全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY　BULLETIN 2010年第 2期
生物技术在忍冬属植物研究中的应用
韩琳娜 张永清
(山东中医药大学药学院 ,济南 250355)
　　摘　要:　对近年来生物技术在忍冬属植物快速繁殖 、种质资源鉴定和药用活性有效成分生产方面的研究进展进行了综
述 , 包括忍冬属植物的组织培养 、染色体核型分析 、生物化学和分子生物学的研究。
关键词:　忍冬属 生物技术 研究进展
ResearchProgressinPracticalMedicinal
PlantBiotechnologyofLoniceraLinn.
HanLinna ZhangYongqing
(ColegeofPharmacy, ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine, Jinan250355)
　　Abstract:　Thepaperpresentedtheresearchprogressinrapidpropagation, germplasmidentificationandtheproductionofactive
pharmaceuticalingredientsofthegenusLoniceraLinn..Tissueculture, chromosomekaryotypeanalysis, biochemistryandmolecularbiol-
ogyresearchedreviewed.
Keywords:　LoniceraLinn. Biotechnology Researchprogress
收稿日期:2009-10-21
基金项目:国家科技支撑计划(2006BAI06A12-08),山东省农业良种工程 “大宗道地中药材种质资源收集 、保存与整理 ”重大课题(2008LZ013-
02)
作者简介:韩琳娜 ,女 ,讲师 ,硕士 ,主要承担生物化学 、细胞生物学的教学科研工作;E-mail:linnahan@ 163.com
通讯作者:张永清 ,教授 , E-mail:zyq622003@ 126.com
忍冬科忍冬属(LoniceraL.)植物约有 200种 ,
分布于北半球温带和亚热带地区 ,我国有 100余种 。
该属有多种植物具有重要的药用价值 ,如忍冬 、灰毡
毛忍冬 、淡红忍冬 、菰腺忍冬 、金银忍冬 、大花忍冬 、
皱叶忍冬 、细毡毛忍冬和盘叶忍冬等。其中忍冬的
根 、茎 、叶 、花 、果实均可药用 ,其干燥花蕾与茎枝分
别称为金银花 、忍冬藤 ,属于常用中药材 ,具有清热 、
解毒 、抗菌等功效[ 1] 。除药用外 ,忍冬属植物还在
绿化观赏 、营养保健 、日用化工 、保持水土及畜牧兽
医等领域具有重要的经济价值[ 2, 3] 。组织培养 、染
色体核型分析 、生物化学和分子生物学等现代生物
技术 ,在植物品质改良 、资源保护和种质鉴定等领域
发挥着越来越重要的作用 ,有着广阔的应用前景 。
就生物技术在忍冬属植物研究中的应用概况进行归
纳与总结 ,旨在为促进忍冬属植物资源的综合开发
利用和深化相关研究提供参考 。
1　组织培养
李利改等 [ 4] 率先以忍冬幼嫩叶片作为外植体
开展了组织培养方面的研究 ,先诱导出愈伤组织 ,然
后再分化出芽和根 ,获得了再生植株。此后 ,相关研
究报道较少。 2000年后 ,关于忍冬属植物组织培养
方面的研究报道日多 ,但多数工作集中在利用茎尖 、
茎段 、芽及叶片进行离体培养及愈伤组织诱导 ,目的
是实现植株的快速繁殖。杨培君[ 5] 、向增旭 [ 6]等分
别建立了添加 2.0 mg/L6-BA, 0.2-0.5 mg/LKT
和 0.5-1.0 mg/LIAA的 B5为培养基的山东蒙花
品系的组培快繁体系 ,仇键等[ 7]针对蒙花 1、2号建
立了以 MS为基本培养基 、添加 1.0 -2.0 mg/L6-
BA和 0.05-0.2 mg/LNAA的诱导快繁体系。凤
爪金银花是沂蒙山区另一忍冬优良品种 ,王光全
等[ 8]对其组培条件进行了摸索 ,制定了适宜的组培
快繁技术 。据报道 ,众多研究者先后建立和优化了
2010年第 2期 韩琳娜等:生物技术在忍冬属植物研究中的应用
红河金银花 、红金银花 、北京忍冬 、邹叶忍冬 、蓝靛果
忍冬等的组培与快繁体系 ,涉及的内容主要是外植
体的消毒灭菌 、愈伤诱导 、丛生芽诱导 、继代增殖 、生
根和移栽体系的建立 ,大多有着较高的诱导率和移
栽成活率。另外 ,曹方莉等 [ 9]还以当年生银翠蕾嫩
枝茎段为外植体 ,进行愈伤组织和不定芽培养 ,对获
得的不定芽采用秋水仙素浸泡法和培养基中添加秋
水仙素法诱导出了多倍体 ,并进行了染色体鉴定 。
结果表明 ,秋水仙素浓度对多倍体诱导率有显著影
响 ,为金银花同源四倍体的诱导与鉴定提供了依据 。
国外学者也在对忍冬组织培养研究进行了不同
的尝试 。Palacios等 [ 10]对桃色忍冬茎段外植体经由
器官发生途径的再生进行了报道 ,在添加 4%蔗糖
和 0.8%Difcobacto琼脂的 B5培养基上 ,进行了以
茎段作为外植体的再生。通过在芽分化诱导培养基
中添加 0.5 mg/L的 GA3,比较了不同发育时间的外
植体对根诱导和伸长的影响 ,发现最佳根诱导与伸
长培养基为 1 /2WPM+2 μMM3-吲哚丁酸 +0.6%
keylis琼脂 。Kim等 [ 11]建立了金银花合子胚培养中
的体细胞胚胎发生和植物再生高频体系 ,证明在添
加 4.52μM2, 4-D的 MS培养基中 ,成熟的合子胚
以 46.7%的频率形成了胚性愈伤 ,以此种液态培养
基建立了胚性愈伤的细胞悬浮培养体系 ,接种到含
有 MS基本培养基的平板培养皿后 ,胚性细胞悬浮
物形成了大量的体细胞胚 ,继而以 68%的频率发育
形成小植株 ,并移栽于温室 。部分学者对忍冬悬浮
细胞培养过程中的次生代谢物变化及其生物转化途
径进行了探索性研究 。如 Horike等 [ 12]在金银花细
胞悬浮培养中获得了 6种姜黄二酮类物质 ,即(2S)-
2-羟基姜黄二酮 、(2R)-2-羟基姜黄二酮 、(8S)-6-羟
基姜黄二酮 、(2R, 8S)-8-羟基-2-羟基姜黄二酮 、
(1S, 10S)-l, 10-环氧姜黄二酮和(1R, 10R)-l, l0-环
氧姜黄二酮。 Yamamoto等 [ 13] 认为 ,金银花细胞悬
浮培养不会产生环烯醚和裂环烯醚苷 ,但其细胞能
利用 7-脱氧马钱素 7-羟化酶将 7-脱氧马钱素转化
成马钱素和环烯醚萜甙裂环马钱素 ,也能利用开链
马钱素合成酶将马钱素或 7-脱氧马钱素转化成开
链马钱素[ 14, 15] ,而不能将香叶醇转化成环烯醚苷和
环烯醚萜甙裂环马钱素。 Yamamoto[ 16]通过酶活性
抑制试验证明 ,上述转化过程均是由细胞色素 P450
介导的。
2　染色体核型分析
郭振怀等 [ 17]采用去壁 、低渗 、火焰干燥法 , 对
金银花茎尖细胞染色体核型进行了观察研究 , 发
现金银花染色体核型为 3A型 ,核型对称性明显 ,
表明金银花在系统演化上有较强的原始性。王飞
等 [ 18]采用常规制片法结合显微摄影技术 ,观察分
析了忍冬属两种药用植物金银花和金银忍冬的染
色体数目 、核型及体积 ,结果显示金银花和金银忍
冬都具有相同的染色体数目 2n=18 ,并且核型分
类都属于 2A型 ,核型公式近相似 ,反映了此属两
种植物密切的亲缘关系;金银花和金银忍冬染色
体核型公式和相对长度组成的不同反映了两者间
的差异 ,为两种药用植物的鉴定及良种选育提供
了依据 。郑丽等 [ 19]通过灰毡毛忍冬和红白忍冬[ 20]
的染色体数目和核型研究 ,并与原种金银花核型进
行比较 ,发现灰毡毛忍冬和红白忍冬体细胞染色体
数目均为 2n=18,核型不对称系数(AS.K%)分别
为 73.71%和 70.23%, 属于 3B型。根据 Levitzky
和 Stebbins的基本观点 ,在被子植物中 ,核型进化的
基本趋势是由对称向不对称发展 ,说明灰毡毛忍冬
和红白忍冬是衍生进化而来的变种 ,这与中国植物
志所述相符合 ,为用染色体分析结果进行忍冬属植
物分类及鉴定提供了依据。
3　生物化学技术
同工酶是指细胞中分子结构 、理化性质不同 ,但
催化相同反应的酶。同工酶是基因编码的产物 ,其
酶谱差异主要是由决定酶蛋白本身的等位基因或非
等位基因的差异造成的 。同工酶电泳图谱谱带发生
多态性变化 ,反映了生物在蛋白质水平上的多型性 ,
是生物发生遗传分化的证据 [ 21] 。因此 ,利用它可以
鉴别生物诸多遗传变异 。在植物系统发育与进化研
究中 ,常用于估计种间 、种内分化程度 ,估计种内居
群间 、居群内基因频率的变化 ,分析种内亲缘关系
等[ 22] 。过氧化物酶(POD)同工酶是一组能够利用
H2O2氧化供氢体(底物)的酶 ,在高等植物中存在较
多 ,这些同工酶可以直接表达基因 ,并且是植物体内
对生长期 、生长环境 、品种遗传特性比较敏感的一种
酶系 。石俊英等[ 23]采用 POD分析结合 RAPD标
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生物技术通报 Biotechnology　Buletin 2010年第 2期
记 ,对忍冬大毛花忍冬与鸡爪花农家品种进行了分
析 ,其 POD的谱带数目分别为 5条和 2条 ,显示忍
冬两品系的过氧化物同工酶谱带数目和基团均有所
差异。赵永亮等[ 24]采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板
电泳技术 ,利用 POD同工酶和淀粉酶(AS)同工酶
对 10个地区 11个金银花样品的遗传多样性进行了
分析 ,以探讨不同产区金银花的亲缘关系 。结果表
明 ,不同产区金银花的过氧化物酶和淀粉酶具有较
丰富的多态性 ,说明金银花不同居群在遗传本质上
是有区别的 ,提示该物种正处于分化阶段 。特别是
产自河南荥阳的 1、2号样品和产自四川的 3号样品
在两种同工酶谱中的表现有较大差异 ,认为不同产
区金银花亲缘关系与其遗传本质和地理位置有关。
4　分子生物学技术
DNA分子作为遗传信息的直接载体 ,不受外界
因素和生物体发育阶段及器官差异的影响 ,每一个
个体的任一细胞均含有相同的遗传信息 ,因此 ,采用
DNA分子遗传标记(DNAmoleculargeneticmarker)
进行物种鉴别更为准确可靠。金银花作为传统中药
材 ,具有明显的道地性 ,药材质量与产地密切相关 ,
但通过显微鉴别和化学成分分析很难认定其道地产
区 。利用分子标记技术可在基因水平上了解天然产
物多样性与物种 、生态地理分布之间的关系 ,检测物
种遗传多样性 ,探讨物种的亲缘关系和进化趋势 。
与传统植物形态学 、组织学和化学检测相比 ,它可在
DNA水平上鉴别生物种 、亚种 、变种甚至变异株 。
因此 ,能更充分 、更确地表达其变异类型的遗传标
记 ,提供了一种灵敏 、准确 、科学的种质鉴别方法 。
常用的分子标记方法有 RAPD、RFLP、AFLP、SSR、
ISSR等。
目前 ,从分子水平上对忍冬属植物进行研究 ,国
内报道集中于 RAPD分析。盛红梅等 [ 25]应用 RAPD
标记技术 ,从分子水平上分析了甘肃省境内的 23种
忍冬属植物的遗传多样性及其种间关系 ,结果表明 ,
甘肃省忍冬属植物资源的遗传多样性较为丰富 , 23
种忍冬明显聚为两大类 ,其下又有较多分支 ,其种间
关系与传统形态学分类结果基本一致 ,但也有个别
种的归属及种间关系稍有变化。向增旭等 [ 26]利用
RAPD分析技术 ,对金银花 6个种源的遗传多样性
及遗传关系进行了研究 ,发现金银花 6个种源可聚
为 2大类 ,产自山东平邑 、湖南隆回和江苏南京的野
生金银花种源遗传距离较近 ,聚为一类;来自河南封
丘的 2个野生种源和来自河南密县的 1个栽培种源
聚为一类 。不同金银花种源问的遗传关系与地理分
布有一定的相关性 。杨飞等[ 27]运用 RAPD技术 ,对
5个金银花品系进行遗传多样性研究 ,并构建了这 5
个金银花品系的 DNA指纹图谱 。结果显示 ,此金银
花 5个品系聚为两类 ,与其形态学分类结果相符。
霍军伟等 [ 28]基于 RAPD技术 ,研究分析了中国北方
野生蓝金银花的种群遗传多样性 ,将 6个种群的 60
种植物用优化的 SDS过程进行 DNA提取。在 PCR
扩增中 , 27个操纵子随机引物被选择。总共 186个
位点被检测 ,其中 121个位点具有多态性 ,占到了总
位点数的 65.05%。每个种群有意义多态性位点的
比率是 38.89%。在整个遗传变异中 ,一些变异是
在种群内 ,种群之间的关系是紧密的。 RAPD分析
结果显示 , 6个种群可被聚为 3个组。于燕莉等[ 23]
采用 RAPD标记方法 ,对金银花两大品系大毛花和
鸡爪花的 DNA指纹图谱进行了分析 ,试图从 DNA
分子水平上为两品系的鉴别提供依据 ,结果两品系
的 DNA指纹图谱和 POD指纹图谱具有明显差异 ,
表明 RAPD技术能有效地用于金银花品种的分类与
鉴别 。
简单序列重复间扩增多态性(ISSR)是一种基
于微卫星序列的新型分子标记技术 ,结合了 SSR和
RAPD的优点。王晓明等 [ 29]通过建立金银花 ISSR-
PCR体系 ,对来自湖南 、山东 、河南的 22个金银花品
种进行标记 ,扩增出多态性条带 96条 ,为金银花品
种间遗传多样性分析提供了技术和理论支撑 。李萍
等[ 30]用 SDS法提取忍冬不同居群 、外类群细毡毛忍
冬和山银花的总 DNA,进行 5SrRNA基因间区的
PCR扩增和测序 ,并用软件 Mega进行分析 ,发现忍
冬属植物 5SrRNA基因间区约 210 bp,其中 G+C
含量较高 ,达 70%左右 ,不同居群的忍冬碱基序列
有差别 ,通过测序可以进行鉴别 。山银花与忍冬间
的遗传距离较大。从而得出 ,忍冬属种间 5SrRNA
基因间区的序列差异大于种内;道地药材之间的遗
传距离较小;道地与非道地药材之间的遗传距离大
于道地药材之间的遗传距离 。朱颖等[ 31]以败酱草
科的 Centranthurubber为外类群 ,对忍冬科 12个属
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2010年第 2期 韩琳娜等:生物技术在忍冬属植物研究中的应用
12个代表种的 ITS区序列进行了系统发育分析 ,将
12个属划分成 2个族 , 3个姐妹群 ,并利用序列分析
划分亲缘关系距离。道地金银花转录间隔区的突
变位点可以通过限制性内切酶 EcoNI被检测 。由
于道地性金银花的 PCR产物不能被彻底消化 ,王
冲之等 [ 32]使用 PCR-RFLP分析鉴定不同地域起源
的金银花 ,结果被 EcoNI切割的 PCR产物在所有
道地性金银花中 70%以上被检测出来 ,非道地性
金银花和来自金银花属的其它种只有少于 20%的
被检测出来 ,这个比率与金银花的地理起源有很
大的相关性 ,因此 ,可用于金银花道地性的区分。
国外学者在分子水平的研究则侧重于对有效成分
合成关键代谢途径的探索 。 Jiang等 [ 33] 为了探究
茉莉酸的生物合成途径 ,从忍冬中克隆了丙二烯氧
化合成酶(AOS)—茉莉酸生物合成催化第一个定向
步骤的酶的基因 ,命名为 LjAOS,与其他 AOS是同
源的 ,并通过定量 PCR分析 LjAOSmRNA在不同组
织中的表达 ,结果表明在绿原酸含量最高的花蕾中
LjAOS有大量积累 。
5　总结
综上所述 ,生物技术在忍冬属植物研究中的应
用起步较晚 ,国内主要用于快速繁殖 、种质区分和药
材道地性区分 ,国外则倾向于更有效的获得其药用
活性成分。在组培快繁方面 ,虽然已经建立了多个
品种的快繁体系 ,但大多停留在试验阶段 ,距大规模
工厂化生产尚有一定距离 。在花药 、花粉 、原生质体
培养和通过毛状根 、细胞培养获得活性成分等领域 ,
许多关键技术尚有待突破 。生化标记技术正日益被
分子标记所取代 ,其应用研究也就仅仅体现在个别
品种单一同工酶测试分析方面。目前 ,各种分子标
记技术的兴起 ,为忍冬属植物种质鉴定和亲缘划分
开辟了广阔道路 ,如能将分子生物学技术更广泛地
应用于道地性研究 、次生代谢关键酶基因的克隆及
表达等方面 ,对于有效控制中药材质量 、实现活性成
分的工业化生产 ,将发挥出巨大的推动作用。
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