒴果，种子带冠毛［1 － 2］。
SRAP (sequence-related amplified polymor-
phism)技术具有简便、稳定、产率高、引物设计简单
且具有通用性等特点，在棉花、兰花、苎麻、一串
红［3 － 7］等植物中成功扩增，是开展遗传连锁图谱构
建、重要性状基因标记、预测杂种优势等研究的重
要工具，但在观赏植物中的应用十分有限［8］。笔者
建立铁兰属植物 SRAP技术体系，以期为铁兰属植
物遗传多样性、分子进化、系统发育及相关基因克
隆研究提供技术支持，同时为其他观赏植物的分子
标记提供参考。
1 材料与方法
1． 1 供试材料
选择 34 种铁兰属植物进行分析，供试材料采
集地为江苏农林职业技术学院，类群分别为:Til-
landsia gardneri 、T． globosa、T． stricta、T． araujei、T．
南 京 林 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 第 37 卷
ixioides、T． bergeri、T． neglecta、T． mauryana、T． mon-
tana、T． somnians 、T． latifolia、T． usneoides、T． fascicu-
lata 、T． tenuifolia、T． juncea、T． secunda、T． kolbii、T．
xerographyca、T． fuchsii、T． ionantha、T． velutina、T．
butzii T． magnusiana、T． harrisii、T． concolor、T． strep-
tophylla、T． brachycaulos、T． subteres、T． caput － medu-
sae、T． capitata、T． hondurensis、T． straminea、T． cyanea
和 T． cauligera，凭 证 标 本 号 依 次 分 别 为 Su
090801—Su 090812、Su 090814—Su 090816、Su
090818—Su 090829、Su 090831—Su 090833、Su
090835、Su 090843—Su 090844、Su 090841。
1． 2 DNA的提取与 SRAP扩增
采用改良的 CTAB法与 PCR 产物回收试剂盒
(北京莱博生物实验材料研究所)相结合方法进行
总 DNA 提取，1． 0% 的琼脂糖电泳检测浓度与
纯度。
SRAP扩增引物选择参考文献［9］，引物序列
见表 1，由上海英骏生物技术有限公司合成。依据
［10 － 11］的方法并稍加改动建立基础扩增反应体
系，包括:模板 DNA(20 ng /μL)2 μL，10 × PCR
buffer 2 μL，MgCl2(25 mmol /L)2． 5μL，dNTP(2． 5
mmol /L)2 μL，上下游引物(10 μmol /L)各 1． 0
μL，Taq DNA 聚合酶(5 μmol /(min·μL) )0． 2 μL，
最后用双蒸水补充至 20 μL。对选中的 49 个引物
组合进行初步扩增。
由于银染十分灵敏，所需 PCR 产物量少，将反
应体系改为 10 μL。选取扩增条带多、清晰、分布
均匀的 Me7 + Em7 引物组合对模板 DNA、Mg2 +、
dNTPs、引物浓度和 TaqDNA 聚合酶 5 个因素分别
进行单因子多水平试验以优化基础反应体系，前 4
个因子各设 5 个梯度，Taq 聚合酶只设 4 个梯度，
为保证扩增稳定性，每个梯度设 3 次重复。扩增程
序:94 ℃预变性 4 min，94 ℃变性 1 min，37 ℃退火
45 s，72 ℃延伸 1 min，5 个循环;94 ℃变性 1 min，
50 ℃退火 1 min，72 ℃延伸1 min，30 个循环，72 ℃
延伸 5 min，4 ℃保存。
用优化后的 SRAP － PCR 扩增体系和 Me7 +
Em7 引物组合对铁兰属植物进行扩增验证，确定扩
增条件的稳定性与扩增结果的多态性后，再利用优
化后的 SRAP扩增体系对上述 49 个引物组合重新
进行筛选，选出条带清晰、多态性丰富的 10 个引物
组合(Me7 + Em7、Me7 + Em4、Me7 + Em5、Me5 +
Em7、Me2 + Em5、Me7 + Em2、Me7 + Em3、Me2 +
Em2、Me3 + Em4、Me7 + Em6)用于 34 个样品的
扩增。
表 1 供试 SRAP-PCR引物序列
Table 1 Primers used in SRAP-PCR
代号
code
正向引物
forward primers
代号
code
反向引物
reverse primers
Me1 TGAGCCAAACCGGATA Em1 GACTGCGTACGAATTCAA
Me2 TGAGCCAAACCGGAGC Em2 GACTGCGTACGAATTCTG
Me3 TGAGCCAAACCGGACC Em3 GACTGCGTACGAATTGAC
Me4 TGAGCCAAACCGGACA Em4 GACTGCGTACGAATTTGA
Me5 TGAGCCAAACCGGTGC Em5 GACTGCGTACGAATTAAC
Me6 TGAGCCAAACCGGAGA Em6 GACTGCGTACGAATTGCA
Me7 TGAGCCAAACCGGACG Em7 GACTGCGTACGAATTGAG
1． 3 数据处理
SRAP 扩增产物所得的电泳图谱中的每个条
带均视为 1 个引物的结合位点，统计条带时认为电
泳迁移率相同的条带是扩增基因组上的相同 DNA
片段的产物［12］。采用二元性状编码，1 代表带
(DNA 片段)的存在，0 代表带不存在。
利用计算机软件 NTSYS － pc(2． 0 版)统计
SRAP 数据，按 Nei ＆ Li 相似系数法进行聚类分析。
具体用 SHAN功能，按照 UPGMA 法进行聚类分析，
再用 Tree Plot 功能绘出聚类分析树状图［13 － 15］。
2 结果与分析
2． 1 铁兰属植物 SRAP － PCR扩增多态性
10 个引物组合对 34 个铁兰属植物样品进行
扩增，结果表明多态性比较丰富(图 1)。片段集中
分布在 100 ～ 700 bp之间。所有样品扩增获得 402
条带，其中 376 条为多态性条带，多态性百分比达
94%，平均每个引物组合扩增出 40． 2 条，各个引物
组合检测出的多态性条带百分比不同，其中有 3 个
引物组合的多态性百分比最高，达到 100%，分别
为 Me7 + Em4 组合、Me7 + Em5 组合、Me3 + Em4 组
合，多态性条带百分比最小的是 Me5 + Em7 引物组
合，为 78%。
34 个种中多态谱带比率以 T． straminea 最高，
达 81. 61%;其次是 T． gardneri，为 80. 00%;T．
brachycaulos为 77． 19%，位居第 3;多态谱带率最低
的是 T． mauryana 和 T． fuchsii，多态谱带率为
31. 58%。34 个种的多态性百分比高低顺序依次
为:T． straminea ＞ T． gardneri ＞ T． brachycaulos ＞ T．
hond urensis ＞ T． magnusiana、T． secunda ＞ T． velutina、
T． butzii ＞ T． streptophylla、T． neglecta、T． cyanea ＞ T．
juncea ＞ T． somnians ＞ T． usneoides ＞ T． stricta ＞ T． fas-
ciculata ＞ T． latifolia ＞ T． tenuifolia ＞ T． subteres ＞ T．
caput-medusae ＞ T． cauligera ＞ T． kolbii ＞ T． concolor ＞
451
第 5 期 宿 静，等:34 种铁兰属植物亲缘关系的 SRAP分析
T． ixioides ＞ T． harrisii ＞ T． xerographyca ＞ T． bergeri ＞
T． globosa ＞ T． araujei ＞ T． ionantha ＞ T． montana ＞ T．
mauryana、T． fuchsii。由此可见，SRAP 标记技术能
检测到 34 个样品间丰富的遗传差异。
图 1 Me7 + Em7 和Me7 + Em4 对所有样品的扩增图谱
Fig． 1 SRAP patterns amplified by primer Me7 + Em7 and Me7 + Em4
注:A． Me7 + Em7 扩增谱;B． Me7 + Em4 扩增谱。
2． 2 铁兰属 SRAP遗传相似性分析
在根据 SRAP结果构建的 34 种铁兰属植物亲
缘关系树状图中，相似系数0． 134 3 ～ 0． 955 6，平均
遗传相似系数为 0． 455，大部分材料的遗传距离集
中在 0． 6 ～ 0． 9 之间，说明大部分材料之间的相对
遗传距离较近。T． latifolia和 T． somnians 相似系数
最大，表明这两个种遗传差异最小，亲缘关系最近;
T． latifolia和 T． araujei 相似系数最小，表明它们遗
传差异最大，亲缘关系最远。
图 2 铁兰属 SRAP聚类分析图
Fig． 2 The maps of cluster analysis dendrogram
for Tillandsia by SRAP data
2． 3 铁兰属 SRAP聚类分析
基于遗传相似系数，利用 UPGMA 法对 34 份
铁兰属植物材料进行 UPGMA 聚类分析，如图所
示，在结合线 L1(相似系数 0． 78)处将 34 份材料
聚为 4 个类群(图 2)。
类群Ⅰ包括 4 个样本材料，类群Ⅱ包括 2 个样
本材料，类群Ⅲ聚成 5 个组(a 组包括 4 个样本材
料;b组包括 4 个样本材料;c 组只有 2 种;d 组只
有 1 个种(T． ionantha) ;e 组比较复杂，包括 2 部
分，第 1 部分包含 7 个样本材料，第 2 部分包括 7
个样本材料) ，类群Ⅳ由 3 个样本材料组成。
3 讨 论
(1)以 SRAP 标记筛选了 10 对引物，共扩增
出 402 个位点，其中多态性位点 376 个，平均每个
引物扩增出 40． 2 个位点，多态性百分率为 94%。
表明了这种分子标记方法能扩增出较丰富的多态
性条带，对铁兰属材料的遗传多样性检测效率较
高，可以揭示铁兰属植物材料较丰富的遗传多样
性。同时也印证了 SRAP 标记是一种经济、有效和
可靠的分子标记手段［13］。
(2)SRAP 分子标记的遗传相似系数范围
0． 134 3 ～0． 955 6，范围跨度较大，这与许多学者认
为 SRAP 标记的目标扩增区域相对比较保守的结
论不符［12］，同时也说明 SRAP 在铁兰属植物材料
亲缘关系的分析中具有较高的可信度［13］。从遗传
相似系数结合聚类结果的分析来看，材料间表现出
的遗传背景比较复杂，具有丰富的遗传多样性，且
亚属之间出现了多处交叉，说明铁兰属植物经过多
年的演化，已经出现了一定的遗传分化。
(3)T． subgen． Anoplophytum亚属的 T． stricta、
551
南 京 林 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 第 37 卷
T． bergeri产自阿根廷，聚在一起，亲缘关系较近，T．
araujei和 T． gardneri 产自巴西，聚在一起，且这与
二者的表型特征有着密切的联系，叶子螺旋状着生
于茎上，区别于大多数种叶子基生的特征。T． sub-
gen． Tillandsia 亚属的 T． brachycaulos、T． fascicula-
ta、T． butzii原产自墨西哥和巴拿马，聚在一起。可
见，T． subgen． Anoplophytum亚属与 T． subgen． Til-
landsia亚属的一些种存在交叉，亚属间产生了一
定的遗传分化，地域相近的种，其基因交换频繁，相
互渗透，亲缘关系较近，在其他物种上也是如此。
(4)T． subgen． Allardtia亚属的 3 个种 T． lati-
folia 、T． cauligera 和 T． somnians 聚在一起，遗传相
似系数都在 0． 9 以上，且这 3 个种都产自厄瓜多尔
或秘鲁［14］，说明这个亚属在地域上分布比较集中，
其他亚属的植物分布在秘鲁的相对很少，3 个种与
其余亚属种之间相聚最远，可见 T． subgen． Allard-
tia亚属与其他亚属的亲缘关系也最远，这个结果
与基于形态的数量分类结果相互吻合［15］。
亚属 T． subgen． Diaphoranthema 的 T． usneoides
与 T． subgen． Tillandsia 亚属的 T． capitata 聚在一
起，T． subgen． Diaphoranthema 亚属的 T． cyanea 与
亚属 T． subgen． Tillandsia 的 3 个种聚在一起，可
以推测 T． subgen． Tillandsia亚属和这两个亚属之
间的关系都较为亲近，这个结论与基于形态的数量
分类结果相互印证［15］，也说明了 SRAP 分子标记
结果的可靠性。
(5)传统分类学中 T． subgen． Tillandsia 亚属
的种 T． juncea 与 T． subgen． Anoplophytum 亚属的
两个种聚在一起，这个结果与基于形态的数量分类
结果和 trnL － F序列测序的结果相互吻合［15］，体现
了高度的一致性，该实验 证 明 T． juncea 与
T． subgen． Anoplophytum亚属存在较近的亲缘关系。
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( 责任编辑 郑琰燚)
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