全 文 ：几种香茶菜属二萜化合物对自由基
导致线粒体损伤的保护作用*
张　予　王　筠　徐　霞1　戈士文　张覃沐
(河南省医学科学研究所药理室 ,郑州　 450052)
中国图书分类号　 R 284. 1; R 977. 9
文献标识码 A　 文章编号 1001-1978( 1999) 01-0046-03
摘要　目的　了解香茶菜属二萜类化合物冬凌草甲素
( Orid)、腺花香茶素 ( Ade)、黄花香茶菜素 ( Scul)是否具有抗
氧化作用。 方法　用分光光度法测定脂质过氧化物丙二醛
( MDA)含量及线粒体肿胀度。 用荧光分光光度法测定线粒
体膜流动性。 结果　 Orid, Ade, Scul 40, 80, 160μmo l·
L- 1抑制铁 -半胱氨酸 ( Fe2+ - Cys)引起的肝线粒体 MDA形
成 ,并呈剂量依赖关系。 Orid, Ade, Scul 160μmol· L- 1抑
制肝线粒体膜流动性下降 (P 值分别为 2. 297± 0. 022,
0. 389± 0. 009, 0. 382± 0. 013, Fe2+ -Cys的 P 值为 0. 423±
0. 014); Ade 160μmol· L- 1还可抑制脂质过氧化引起的肝
线粒体肿胀。 结论　 Orid, Ade, Scul可能通过抑制脂质过
氧化而产生抗氧化作用。
关键词　二萜类化合物 ;线粒体 ;脂质过氧化 ;抗氧化作用
　　二萜类化合物是唇形科香茶菜属植物中提取的
有效成分 ,香茶菜属植物的资源在我国极为丰富 ,从
中已提取百余种二萜成分 ,但其中仅有极少数进行
过药理学研究 ,我们对该属植物冬凌草中有效成分 ,
冬凌草甲素及其它二萜成分的抗肿瘤作用及其作用
机制进行了系统深入的研究〔 1～ 3〕 ,发现冬凌草甲素
不仅具有抗肿瘤作用 ,并有抗致突变 ,及抗致畸作
用〔 4〕 ,进一步研究并证明它可清除黄嘌呤 /黄嘌呤氧
1998-04-30收稿 , 1998-12-10修回
* 国家自然科学基金资助课题 , No 39700178;河南省自然科学基金
资助课题 , No 974020600
1河南医科大学实验中心 ,郑州　 450052
作者简介:张　予 ,女 ,硕士 ,副研究员 ;
张覃沐 ,男 ,教授
化酶系统中的氧自由基 ( O·2 )及 Fenton反应中的羟
自由基 (· OH) ,提示冬凌草甲素具有抗氧化特性 ,
腺花香茶菜素系分别从腺花香茶菜及黄花香茶菜中
提取的二萜成分 ,化学结构与冬凌草甲素相似 ,它们
是否与冬凌草甲素一样具有抗氧化作用 ,对自由基
膜损伤是否亦有保护作用 ,特进行此研究。
1　材料与方法
1. 1　药物　冬凌草甲素 ( o ridonin, Orid)郑州化学
制药厂生产 ,腺花香茶素 ( adenanthin, Ade) ,黄花
香茶菜素 ( sculponeatin, Scul)由中国科学院昆明植
物所孙汉董教授提供 ,用前均以无水乙醇溶解 ( <
10% ) ,并以 Tris-HCl缓冲液 ( pH 7. 4)稀释至所需
浓度 , 1. 6-二苯基 -1. 3. 5. -已三烯 ( DPH)为 Fluka
产品 , L-半胱氨酸 ( Cy s)和硫代巴比妥酸 ( TBA)为
上海第二化学试剂厂产品 ,批号 961024, 抗坏血酸 ,
北京化学试剂厂 ,批号 920109;其余均为国产 AR
试剂。
1. 2　动物　 SD大鼠 ,体重 300～ 350 g ,由河南医
科大学实验动物中心提供。
1. 3　方法
1. 3. 1　鼠肝线粒体的分离　按照文献方法〔4〕分离
线粒体 ,线粒体蛋白测定按照 Low ry法〔5〕。
1. 3. 2　脂质过氧化水平测定　 Orid, Ade和 Scul
40, 80和 160μmol· L- 1与线粒体蛋白 0. 5 g· L- 1
预先在 37℃孵育 30 min,然后加入硫酸亚铁 ( Fe2+ )
50μmo l· L- 1和 200μmol· L- 1的半胱氨酸 ( Cy s) ,
再孵育 30 min;加入 20%三氯醋酸 0. 5 ml终止反
应 ,离心 ( 9 000×g ) ,去蛋白。用 TBA法〔6〕测定上清
液中的脂质过氧化代谢产物丙二醛含量 ,根据
( 115. 31 pmol· g- 1 Pro ) . The K I values of com-
petitiv e inhibi tion o f BN3C, lacidipine and nifedip-
ine on [
3
H ] PN200-110 binding to cardiac sar-
colemmic membranes o f rats w ere 1. 49, 9. 22 and
11. 64 nmo l· L- 1 , respectiv ely. CONCLUSIONS　
BN3C reduced [
3
H ] PN 200-110 binding af fini ty
and demonst rated a competi tiv e interaction wi th
[3 H] PN200-110 binding si tes. The competitiv e in-
hibi tion o f BN 3C on [3H ] PN 200-110 binding to
ca rdiac sarcolemmic membranes of rats w as mo re
pow erful than that o f lacidipine and nifedipine.
KEY WORDS　 BN3C; lacidipine; ni fedipine; ca r-
diac sarcolemm membrane; dihydropy ridine recep-
to r
·46· 中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin　 1999 Feb; 15( 1): 46～ 8
MDA-TBA的克分子消光系数 ( cm ) 1. 56× 105 mol
· L- 1 ,由 535 nm处测定的吸光度计算 MDA的含
量。
1. 3. 3　线粒体膜流动性测定〔7〕　总体积为 3 m l的
反应体系中含线粒体蛋白 1. 0 g· L- 1 ,硫酸亚铁
0. 067 mmo l· L- 1 ,半胱氨酸 0. 167 mmo l· L- 1并
分别加入 Orid, Ade, Scul 160μmol· L- 1在 37℃
水浴中准确反应 30 min,荧光光度计在 λex = 362
nm , λex= 432 nm ,狭缝 10, 10条件下测定 IVV , IV H,
IHV , IHH荧光强度。
　　按 P= IVV - IV HIVV+ GIVH　　 G= IHVIHH计算荧光偏振度
P, P值越大 ,膜流动性越小。
1. 3. 4　线粒体肿胀测定　线粒体肿胀测定按
Hunter法〔8〕 ,即硫酸亚铁 0. 5 mmol· L- 1 ,抗坏血
酸 ( Vit C) 1. 0 mmol· L- 1 ,线粒体蛋白 0. 5 mg,总
体积 2. 0 ml,在 37℃孵育 0～ 5 min。 Orid, Ade 160
μmo l· L- 1及溶剂对照分别加入每管中 ,反应由加
入线粒体开始 ;在 721分光光度计 520 nm处测定
3, 5, 10, 15, 20, 25 min每管样品的吸光度。
1. 4　实验数据　以 x-± s表示 ,不同实验组间差异
用 t检验分析。
2　结果
2. 1　对线粒体脂质过氧化的抑制作用　 MDA是
脂质过氧化物的代谢产物 ,实验结果表明 Fe2+ -Cys
明显诱导线粒体 MDA产生 ,与对照组相比 P <
0. 01; Orid, Ade和 Scul以剂量依赖方式抑制线粒
体 MDA升高 (表 1) , Orid在 80及 160μmo l· L- 1
时对 MDA产生抑制率分别为 13. 67%和 18. 2% ;
Orid和 Scul在 80～ 160μmol· L- 1时的抑制率分
别为 10. 76% , 26. 8%和 7. 53% , 19. 35% , So lv ent
对 MDA含量无影响。
Tab 1　 Effect of Orid, Ade and Scul on the content
of MDA induced by Fe2+ -Cys. (x-± s , n= 4)
Drug
Dose
/μmol· L- 1
MDA content
/μmol· g- 1 Pro
Inhibi ti on
rate /%
Cont rol 　　　 - 　　 0. 462± 0. 001
Fe2+ -Cys 　　　 - 4. 769± 0. 103* *
Solvent 　　　 - 4. 615± 0. 359
Orid 　　　 40 4. 769± 0. 461 　　 0. 00
0rid 80 4. 103± 0. 410# 13. 97
Orid 160 3. 897± 0. 359# # 18. 28
Ade 40 5. 282± 0. 462 - 10. 76
Ade 80 4. 256± 0. 359# 10. 76
Ade 160 3. 487± 0. 103# # 26. 88
Scu l 40 4. 718± 0. 308 1. 07
Scu l 80 4. 410± 0. 103# # 7. 53
Scu l 160 3. 846± 0. 359# # 19. 35
　　* * P < 0. 01 vs con trol; # # P < 0. 01 vs Fe2+ -Cys
2. 2　对线粒体膜流动性的影响　膜流动性以荧光
偏振度 P表示 , P值越大 ,膜流动性越小 , Fe2+ -Cys
引起线粒体膜流动性明显下降 (与对照组比有明显
差异 ) ; Orid 160μmo l· L- 1明显抑制 Fe2+ -Cys诱
导的线粒体膜流动性下降 , ( P值分别为 0. 297±
0. 022, Fe
2+ -Cys组为 0. 423± 0. 014, Orid及 Scul
160μmo l· L- 1也可抑制 Fe2+ -Cys诱导的线粒体膜
流动性下降 , P值分别为 0. 390± 0. 009和 0. 382±
0. 013; Orid对抗膜流动性下降的作用最强 (表 2)。
Tab 2　Effect of Orid, Ade and Scul on the membrance
fluidify of mitochondria(x-± s , n= 4)
Drug
Dose
/μmol· L- 1
Floures cence anis
ot ropy (P )
Con t rol - 　　 0. 166± 0. 005
Fe2+ -Cys - 0. 423± 0. 014* *
Solven t - 0. 392± 0. 072
Orid 160 0. 297± 0. 022# #
Ade 160 0. 389± 0. 009# #
Scul 160 0. 382± 0. 013# #
　　* * P < 0. 01 vs Con t rol; # # P < 0. 01 vs Fe2+ -Cys
2. 3　对线粒体肿胀的影响　 Fe2+ -Vit C通过产生
自由基导致线粒体肿胀 ,浊度改变。 Ade 160μmol·
L
- 1可抑制 Fe2+ -Vit C引起的线粒体肿胀 , Orid 160
μmol· L- 1不能对抗 Fe2+ -Vit C所致的线粒体肿
胀 , So lv ent组对肿胀无影响 (表 3)。
3　讨论
线粒体既是能量代谢的主要场所 ,同时也会产
生自由基。它富含多不饱和脂肪酸 ( PU FA) ,有膜结
构 , PU FA易与自由基反应形成脂质过氧化物 ,生
成大量 MDA; PU FA减少使膜流动性下降 ,同时脂
质过氧化又可使膜通透性增加 ,从而引起线粒体肿
胀 ,影响线粒体功能。
本实验发现 Orid, Ade, Scul可以降低由
Fe
2+
-Cys引起的线粒体 MDA含量升高 ,并有量效
关系 ;由 Fe2+ -Cys诱导线粒体脂质过氧化后产生的
膜流动性降低 ,也可被以上 3种化合物对抗。有人认
为〔9〕 ,线粒体的肿胀是膜脂质过氧化所致 ,所以大多
数的抗氧化剂在对抗脂质过氧化的同时又抑制线粒
体肿胀的发生 ,我们的实验也表明 Ade具有以上作
用 ;而 Orid不具备此作用 ,但随时间延长 ,对线粒体
肿胀的抑制作用也在增强 ,可能是因为不同的反应
破坏了部分形成 MDA的脂质过氧化物〔8〕。
Orid及 Ade属对映-贝壳杉烯二萜类化合物 ,
Scul属贝壳杉烯二萜类化合物 ,从我们的实验看
出 ,它们均具有不同程度的抗氧化作用 ,此作用是通
过抑制脂质过氧化而产生的 。Orid , Ade及 Scul
·47·中国药理学通报　Chinese Pharmacological B ulletin　 1999 Feb; 15( 1)
Tab 3　 Eff ect of Orid , Ade and Scul on mitochondria swel ling (x-± s, n= 3)
Drug
Dose
/μmol· L- 1
OD value ( 520 nm)
0 min 3 min 5 min 10 min 15 min 20 min 25 min
Contro l - 　 0. 472± 0. 023 　0. 442± 0. 014 　 0. 442±0. 014 　 0. 428± 0. 020 　0. 432± 0. 032 　 0. 435± 0. 025 　 0. 435± 0. 021
Fe2+ -VC - 0. 373± 0. 005* 0. 387± 0. 007* * 0. 383±0. 010* 0. 383± 0. 010* * 0. 388± 0. 007* 0. 387± 0. 007* 0. 383± 0. 013*
Solvent - 0. 393± 0. 019 0. 400± 0. 023 0. 403±0. 028 0. 408± 0. 021 0. 410± 0. 033 0. 407± 0. 037 0. 412± 0. 021
Orid 160 0. 372± 0. 053 0. 390± 0. 043 0. 387±0. 063 0. 382± 0. 027 0. 385± 0. 069 0. 388± 0. 070 0. 405± 0. 041
Ade 160 0. 407± 0. 008 0. 408± 0. 023 0. 425±0. 022# # 0. 435± 0. 025# # 0. 437± 0. 020# # 0. 430± 0. 023# # 0. 432± 0. 021# #
　　* P < 0. 05* * P < 0. 01 vs Cont rol; # # P < 0. 01 vs Fe2+ -VC
对氧自由基 ( O·2 ) ,羟自由基 (· OH)及抗氧化酶
GSH-Px , SOD是否有影响 ,以及它们的抗氧化作
用机制何在 ,尚待进一步研究。
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Protective ef fect of diterpenoid compounds on liver
mitochondria injury induced by free radicals
ZHANG Yu, W ANG Jun, XU Xia, GE Shi-Wen, ZHANG Tan-Mu
(Dept of Pharmacology , Henan Inst itute of Medical Sciences , Zhengzhou　 450052)
ABSTRACT　 AIM　 To study the protectiv e effect
o f di terpenoid compounds on the mitochondria in-
jury induced by free radical. METHODS　 TBA
method was used to measure the content of MDA
spect rometric method to measure the turbidity of
mi tochondria suspension. fluo rescence anisot ropy
assay were used to measure the mitochondrial
membrane f luidi ty. RESULTS　 Oridonin ( Orid ) ,
adenanthin ( Ade) and sculponea tin ( Scul ) 40, 80
and 160μmo l· L- 1 inhibited MDA forma tion of
liv er mi to chondria in a concentration-dependent
manner. Orid, Ade and Scul 160μmol· L- 1 inhib-
i ted the increase of P value ( 0. 297± 0. 022, 0. 389
± 0. 009 and 0. 382± 0. 013 vs 0. 423± 0. 014 in fer-
rous-cysteine g roup) Ade 160μmol· L- 1 prevent-
ed the decrease of th e abso rbane induced by fer-
rous-asco rbic acid in liv er mitochondria. CON-
CLUSTON　 Orid, Ade and Scul all have antiox-
idativ e effect through diminishing mitochondria
lipid pero xida tion induced by free radicals.
KEY WORDS　 di terpenoid compounds; mi tochon-
dria; lipid perox ida tion; antio xida tive ef fect
·48· 中国药理学通报　Chinese Pharmacological B ulletin　 1999 Feb; 15( 1)